HPLC法测定饲料中维生素A_维生素D_3和维生素E(精)

HP LC 法测定饲料中维生素A 、维生素D 3和维生素E摘要:建立了以w (C 2H 5OH =95%乙醇直接提取,高效液相色谱仪在波长280n m 和254n m 处连续测定饲料中维生素A 、维生素D 3和维生素E 的方法。

色谱柱为大连依利特Hypersil ODS C 18(25c m ×416mm ×5μm ,流动相为甲醇水,流速为112mL /m in 。

维生素A 、维生素D 3、维生素E 的质量浓度分别在110mg/L ~2010mg/L 、015mg/L ~15.0mg/L 、215mg/L ~5010mg/L 范围内与峰面积呈良好的线性关系,检测限分别为013×10-6μg 、0104×10-6μg 、510×10-6μg,相对标准偏差分别为116%、217%、214%,平均回收率分别为99%、102%、98%。

关键词:高效液相色谱法;维生素A;维生素D 3;维生素E;饲料中图分类号:O65717+2文献标识码:B 文章编号:10062009(200502003302To D etect V itam i n A,V it am i n D 3and V it am i n E i n Feed w ith HPLC(Changsha Environm ental P rotection Technology Institute,Changsha,Hunan 410004,ChinaAbstract:To detect V ita m in A,V ita m in D 3and V ita m in E in feed,which t o directly extract withw (C 2H 5OH =95%glycollic,with HP LC in 280n m and 254n m.Chr o mat ographic colu mn was Hy persil ODSC 18(25c m ×4.6mm ×5μm ,mobile phase was methanol -water,vel ocity of fl ow was 1.2mL /m in .W hen the mass concentrati on of V ita m in A,V ita m in D 3and V ita m in E was 1.0mg/L ~20.0mg/L 、0.5mg/L ~15.0mg/L 、2.5mg/L ~50.0mg/L,there had a well lineal relati onshi p.Detecti on li m it was0.3×10-6μg 、0.04×10-6μg 、5.0×10-6μg.Relative standard deviati on was 1.6%、2.7%、2.4%,recovery rate was 99%、102%、98%.Key words:HP LC;V ita m in A;V ita m in D 3;V ita m in E;Feed收稿日期:20040323;修订日期:20050130作者简介:王安群(1962—,女,江西吉安人,高级工程师,学士,从事环境监测教学工作。

预混合饲料中维生素A、D3和E快速联检的高效液相色谱法段春宇【期刊名称】《中国动物保健》【年(卷),期】2022(24)7【摘要】本文旨在探索一种能同时、快速检测预混合饲料中VA、VD_(3)和VE含量的高效液相色谱检测方法。

样品在甲醇基质中60℃水浴15min,冷却后超声提取30min,再次冷却后定容,过0.45μm有机系微孔过滤器后,经C_(18)反相色谱柱分离,以纯甲醇为流动相,使用高效液相色谱-紫外检测器进行检测。

结果表明:VA在11.63~581.40IU/mL线性关系良好,相关系数为0.99989,检出限为1.0×10^(3)IU/kg、定量限为3.3×10^(3)IU/kg,方法回收率为94.69%~98.38%,RSD为2.34%~5.71%;VD_(3)在16.00~800.00IU/mL线性关系良好,相关系数为0.99997,检出限为1.5×10^(3)IU/kg、定量限为5×10^(3)IU/kg,方法回收率为94.93%~98.91%,RSD为1.81%~6.09%;VE在0.008~0.400IU/mL线性关系良好,相关系数为0.99998,检出限为6IU/kg、定量限为20IU/kg,方法回收率为94.39%~97.28%,RSD为1.77%~7.46%。

本方法快速、简便、灵敏度高、重现性好、准确度高,适用于实验室批量同时检测预混合饲料中VA、VD;和VE的含量。

【总页数】2页(P127-128)【作者】段春宇【作者单位】山东省莒南县检验检测中心【正文语种】中文【中图分类】R28【相关文献】1.快速检测复合预混合饲料中维生素D3含量的高效液相色谱法2.高效液相色谱法测定维生素预混合饲料中的25-羟基维生素D33.高效液相色谱法测定维生素预混合饲料中的25-羟基维生素D34.高效液相色谱法测定预混合饲料中的25-羟基维生素D35.高效液相色谱法测定复合预混合饲料中的25-羟基维生素D3因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

