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固定化酵母细胞生产乙醇试验报告
本试验旨在研究固定化酵母细胞生产乙醇的能力。
首先，采用分子生物学技术建立的固定化酵母细胞，并放入含有目标表达蛋白（乙醇脱氢酶）的受体体系，培养在适宜的培养基中；其次，添加有机底物和生长调节剂，提高酵母细胞乙醇合成效率；最后，在培养基不同时间段进行调控，观察乙醇液位高度，测量乙醇密度，确定乙醇比重指数及分子量。
试验结果表明，固定化酵母细胞在此培养条件下能够有效合成乙醇，乙醇的比重指数和分子量也有所提高，但乙醇的曲线变化显示出较弱的合成趋势，需要进一步调整培养参数，以提高乙醇的产率。
酵母细胞的固定化及其酒精发酵试验一、实验目的1.掌握微生物细胞的固定化方法；2.学习用固定化酵母进行酒精发酵；3.进一步理解淀粉质原料酒精发酵的原理和一般工艺过程。
二、实验原理（一）酵母菌酒精发酵在无氧条件下，酵母菌利用葡萄糖或淀粉水解糖发酵产生乙醇和CO2的作用，称为酒精发酵，总反应式为：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。
本实验采用固定化酵母发酵，通过测定发酵过程中的酵母细胞数、生成的CO2量以及最终产物酒精的量，可以判断固定化酵母的发酵能力。
（二）细胞固定化技术固定化细胞就是被限制自由的细胞。
即采用物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。
微生物细胞的固定化方法有：（1）吸附法，（2）包埋法，（3）不用载体法。
本实验采用凝胶包埋的固定化方法，把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。
三、实验器材（一）淀粉的液化与糖化（双酶法）1. 酵母菌细胞：酒精活性干酵母。
2. 2.5%海藻酸钠溶液40mL，2 % CaCl2溶液100mL。
3.培养基：①增殖培养基：浓度为130BX麦芽汁，以6N硫酸调节pH值至4.1~4.5。
（每组100mL 装于250mL三角瓶，1kg/cm2，灭菌30min后备用）②发酵培养基：淀粉水解液，具体制备见实验步骤。
4. 培养箱、显微镜、蒸馏装置及其他常规实验仪器四、实验方法①调浆:以1﹕3~3.5的比例，将玉米粉（或玉米淀粉）用60℃左右的温水调成粉浆500mL;②液化：加α-淀粉酶（用量约为10u/g淀粉）；加热至85~90℃，保持30~60 min，加热煮沸10 min，补充水分。
③糖化：将上述液化醪冷至60~62℃，加入糖化酶，用量为80~100u/g淀粉，维持30 min后分装于500mL三角瓶，每瓶装糖化醪250mL。
酵母固定化实验报告
酵母固定化是将酵母细胞固定在一定载体上的过程。
这种方法可以使酵母在酶反应中重复使用，提高产量和效率。
在本次实验中，我们使用凝胶微珠作为载体，通过将酵母细胞培养在微珠表面上，使其固定化。
本实验的目的是探究酵母固定化对酵母细胞生长和代谢的影响。
首先，我们准备了酵母固定化实验所需的材料。
包括酵母细胞悬浮液、凝胶微珠、培养基和培养设备等。
接下来，我们按照实验流程进行操作。
首先，我们将凝胶微珠浸泡在无菌水中，以去除可能存在的污染物。
然后，将凝胶微珠放入培养基中，在摇床上以适当的速度和时间进行搅拌，使酵母细胞均匀地附着在微珠表面上。
接下来，我们将固定化的酵母细胞收集并洗涤，以去除未附着的细胞，并将其转移到新的培养基中。
然后，我们在恒温恒氧条件下进行培养，并定期观察酵母细胞的生长情况。
在实验过程中，我们对比了未固定化的酵母细胞和固定化的酵母细胞的生长速率和代谢活性。
结果显示，固定化的酵母细胞在培养基中生长得更快，并且具有更高的酶活性。
这表明固定化技术可以提高酵母细胞的代谢效率。
此外，我们还测试了固定化酵母细胞的稳定性。
结果显示，固定化酵母细胞在多
次重复使用后仍能保持较高的活性，而未固定化的酵母细胞的活性逐渐下降。
这进一步证实了固定化技术的可行性和有效性。
综上所述，酵母固定化技术可以提高酵母细胞的生长速率和代谢活性，增加产量和效率。
此外，固定化的酵母细胞还具有较好的稳定性，可以重复使用。
因此，酵母固定化技术具有广阔的应用前景，在工业生产和科研领域有着重要的意义。
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵吴英玲 10197020 10生物创新班摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。
将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 ℃下保存。
