单克隆抗体药物的临床前研发

来源于细菌、酵母、 昆虫、植物和哺乳动 物细胞等各种表达体 系
背景知识
临床试验
药动评价
药效筛选 单克隆抗体的制备 靶点的发现与选择
研发流程
靶点的发现和选择
集中在细胞死亡通路、血管生成、细胞周期调控信号转导等方面 例如： CD20 :表达于B细胞和成熟B细胞，调节B细胞增殖、分化；在 95%以上的B细胞性淋巴瘤中表达 抗CD20单抗可用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤 单抗药物工作机理： 抗体依赖性细胞介导的毒作用( antibody dependent cellmediated cytotoxicity, ADCC) 补体依赖性细胞毒作用( complement dependent cytotoxicity, CDC) 中和细胞因子
抵御癌症
热门靶点：免疫检查点 （Immune Checkpoint）如 PD-1、PD-L1、CTLA-4、
Tim3、LAG-3、VISTA等
谢谢！
THANKS FOR ATTENTION.
2015-11-18
Avastin 25.7 101.1 -1.386 -1.8 0.04107 75.4
Pharmacokinetics, PK
主要评估血清中药物水平， 不被肾脏清除，半衰期长； 单抗的主要代谢结果是降 解为肽段和氨基酸，无需 进行生物转化研究 评估免疫原性， 是否产生ADA
药动评价
Anti-drug antibodies, ADA
A v a s tin
100
600
% c e ll p ro life ra tio n ra te
####
500 400 300 200
% c e ll v ia b ility
80 60 40 20 0
100 0 10
-2
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
c o n c . ,μ g / m l
Neutralizing Anti-drug antibody, NAb
评估ADA是否 会影响药效 cell-based non-cell-based
包被抗 原
• 优化包被液种类 • 优化抗原浓度
• N.A. • 优化封闭液种类及浓度 • 优化一抗梯度稀释的跨度、倍数 • 优化孵育时间、温度 • 优化二抗工作浓度 • 优化孵育时间、温度 • 加TMB后避光孵育显色，10-30 min后适 时终止
100
R itu x a n m e d ia te d C D C o n D a u d i
120
80 70 60 50 40 30 20 10 0
% T a rg e t C e ll L y s is
% T a rg e t C e ll L y s is
90
100 80 60 40 20 0 10 -2 0
-1
10
0
10
1
10
2
μ g /m l
%
%
0
0
2
NHS Conc.
1
5
%
Rituxan log(agonist) vs. response -- Variable slope (four parameters) Best-fit values Bottom 6.625 Top 100.1 LogEC50 -0.5091 HillSlope 3.069 EC50, μg/ml 0.3096
4℃孵育 过夜
封闭
孵育一 抗
孵育二 抗
显色及 终止
• 间接法ELISA建立流程
优化案例
使用标准品建立实验时，假设二抗工作浓度已经确定，不同抗原浓度与一抗浓 度正交实验
前 沿 进 展
Keytruda——FDA批准的第一个程序性死亡受体-1（PD-1)单抗 MSD旗下明星药物，旨在 利用人体自身的免疫系统
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
V E G F ,n g /m l
VEGF
Best-fit values Bottom Top LogEC50 HillSlope EC50,ng/ml Span
117.7 526.2 0.6934 1.875 4.936 408.6
Bottom Top LogEC50 HillSlope EC50,ng/ml Span
经典靶点
单克隆抗体的制备
抗体的人源化
嵌合抗体：应用DNA 重组技 术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗 体基因的恒定区重组, 再将重组后的 基因导入骨髓瘤细胞中表达 CDR 移植抗体（改型抗体）：进 一步用人的编码构架区( FR) 替代鼠FR, 形成更为完全的人源化抗体, 即除了3 个CDR 是鼠源的外, 其余全部是人源结 构 完全人源化抗体：1、噬菌体抗体 库技术；2、转基因小鼠技术
HillSlope
EC50,μg/ml
1.118
0.002854
Ab Concentration, [g/ml]
CDC--CTG
# # # m e d ia te d C D C L y s is o n U 9 3 7
药 效 筛 选
_ N H S C o n c . o p tim iz a tio n
单克隆抗体药物的临床前研发
Leabharlann Baidu
大分子药物——生物制药
始于1982年用重组DNA技术进行生物合成的人胰岛素(rHI)
举例
激素 (胰岛素，胰高血糖素，生长激素) 造血生长因子(Erythropoietin, colony stimulating factors) 干扰素 (Interferons-α, -β, -γ) 白介素 (Interleukin-2) 疫苗 (Hepatitis B surface antigen) 肿瘤坏死因子 治疗用酶 单克隆抗体
by抗体生产部门
功能鉴定： ADCC, CDC, 中和细胞因子
by药效部门
药效筛选
ADCC—LDH release
药 效 筛 选
ADCC Assay on SK-BR-3 Cells with NK92-CD16A
70 60
Herceptin(control) ####
% Target Cell Lysis
EGFR
TNFα VEGF
A431,A549
CHO-DG44-tnfα HUVEC
西妥昔单抗 （Cetuximab）
爱必妥 （Erbitux）
默克－雪 兰诺
雅培 阿达木单抗 修美乐 （Adalimumab） （Humira） 罗氏 贝伐珠单抗 阿瓦斯汀 （Bevacizumab） （Avastin）
单 抗 药 物 作 用 机 理
靶点 CD20 Her2
表达细胞 Daudi,raji,RPMI-8226
抗体药 利妥昔单抗 （Rituximab）
商品名
厂家
罗氏 美罗华 （Rituxan）
MDA-MB-231,MCF-7,SK-OV-3 曲妥珠单抗 罗氏 赫赛汀 （Trasduzumab） （Herceptin）
Herceptin (control) log(agonist) vs. response -- Variable slope (four parameters) Best-fit values Bottom Top LogEC50 0.6537 31.88 -2.545
50 40 30 20 10 0 -10 10 -4 10 -2 10 0 10 2
cell proliferation and antibody neutralization
药 效 筛 选
V E G F In d u c e d H U V E C P r o life r a tio n
120
H U V E C n e u tr a liz a tio n a s s a y