高效液相色谱法测定饲料中维生素A一、简介近期，随着经济的复苏，维生素类饲料添加剂销售量大大增加，全球原料药大制造商帝斯曼最近也宣布对饲料维生素A涨价6%，所以饲料中维生素A的检测就显得非常紧急和重要。

南京科捷参考国标（GB/T 17817-2010），利用全新高性能的LC-10Tvp高效液相色谱仪，经实践检测可提供饲料中维生素A的HPLC检测方案，得出的结果准确可靠，检出限好，适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素A的测定，仅供广大用户参考。

二、四川成都LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪配置：LC-10Tvp高压恒流泵：2台SPD-10Tvp紫外检测器：1台SCL-10Tvp 系统控制器：1台7725i手动进样阀： 1套色谱工作站：1套（VI2010、N2000、N3000选用）液相色谱柱：1支（C18 4.6*250mn,5um）微量进样器：1支（50ul/100ul）进样支架：1只（进样阀用）三、四川成都LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪特点：LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪是南京科捷分析仪器有限公司为了快速地满足多样化的客户需求，在原有的STI501液相色谱仪的基础上经过优化，利用美国先进技术开发设计，国内加工生产的的一款新型的液相色谱仪。

LC-10Tvp等度高效液相色谱仪实现了人机对话，可实时对仪器的运行状态进行监控，并可对潜在和已出现的故障做出判断，同时提供在线解决方案。

该仪器也全面实现了远程的准无人操作，大大提高了仪器的使用效率，同时通过高精度的AS1000自动进样系统，实现自动化进样，最大程度抑制了样品的交叉污染，提供样品分析精度。