用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。
并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。
采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。
关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentationability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。
实验一酵母细胞的固定化一、实验原理与目的原理：固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或者细胞固定在一定空间的技术，包括包埋法，化学结合法（将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上）和物理吸附法固定化，细胞多采用包埋法固定化。
常用的包埋载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维和聚丙烯酰胺等。
本实验选用海藻酸钠作为载体包埋酵母菌细胞。
目的：了解细胞固定化的原理；掌握酵母细胞固定化实验操作。
二、仪器与用具仪器：50ml烧杯、200ml烧杯、玻璃棒、量筒、酒精灯、石棉网、针筒、三角瓶、水浴锅、恒温箱。
化学材料：活化酵母菌（酵母悬液）、蒸馏水、无水CaCl2、海藻酸钠、葡萄糖。
三、试剂配制1、0.05mol/L的CaCl2溶液150ml；2、海藻酸钠溶液：每0.7g海藻酸钠加入10ml水加热溶液成糊状；3、10%葡萄糖溶液150ml。
四、实验方法与步骤1、干酵母活化：1g干酵母+10ml蒸馏水→50ml烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
2、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已经活化的酵母细胞，用玻璃棒充分搅拌混合均匀。
3、固定化酵母细胞：用20ml注射器吸取海藻酸钠与酵母细胞混合液，在恒定的高度（建议距液面12~15cm处，过低凝胶珠形状不规则，过高液体容易飞溅），缓慢将混合液滴加到CaCl2中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。
将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。
4、固定化酵母细胞发酵：用5ml移液器吸取蒸馏水冲洗固定好的凝胶珠2~3次，然后加入装有150ml10%葡萄糖溶液的三角瓶中，置于25℃发酵24h，观察结果。
实验开始时，凝胶球是沉在烧杯底部，24h后，凝胶球浮在溶液悬浮在上层，而且可以观察到凝胶球并不断产生气泡，说明固定化的酵母细胞正在利用溶液中的葡萄糖产生酒精和二氧化碳，结果凝胶球内包含的二氧化碳气泡使凝胶球悬浮于溶液上层。
五、结果观察：打开瓶盖，闻气味，观察葡萄糖液中的变化。
实验一固定化酵母酒精发酵
一、实验目的
掌握制备固定化细胞中最基本、最常用的方法。
掌握固定化酵母酒精发酵工艺。
掌握酒精的提取及测定方法。
二、实验原理
固定化酶和固定微生物细胞的原理是将酶或微生物细胞利用物理的或化学的方法，使酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。
它在固相状态作用于底物，具有离子交换树脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或装柱形式与底物溶液接触。
由于酶和微生物细胞被固定在载体上，使得它们在反应结束后，可反复使用，也可贮存较长时间使酶和微生物活性不变。
一般胞内酶、提纯酶在固定化中或固定化后常不稳定，而固定化微生物不仅可避免复杂的酶提取和纯化过程，同时解决了酶的不稳定性问题。
细胞固定化后，酶活较高，操作稳定性较好，可在多步酶促反应中应用并便于连续化、自动化操作。
若代谢底物及产物均为低分子物质时使用固定化微生物细胞效果更佳。
微生物细胞固定化常用载体有：1、多糖类（纤维素、琼脂、葡聚糖凝胶、藻酸钙、K一角叉胶、DEAE-纤维素等）；2、蛋白质（骨胶原、明胶等）；
3、无机载体（氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶等）；
4、合成载体（聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂等）。
选择载体原则以价廉、无毒、强度高为好。
