双水相萃取技术

双⽔相萃取技术

双⽔相萃取技术

（two-aqueous phase extraction）

⼀、前⾔

近年来，随着基因⼯程、蛋⽩质⼯程、细胞培养⼯程、代谢⼯程等⾼新⽣物技术研究⼯作的⼴泛展开，各种⾼附加值的⽣化新产品不断涌现，对⽣化分离技术也提出了越来越⾼的要求。与上游过程相⽐，⽬前作为下游过程的⽣化分离纯化技术往往存在步骤多，收得率低，处理时间长，重复性差等缺点，这样便严重阻碍了⽣物技术的⼯业化发展。因此，就迫切需要⼀种分离步骤少，收得率⾼，处理时间短，并且易于放⼤的⽣化分离纯化技术，双⽔相萃取技术就满⾜了这⼀需要。特别是基因⼯程技术的发展，需要从细胞中提取⾼质量的遗传物质，由于细胞破碎后，在溶液中存在⼤量的轻质细胞碎⽚，给遗传物质的提取形成了很⼤的⼲扰，通常通过离⼼分离和溶剂萃取难以得到⾼纯度⾼活性的遗传物质，⽽通过双⽔相初步提取，可以使⽬标物和轻质碎⽚得到很好的分离，且⽬标物的活性⼏乎没有损失。因此双⽔相萃取技术得到了很⼤的重视，并且在近20年⾥取得了较⼤的发展。

⼆、发展史

双⽔相萃取技术⼜称之为⽔溶液两相分配技术（Partition of two aqueous phase system）1、1896年，Beijernek 在琼脂和可溶性淀粉或明胶混合时，发现这种混合溶液能较快地分为两层，他把这种现象称之为聚合物的“不相容性”（incompatibility）――――体系的发现2、1956年瑞典伦得（Luhd）⼤学的Albertson发现双⽔相萃取技术可⽤于蛋⽩质的选择分离，但⽬标蛋⽩同成相⾼聚物的分离是影响了其⼤规模⼯业应⽤。――――――――――发现可以⽤于分离提纯3、20世纪70年代中期西德的Kula和Kroner等⼈⾸先将双⽔相技术应⽤于从细胞匀浆液中提取酶和蛋⽩质，从⽽⼤⼤改善了胞内酶的提取过程，提⾼了酶的收得率。―――――――利⽤于活性物质的提取4、1989年，Diamond等⼈以Flory－Huggins理论为基础，推导出⽣物分⼦在双⽔相体系中的分配模型，但有局限性，仍需继续探索，不断完善。――――――――――开始理论研究5、20世纪90年代以来，由于控制和优化技术的发展，将⽣化分离过程进⾏集成化（process integration）和将⽣化反应与分离过程集成化成为了研究热点。

――――――――――集成化研究

三、与传统分离⽅法的⽐较

在⽣物发酵产品制备中，细胞和细胞碎⽚的除去是整个分离纯化的第⼀步，也是最为关键的⼀步，它将直接影响到后续⼯序的收得率。传统的分离⽅法主要采⽤离⼼法及过滤法。这两种⽅法在实际应⽤中都有⼀定缺点，如离⼼法能耗⾼，

过滤法膜孔容易堵塞。⽽双⽔相萃取，整个操作可以连续化，除去细胞和细胞碎⽚的同时，还可以起到纯化⽬标物的作⽤。各种⽅法的⽐较见表A，可以看得出，在除去细胞碎⽚的各种⽅法中，双⽔相萃取技术是传统的离⼼分离和过滤法⽆法⽐拟的。

和传统的酶粗分离⽅法，如盐析，有机溶剂沉淀相⽐，双⽔相萃取分离技术也有很⼤的优势。见表B，⼀般说来，传统的分离⽅法达到与双⽔相萃取相同的处理量时，需要⽐双⽔相萃取多3到10倍的设备，⽽且⽐双⽔相萃取分离⽅法放⼤困难。

虽然双⽔相萃取技术具有很⼤的优势，但⽬前真正⼯业化的例⼦却很少。主要原因是⼤规模分离时，双⽔相萃取的成本较⾼，使得其技术上的优势⼤打折扣。⼤规模分离中，双⽔相萃取总成本中主要是原料成本（90％以上）。原料成本和⽣产规模成正⽐，因⽽随着⽣产规模的放⼤，总成本也增加很⼤。⽽传统的分离⽅法中，总成本主要是设备投资，并且设备投资并不与⽣产规模成正⽐。因⽽是的⼤规模⽣产时双⽔相萃取技术没有优势可⾔。因此降低成相物的成本是双⽔相萃取技术⼯业化应⽤的关键。