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ｄｏｉ：１０．１１７５１／ＩＳＳＮ．１００２－１２８０．２０１８．０７．０８ＨＰＬＣ测定维生素ＡＤＥ注射液中三种维生素的含量吴春燕１，２，张金宝３，刘海艳３，李文财３，冯岩３，王莉３，任建军３，张玉彦３∗（１．宁夏兽药饲料监察所，银川７５００１１；２．西北农林科技大学动物科技学院，杨凌７１２１００；３．宁夏智弘生物科技有限公司，银川７５００２１）［收稿日期］２０１７－１１－３０㊀［文献标识码］Ａ㊀［文章编号］１００２－１２８０（２０１８）０７－００５２－０７㊀［中图分类号］Ｓ８５９．７９［摘㊀要］㊀采用ＨＰＬＣ建立了兽药维生素ＡＤＥ注射液中维生素Ａ㊁维生素Ｄ３和维生素Ｅ的含量检测㊂采用Ｃ１８色谱柱（１５０ｍｍˑ４．６ｍｍ，５μｍ），甲醇为流动相Ａ㊁乙腈－乙醇－水（６０ʒ２５ʒ５）为流动相Ｂ进行梯度洗脱，流速为１．５ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长为２６５ｎｍ，柱温为２５ħ，进样量为２０μＬ㊂结果表明，在此色谱条件下，维生素ＡＤＥ注射液中维生素Ａ㊁维生素Ｄ３和维生素Ｅ的分离度良好，分别在６０．９６ １２１９．２０μｇ／ｍＬ㊁２．５６ ５１．２０μｇ／ｍＬ和３００．２３ ６００４．６０μｇ／ｍＬ范围内线性关系良好（ｒ２＞０．９９９）㊂按外标法以峰面积计算进行检测，维生素Ａ㊁维生素Ｄ３和维生素Ｅ的平均回收率分别为９９．６％㊁１０１．１％和９９．０％，ＲＳＤ均小于１．０％；平均重复性分别为１０５．７％㊁１０６．８％和１０２．３％，ＲＳＤ均小于１．０％；中间精密度的ＲＳＤ均小于０．５％；稳定性的ＲＳＤ均小于１．０％；耐用性中选择流动相Ａ与Ｂ变化为１７ʒ８３㊁流速为１．５ｍＬ／ｍｉｎ时，在一定范围内三种组分的含量基本稳定；柱温为２５ħ时，可避免维生素降解㊂说明该方法简单㊁快速，适用于维生素ＡＤＥ注射液中三种维生素含量的测定，具有分离效果好㊁回收率高和稳定性好的特点㊂［关键词］㊀ＨＰＬＣ；维生素ＡＤＥ注射液；含量测定作者简介：吴春燕，农业工程师，从事兽药监督㊁复核检验方面工作㊂通讯作者：张玉彦㊂Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｙｙ＠ｚｏｏｈａｎｃｅ．ｃｏｍＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ３ＫｉｎｄｓｏｆＶｉｔａｍｉｎｓｉｎＶｉｔａｍｉｎＡＤＥＩｎｊｅｃｔｉｏｎｂｙＨＰＬＣＷＵＣｈｕｎ－ｙａｎ１，２，ＺＨＡＮＧＪｉｎ－ｂａｏ３，ＬＩＵＨａｉ－ｙａｎ３，ＬＩＷｅｎ－ｃａｉ３，ＦＥＮＧＹａｎ３，ＷＡＮＧＬｉ３，ＲＥＮＪｉａｎ－ｊｕｎ３，ＺＨＡＮＧＹｕ－ｙａｎ３∗（１．ＮｉｎｇｘｉａＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＤｒｕｇｓａｎｄＦｅｅｄＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ７５００１１，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ７１２１００，Ｃｈｉｎａ；３．ＮｉｎｇｘｉａＺｏｏｈａｎｃｅＢｉｏｔｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ７５００２１，Ｃｈｉｎａ）㊀㊀Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＺＨＡＮＧＹｕ－ｙａｎ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｙｙ＠ｚｏｏｈａｎｃｅ．ｃｏｍＡｂｓｔｒａｃｔ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｖｉｔａｍｉｎＡ，ｖｉｔａｍｉｎＤ３ａｎｄｖｉｔａｍｉｎＥｉｎｖｉｔａｍｉｎＡＤＥｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．ＵｓｉｎｇＣ１８ｃｏｌｕｍｎ（１５０ｍｍˑ４．