微生物细胞固定化常用的方法有三大类：1．吸附法
吸附法是将细胞直接吸附于惰性载体上，分物理吸附法与离子结合法。
（1）物理吸附法是利用硅藻土、多孔砖、木屑等作为载体，将微生物细胞吸附住。
（2）离子结合法是利用微生物细胞表面的静电荷在适当条件下可以和离子交换树脂进行离子结合和吸附制成固定化细胞。
吸附法优点是：操作简便、载体可再生；缺点是：细胞与载体的结合力弱、pH、离子强度等外界条件的变化都可以造成细胞的解吸而从载体上脱落。
2．包埋法
是将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不至漏出而废物和产物可以进入和渗出。
细胞和载体不起任何结合反应．细胞处于最佳生理状态。
因此，酶的稳定性高，活力持久，所以目前对于微生物细胞的固定化大多采用包埋法。
本次实验作为重点训练。
3．共价交联法
是利用双功能或多功能交联剂，使载体和酶或微生物细胞相互交联起来，成为固定化酶或固定化细胞。
常用的最有效的交联剂是戊二醛。
这是一种双功能的交联剂，在它的分子中，一个功能团与载体交联，另一个功能团与酶或细胞交联。
此法最为突出的优点是：固定化酶或细胞稳定性好，共价交联剂和载体都很丰富。
然而到目前为止，尚无一种可用于所有种类的微生物细胞固定化的通用方法，因此，对某一待定的微生物细胞来说。
必须选择其合适的固定化方法和条件。
三、实验材料
1、菌种：酿酒酵母。
2、培养基
（1）种子培养基YEPD
酵母粉 10g 葡萄糖 20g
蛋白胨 20g 自来水 1000ml
pH 5.5
分装100ml培养基于300ml锥形瓶中，经0.1MPa灭菌20min。
（2）酒精发酵培养基
酵母粉 10g 葡萄糖 80g
蛋白胨 10g 自来水 1000ml
调pH4.7，115℃灭菌20min备用。
3、主要药品
玉米粉、耐高温a－淀粉酶、糖化酶、硫酸、pH试纸、海藻酸钠、葡萄
等。
糖、蛋白胨、酵母粉、生理盐水、CaCl
2
碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL，在棕色瓶中保存。
4、器皿及仪器
恒温水浴锅、培养箱、粉碎机、电炉、高压灭菌锅、显微镜、糖度计、量筒、纱布、500ml三角瓶、100ml烧杯、500ml烧杯、1000ml烧杯、培养皿、无菌10ml注射器外套及5＃静脉针头、移液管、玻璃棒、冷凝管等。
四、实验步骤
（一）酒精发酵培养基的配制
配酒精发酵培养基，分装300ml入500ml三角瓶，115℃灭菌20min备用。
（二）包埋法固定化酵母细胞
1、酵母种子液的制备
挑取新鲜斜面菌种几环，接入装有100mlYEPD培养基的锥形瓶中，30℃振荡培养，培养30h。
2、海藻酸钠凝胶固定化酵母细胞的制备
海藻酸钠凝胶是从海藻中提取获得的藻酸盐，为D—甘露糖醛酸和古洛
糖醛酸的线性共聚物，多价阳离子如Ca2＋、Al3＋可诱导凝胶形成。
将微生物
细胞与海藻酸钠溶液混匀后，通过注射器针头或相似的滴注器将上述混合液
溶液中，Ca2＋从外部扩散进入海藻酸钠与细胞混合液珠内，使藻滴入CaCl
2
酸钠转变为水不溶的藻酸钙凝胶，由此将微生物细胞包埋在其中。
在此法的
使用中，应尽量避免培养基中含有钙螯合剂（如磷酸根），因为它可导致钙
的溶解和释放，并由此引起凝胶的破坏。
称取0.8g海藻酸钠于100ml烧杯中，加去离子水少许，调成糊状，再加
入其余的水（总量为20ml）。
火上加温至熔化，0.1MPa灭菌20min，冷却至
45℃左右，加入4ml酵母培养液，混合均匀，倒入一个无菌的小塑料瓶中或
注射器外套并与5＃静脉针头相连，通过1.5～2.0mm的小孔，以恒定的速度
滴到100ml无菌烧杯中，杯中预先盛有50ml含10％葡萄糖的已灭菌的10％
CaCl
（胶诱导剂）溶液，使形成凝胶珠。
浸泡30min后，将凝胶珠转入无菌2
烧杯中，用无菌去离子水洗涤三次，然后接种入300ml酒精发酵培养基中，
置25℃下发酵7天，测定酒精含量。
另外，再取10ml未经固定化的酵母种
子液投入到装有300ml酒精发酵培养基中作为对照，同样条件下发酵7天后
测酒精含量。
（三）酒精发酵液的蒸馏及酒精度的测定
取100ml发酵液，倒入500ml圆底烧瓶中，加100ml蒸馏水蒸馏，当开
始流出液体时，用100ml量筒接收馏出液100ml，并用酒精比重计测量其酒
精度。
剩余的发酵液全部倒出后弃去，将固定化细胞用无菌去离子水洗3次，
加入发酵培养基继续培养，可反复使用数十次。
五、实验报告内容
1、记录双酶法糖化工艺步骤。
2、记录用海藻酸钠凝胶包埋酵母细胞的过程。
3、比较实验中固定化与游离的酵母细胞产酒精量有何差别？
六、思考题
1、淀粉质原料双酶法糖化工艺的应用在发酵工业上有何意义？
2、微生物细胞固定化在发酵工业上有何意义？。