四、双⽔相体系的构成1、双⽔相体系的形成

A、⾼聚物/⾼聚物体系

作为⼀种体系，也就是说它是⼀个系统，在⽆外界⼲扰的情况下，系统的能量总要趋向于最低状态。对于双⽔相体系⽬前主要有两种解释法：⼀种认为两种聚合物相互混合时，究竟是否分层还是混成⼀相，主要取决于两种因素，即分⼦间作⽤⼒和熵的增加。两种物质混和时熵的增加与涉及的分⼦数⽬有关，同分⼦⼤⼩⽆关。但分⼦间的作⽤⼒，可以看作分⼦中各个基团之间相互作⽤⼒的总和，分⼦越⼤当然作⽤⼒就越⼤。可见对于⼤分⼦⽽⾔决定混合的结果主要取决于分⼦间的作⽤⼒，⽽不是熵增。若两种聚合物分⼦间若表现为排斥⼒，即某种分⼦希望在它的周围的分⼦系同种分⼦⽽⾮异种分⼦，则达到平衡后，就有可能分成两相。若存在引⼒，或同种分⼦引⼒或异种分⼦斥⼒不够强，则会混容或很难形成两相。另外⼀种就简单的归结为分⼦间的空间位阻，即在⼀定条件下，由于⾼聚物分⼦的空间阻碍作⽤，⽆法互相渗透形成均相，具有相互分离倾向⽽形成两项系统。

若从混合前后能量的⾼低来解释就更好理解。假设有两种物质，物质A要进⼊物质B的体系中，⾸先要克服它本⾝分⼦间的作⽤⼒，假设所需能量为E1，然后需要B克服的空间位阻，即B物质要分开留出⼀定空间来容纳物质A，假设所需能量为E2，混合后，AB物质相互作⽤，假设释放的能量为E，如果E1+E2>E，则表现为不相容，分为两相；若E1+E2B、⾼聚物/⽆机盐系统

⾼聚物和⽆机盐形成两相系统⽐较⼀致的解释是盐析作⽤。C、⽣化分离常见的体系

聚⼄⼆醇（poly ethylene glycol PEG）/葡聚糖（Dextran DEX）系统PEG/DEX硫酸盐系统

PEG/硫酸盐系统

PEG/磷酸盐系统

实验证明这两种聚合物对⽣化活性物质⽆毒害作⽤，反⽽起到保护作⽤，使分⼦结构更稳定。2、相图（作图说明）

A、双节线TCB将单相区和两相区分开，曲线下⽅是由两种⾼聚物混合溶液组成的均相体系，曲线上⽅是由两种⾼聚物溶液组成的双⽔相体系。B、直线TMB称之为系线，系线上的所有点构成的双⽔相体系的组成相同，但体积⽐不同。

C、T和B点分别代表上下相两种⾼聚物的质量百分组成。

D、由于上下两相密度差别不⼤，则有V T/V B=BM/TM

E、C点表⽰系线长度为零，代表两相差别消失或者说两相即将形成的点，称之为临界点（critical point）或褶点（plaitpoint）

F、双节线的位置和形状与聚合物的分⼦量有关。聚合物的分⼦量越⾼，相分离所需的浓度越低；两种聚合物分⼦量的差别越⼤，双节线的形状越不对称。见图①B

五、双⽔相萃取分配理论基础

双⽔相萃取与⽔-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同（⼀个两相都是⽔溶液，⽽另⼀个⼀相是⽔溶液，另⼀相是有机溶液）。当物质进⼊双⽔相体系后，由于表⾯性质、电荷作⽤和各种⼒（如疏⽔键、氢键和离⼦键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中分配的浓度不同。分配系数Ｋ等于物质在两相的浓度⽐，即K＝C1/C2。（C1⼀般表⽰上相，C2⼀般表⽰下相）因为各种物质的Ｋ值不同，可利⽤双⽔相体系对物质进⾏分离提纯。1、表⾯⾃由能的影响

众所周知，当体系达到平衡时，分⼦处于某⼀相时若能量低，则它会⽐较集中地分配到该相中。设分⼦⾃相2移到相1所需能量为△E，则根据相平衡时，化学位应相等的原则，可得到分配系数K应为：