６ｍｍ，５μｍ）ｗｉｔｈａｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｏｆｍｅｔｈａｎｏｌａｓｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＡａｎｄａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｅｔｈａｎｏｌ－ｗａｔｅｒ（６０ʒ２５ʒ５）ａｓｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＢａｔａｆｌｏｗｒａｔｅｏｆ１．５ｍＬ／ｍｉｎａｎｄａｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ２５ħ．Ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｉｓ２６５ｎｍ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅｉｓ２０μＬ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｆｏｒｖｉｔａｍｉｎＡ，ｖｉｔａｍｉｎＤ３ａｎｄｖｉｔａｍｉｎＥｗｅｒｅｌｉｎｅａｒｏｖｅｒｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ６０．９６ １２１９．２０μｇ／ｍＬ，２．５６ ５１．２０μｇ／ｍＬａｎｄ３００．２３ ６００４．６０μｇ／ｍＬ（ｒ２＞０．９９９），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｍｅａｎｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｏｆｖｉｔａｍｉｎＡ，ｖｉｔａｍｉｎＤ３ａｎｄｖｉｔａｍｉｎＥｗｅｒｅ９９．６％，１０１．１％ａｎｄ９９．０％（ＲＳＤ＜１．０％）；ｔｈｅｍｅａｎｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｗｅｒｅ１０５．７％，１０６．８％ａｎｄ１０２．３％（ＲＳＤ＜１．０％）；ｔｈｅＲＳＤｏｆｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｐｒｅｃｉｓｉｏｎｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ０．５％；ｔｈｅＲＳＤｏｆｓｔａｂｉｌｉｔｙｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ１．０％．Ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ，ｗｈｅｎｔｈｅｖａｒｙｏｆｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ（１７ʒ８３）ａｎｄｆｌｏｗｒａｔｅ（１．５ｍＬ／ｍｉｎ）ｍａｄｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｗｅｒｅｂａｓｉｃａｌｌｙｓｔａｂｌｅ，ｗｈｉｌｅｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｓ２５ħｔｏａｖｏｉｄｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｖｉｔａｍｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓ．Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｈａｓｇｏｏｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｈｉｇｈｒｅｃｏｖｅｒｙａｎｄｇｏｏｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｖｉｔａｍｉｎＡＤＥｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＨＰＬＣ；ｖｉｔａｍｉｎＡＤＥｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；ｃｏｎｔｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ㊀㊀维生素ＡＤＥ注射液是以维生素Ａ㊁维生素Ｄ和维生素Ｅ为主药，辅以其他溶剂，制备成的营养补充类物质，用于预防和治疗动物维生素Ａ㊁维生素Ｄ和维生素Ｅ缺乏症［１－３］，该制剂目前正在申报５．１类新兽药㊂目前，测定脂溶性维生素Ａ㊁维生素Ｄ３和维生素Ｅ的方法主要包含分光光度法和ＨＰＬＣ法［４－５］，其中分光光度法是通过测定吸收度而确定样品含量，因样品中的辅料会对吸收度造成干扰而影响含量检测，须经过皂化和提取等预处理过程后进行检测；ＨＰＬＣ法具有灵敏度高㊁操作简单和重现性好等特点，但是样品同样须经过繁琐的预处理过程后，方能进行含量检测㊂根据维生素Ａ㊁维生素Ｄ３和维生素Ｅ均溶于乙醇的物理特性，结合相似相溶原理，采用无水乙醇直接提取的方法，并建立了以甲醇为流动相Ａ㊁乙腈－乙醇－水（６０ʒ２５ʒ５）为流动相Ｂ的反相ＨＰＬＣ法，能有效分离维生素Ａ㊁维生素Ｄ３和维生素Ｅ，来满足实际生产过程中对检验时间及结果的需求㊂结果表明该方法操作简单㊁结果准确，可用于成品及中间体的检测㊂１㊀材㊀料１．１㊀仪器㊀上海梅特勒托利多仪器有限公司ＡＢ２６５－Ｓ电子天平；日本岛津ＬＣ－２０１０Ｃ高效液相色谱仪㊂１．２㊀试药与试剂㊀维生素Ａ棕榈酸酯对照品，购自德国Ｊ＆ＫＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＬｔｄ，批号为ＬＪ１０Ｐ４９，含量１７９０，０００Ｕ／ｇ；维生素Ｄ３对照品，购自中国食品药品检定研究院，批号为１０００６１－２０１２０８，含量９９．８％；维生素Ｅ对照品，购自中国食品药品检定研究院，批号为１０００６２－２０１１１０，含量９７．７％；维生素ＡＤＥ注射液，宁夏智弘生物科技有限公司生产，批号为２０１２１００１，规格１０ｍＬ：维生素Ａ１，０００，０００Ｕ＋维生素Ｄ３１００，０００Ｕ＋维生素Ｅ３，０００Ｕ；所有试剂均为色谱级㊂２㊀方法与结果２．１㊀色谱条件㊀ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＳＢ－Ｃ１８色谱柱（１５０ｍｍˑ４．６ｍｍ，５μｍ）；甲醇为流动相Ａ，乙腈－乙醇－水（６０：２５：５）为流动相Ｂ，按表１进行梯度洗脱；检测波长为２６５ｎｍ；流速为１．５ｍＬ／ｍｉｎ；柱温为室温；进样量为２０μＬ㊂表１㊀梯度洗脱Ｔａｂ１㊀Ｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎ时间／ｍｉｎ流动相Ａ／％流动相Ｂ／％０１７８３１８５０５０２１１０００３５１０００４０１７８３２．２㊀溶液的配制２．２．１㊀对照品溶液㊀精密称取维生素Ａ棕榈酸酯对照品㊁维生素Ｄ３对照品和维生素Ｅ对照品各适量，用无水乙醇制成每１ｍＬ中约含维生素Ａ棕榈酸酯１０００Ｕ㊁维生素Ｄ３１００Ｕ㊁维生素Ｅ３Ｕ的溶液，滤过，即得㊂２．２．２㊀供试品溶液㊀精密量取本品１ｍＬ，置１００ｍＬ量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得㊂２．３㊀方法学考察２．３．１㊀专属性㊀精密吸取２０μＬ空白溶剂㊁阴性溶液（不含主药）㊁对照品溶液和供试品溶液，按上述色谱条件，注入色谱仪，记录色谱图，结果如图１所示，空白溶剂及阴性溶液对三种组分含量测定无干扰㊂（ａ：空白溶剂图谱；ｂ：阴性溶液图谱；ｃ：对照品图谱；ｄ：供试品图谱）（ａ：Ｂｌａｎｋｓｏｌｖｅｎｔｍａｐ；ｂ：Ｎｅｇａｔｉｖｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍａｐ；ｃ：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｐ；ｄ：Ｔｅｓｔｓａｍｐｌｅｍａｐ）图１㊀专属性图谱Ｆｉｇ１㊀Ｓｐｅｃｉｆｉｃｍａｐ２．３．２㊀线性㊀精密称定维生素Ａ棕榈酸酯㊁维生素Ｄ３㊁维生素Ｅ对照品适量，加无水乙醇制成每１ｍＬ中含维生素Ａ棕榈酸酯６０９６μｇ㊁维生素Ｄ３２５６μｇ㊁维生素Ｅ３００２３μｇ的混合液，精密量取上述对照品混合液０．１㊁０．２㊁０．６㊁１．０㊁１．５㊁２．０ｍＬ，分别置于１０ｍＬ量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过㊂按上述色谱条件，精密量取２０μＬ，注入色谱仪，记录色谱图㊂以样品浓度为ｘ（μｇ／ｍＬ），平均峰面积为ｙ，进行线性回归㊂结果回归方程（ｎ＝７）和相关系数分别为维生素Ａｙ＝７．３２３５ｘ＋２４．２９７，ｒ２＝１；维生素Ｄ３ｙ＝４．５７１４ｘ＋０．