式中：k—波尔茨曼常数；T—温度。

设某种被分离物质的分⼦表⾯积为A，

则在两相中的表⾯能分别是Aγ1

和Aγ2,可得:

kTe

C

C

K

E

2

1

-=

=

kT

e

C

C

k

)

-A(

2

1

2

1

γ

γ-

=

=

分析上式可知分配系数主要取决于分⼦的表⾯积和表⾯性质(1)、当分⼦在两相中的表⾯性质相同时，可知K ＝1，则这种物质在两相中的分配相同，这种系统不能将该物质提纯浓缩。

（2）、当分⼦在两相中的表⾯性质不相同时，则K ≠1，若差别越⼤，K 值就会越⼩或是越⼤，即C 1和C 2的差值就越⼤，就更有利于该物质的提纯浓缩。

（3）、从表⾯积来说，A 值越⼤，会导致C 1和C 2的差值就越⼤。⼀般来说，分⼦量和表⾯积成正⽐，所以从理论上来说，利⽤双⽔相系统分离⼤分⼦物质是很合理的。

（4）、另外，对于⼀个待分离的混合溶液来说，由于各种物质分⼦的表⾯积

不同，且在两相中的表⾯性质也存在差异，所以其分配系数K 值也不会⼀样，从⽽在双⽔相体系中能达到提纯的作⽤。2、表⾯电荷的影响

对于带电物质的正负粒⼦，当在两相中分配系数K 不相等时，就会产⽣电位差，称之为道南电位（Donnan potentin ）

当两相分配达到平衡时，经推导得到如下式⼦：

可见可以通过加⼊带电粒⼦来改变两相的电位差，从⽽影响物质在两相中的的分配系数。

六、 影响分配的因素1、 聚合物的分⼦量

根据表⾯⾃由能的理论，

我们知道可以通过改变表⾯张⼒的⼤⼩来改变分⼦的分配系数。

⽐如⽤PEG/DEX 系统提取蛋⽩质，如果想让蛋⽩质分配在上相，则要求K 增⼤，蛋⽩质表⾯积A 不变，从⽽要求γ1―γ减⼩2，也就是说要降低蛋⽩质在上

相（主要含有PEG ）的表⾯张⼒，提⾼在下相（主要含有DEX ）的表⾯张⼒。⽽表⾯张⼒的⼤⼩同聚合物分⼦量⼤⼩有关，分⼦量越⼤，其端基数⽬减少，导致疏⽔性增加，从⽽使表⾯张⼒增⼤。因此需要降低PEG 的分⼦量，增⼤DEX 的分⼦量。

当聚合物的分⼦量降低时，蛋⽩质易于分配富含该聚合物的相中，这是⼀条普遍规律，不论何种成相聚合物系统，何种进⾏分配的⽣物⾼分⼦都实⽤。2、 聚合物浓度的影响

(1)、当聚合物处于双节线以下时，被分离物将均匀分布于溶液中。

（2）、当超过双节线，则形成两相，此时随着聚合物或盐浓度的不同变化，双⽔相系统的性质将发⽣较⼤的变化。因此可以通过改变聚合物或盐的浓度来改变物质在系统的分配系数。⼀般说来，当系统远离临界点时，系统的表⾯张⼒将+--++=-Z AZ B K K F Z Z RT U U ln )(12kT e C C k )

-A (2121γγ-==kT e C C k )

-A (2

121γγ-==

增加。（画相图解释）3、盐类的影响

由于各种⽆机离⼦在PEG/DEX分配系数的不同，当加⼊⽆机盐后，将在两相间形成不同的电位差，这对带电⽣物⼤分⼦的分配产⽣很⼤的影响。

见表①C

例如：NaCl对卵蛋⽩和溶菌酶分配系数的影响，

（作曲线图解释，见图①C）

另外，HPO4

2－离⼦在PEG/DEX系统中的分配系数很⼩，因⽽加⼊PH⼤于7的磷酸盐缓冲溶液能很⽅便地改变相间电位差，使带负电的⽣物⼤分⼦移向PEG 相。4、pH值的影响

影响所分离分⼦的离解度，导致分⼦所带电荷的性质的改变，从⽽改变了这种分⼦在两相中的分配系数。

影响磷酸盐的离解度，若改变HPO42－和H

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