７７７３８，ｒ２＝０．９９９９５；维生素Ｅｙ＝１．２０３６ｘ＋３３．１７９，ｒ２＝０．９９９９㊂实验结果表明，维生素Ａ㊁维生素Ｄ３和维生素Ｅ分别在６０．９６ １２１９．２０μｇ／ｍＬ㊁２．５６ ５１．２０μｇ／ｍＬ和３００．２３ ６００４．６０μｇ／ｍＬ范围内线性关系良好㊂２．３．３㊀准确度㊀精密量取对照品溶液４０ｍＬ㊁５０ｍＬ和６０ｍＬ各３份分别置１００ｍＬ量瓶中，再分别精密量取０．５０ｍＬ供试品加入至上述各１００ｍＬ量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，即得样品溶液㊂供试品溶液作为本底溶液㊂按上述色谱条件，精密量取２０μＬ，注入色谱仪，记录色谱图，结果如表２，平均回收率大于９９％，说明检测方法的准确度良好㊂表２㊀准确度结果Ｔａｂ２㊀Ａｃｃｕｒａｃｙｒｅｓｕｌｔ组分本底值（Ｕ／ｍＬ）加入量（Ｕ／ｍＬ）测量值（Ｕ／ｍＬ）实测值（Ｕ／ｍＬ）回收率／％平均回收率／％ＲＳＤ／％维生素Ａ９７８．３５４１８．７２９０７．６５４１８．４８９９．９９０６．４２４１７．２４９９．６９０８．１０４１８．９３１００．０５２３．４０１０１０．７２５２１．５４９９．６１０１１．９５５２２．７８９９．９１００９．３７５２０．１９９９．４６２８．０８１１１３．５５６２４．３８９９．４１１１３．３３６２４．１５９９．４１１１２．３１６２３．１４９９．２９９．６０．３维生素Ｄ３９２．７７４０．２４８７．１９４０．８０１０１．４８７．１９４０．８０１０１．４８７．１９４０．８０１０１．４５０．３０９７．２５５０．８６１０１．１９７．２５５０．８６１０１．１９７．２５５０．８６１０１．１６０．３６１０７．３０６０．９２１００．９１０７．３０６０．９２１００．９１０７．３０６０．９２１００．９１０１．１０．２维生素Ｅ２．６８１．２２２．５４１．２０９８．４２．５４１．２０９８．４２．５５１．２１９９．２１．５２２．８５１．５１９９．３２．８６１．５２１００．０２．８４１．５０９８．７１．８３３．１５１．８１９８．９３．１５１．８１９８．９３．１５１．８１９８．９９９．００．５㊀实测值＝测量值－０．５ˑ本底值；回收率＝（实测值／加入量）ˑ１００％２．３．４㊀精密度２．３．４．１㊀重复性试验㊀取６份供试品，照２．２．２项下方法制备供试品溶液，测定供试品溶液中三种维生素的含量，结果如表３，ＲＳＤ均小于１．０％，说明重复性良好㊂表３㊀重复性结果Ｔａｂ３㊀Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓ组分１２３４５６平均／％ＲＳＤ／％维生素Ａ１０６．０１０６．２１０５．４１０６．３１０５．２１０４．９１０５．７０．５维生素Ｄ３１０６．６１０６．９１０６．９１０７．０１０６．７１０７．０１０６．８０．２维生素Ｅ１０２．２１０１．８１０２．７１０２．５１０２．６１０２．０１０２．３０．３２．３．４．２㊀中间精密度㊀由Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ三人，分别取２份供试品，照２．２．２项下方法制备供试品溶液，测定供试品溶液中三种维生素的含量，结果如表４，ＲＳＤ均小于０．５％，说明精密度良好㊂表４㊀中间精密度结果Ｔａｂ４㊀Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｐｒｅｃｉｓｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓ组分试验员含量／％平均值／％ＲＳＤ／％维生素ＡＡ１０４．６１０５．３１０５．０Ｂ１０５．８１０５．２１０５．５Ｃ１０５．４１０６．１１０５．８０．３维生素Ｄ３Ａ１０７．１１０７．５１０７．３Ｂ１０６．５１０７．１１０６．８Ｃ１０６．７１０５．８１０６．２０．４维生素ＥＡ１０２．６１０１．８１０２．２Ｂ１０１．９１０２．２１０２．１Ｃ１０２．２１０１．６１０１．９０．３２．３．５㊀稳定性㊀取１份供试品，照２．２．２项下方法制备供试品溶液，分别在０㊁３㊁６㊁９㊁１２ｈ进样２０μＬ，测定供试品溶液中三种维生素的含量，结果如表５，ＲＳＤ均小于１．０％，说明制备后１２小时内测定基本稳定㊂２．３．６㊀耐用性㊀考察不同的流动相㊁柱温和流速对含量测定的影响，按上述色谱条件，精密量取２０μＬ，注入色谱仪，记录色谱图，结果如表６，在流动相㊁柱温和流速出现小的变动时，含量测定基本不受影响㊂表５㊀稳定性结果（ｎ＝４）Ｔａｂ５㊀Ｓｔａｂｉｌｉｔｙｒｅｓｕｌｔｓ（ｎ＝４）组分０３６９１２平均值ＲＳＤ／％维生素Ａ４７２４２４９４７３５４８２４７４４０８３４７４４５０５４７４６１２６４７３８８８９０．２维生素Ｄ３２０１５２４１９９５９５１９９１２０１９７７５７１９８１８３１９９２３６０．７维生素Ｅ３８７５８０２３９０００５２３９０６７２５３９４０７２９３９２７２５７３９１０１１３０．６表６㊀耐用性－流动相㊁柱温㊁流速结果Ｔａｂ６㊀Ｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ－ｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ，ｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｆｌｏｗｒａｔｅｒｅｓｕｌｔｓ组分流动相柱温流速Ａ－Ｂ（１４ʒ８６）Ａ－Ｂ（１７ʒ８３）Ａ－Ｂ（２０ʒ８０）２５ħ３０ħ３５ħ１．３ｍＬ／ｍｉｎ１．５ｍＬ／ｍｉｎ１．７ｍＬ／ｍｉｎ维生素Ａ１０６．１１０５．５１０５．６１０５．５１０５．６１０５．４１０５．１１０５．９１０５．０维生素Ｄ３１０７．４１０７．２１０７．４１０６．６１０６．７１０６．５１０６．４１０６．７１０６．１维生素Ｅ１０２．２１０２．０１０２．６１０２．２１０２．２１０２．２１０２．３１０３．２１０２．２３㊀讨论与结论３．１㊀检测方法的选择㊀截止到目前，维生素的分析方法主要包含微生物法㊁生物鉴定法㊁化学法和仪器法四大类［６］，其中微生物法仅用于测定水溶性维生素的含量，生物鉴定法用于分析样品生物利用率，化学法用于特定维生素的检测，仪器法用途较为广泛㊂随着科技的不断发展，高效液相色谱法已逐步成为常规的含量检测手段，该方法具有快速㊁灵敏等特点［７］㊂ＨＰＬＣ法能够在４０ｍｉｎ内，有效分离维生素Ａ㊁维生素Ｄ３和维生素Ｅ，满足了实际生产过程中对检验时间及结果的需求㊂３．２㊀提取方式的选择㊀目前，脂溶性维生素的提取方式主要以皂化法为主，通过皂化法处理样品，水洗去除类脂物后，用有机溶剂提取脂溶性维生素，浓缩后将样品溶于适当的溶剂中进行测定［８］㊂在整个提取过程中，为了避免维生素的氧化降解，通常采用加入抗氧剂㊁充氮气和避光等方法进行操作㊂由此可见，采用皂化法进行脂溶性维生素的预处理，是较为繁琐的过程，同时整个过程中容易出现提取不完全的现象，并且过程的复杂性对含量结果的准确度具有很大影响，因此选择更简单㊁快速的提取方式，是进行脂溶性维生素检测所需要关注的重点方向㊂根据维生素Ａ㊁维生素Ｄ３和维生素Ｅ均溶于乙醇的物理特性，结合相似相溶原理，采用无水乙醇直接提取的方法进行含量测定，通过方法学验证结果说明该提取方法是可行的㊂３．３㊀检测波长的选择㊀根据文献报道，结合实际紫外可见全波段扫描发现，维生素Ａ㊁维生素Ｄ３㊁维生素Ｅ的最大吸收波长分别为３２５ｎｍ㊁２６５ｎｍ和２９０ｎｍ［９］，样品中维生素Ｄ３的占比较小，而且在２６５ｎｍ波长处维生素Ａ和维生素Ｅ具有较好吸收㊂因此，选择２６５ｎｍ吸收波长作为检测波长［１０－１１］，既降低了对检测器的要求，扩大了方法的适用性，又满足了三种维生素的检测灵敏度要求，最终达到了简化检测方法的目的㊂３．４㊀流动相的选择㊀采用ＨＰＬＣ法检测脂溶性维生素常用的流动相有甲醇㊁乙醇㊁乙腈㊁乙酸乙酯㊁异丙醇和水等组成［１２－１４］㊂本研究先后采用甲醇－水㊁乙腈－乙醇－水和梯度洗脱等方式，发现以甲醇为流动相Ａ，乙腈－乙醇－水（６０ʒ２５ʒ５）为流动相Ｂ，进行梯度洗脱时，维生素Ａ㊁维生素Ｄ３和维生素Ｅ能有效分离㊁峰型对称㊁无干扰，并且通过方法学验证结果说明该流动相是合适的㊂３．５㊀结论㊀ＨＰＬＣ法测定维生素ＡＤＥ注射液中维生素Ａ㊁维生素Ｄ３和维生素Ｅ含量方法可行，供试品溶液三个主峰的保留时间与对照品相应三个主峰的保留时间一致，样品分离效果较好，有很好的专属性㊁准确度㊁重复性㊁中间精密度㊁稳定性和耐用性㊂参考文献：［１］㊀ＳｎｉｄｅｒＤＢ，ＧａｓｋａＪ，ＧｏｃｋｏｗｓｋｉＤＥ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｎｅｗ⁃ｂｏｒｎｃａｌｖｅｓｔｏｉｎｊｅｃｔａｂｌｅｖｉｔａｍｉｎＡ，ＤａｎｄＥ．Ａｄｓａ－ａｓａｓ－ｃｓａｓＪｏｉｎｔＭｅｅｔｉｎｇ．２０１４．［２］㊀ＷａｌｄｎｅｒＣ．Ｗｅａｋｃａｌｆｓｙｎｄｒｏｍｅ．ＡｌｂｅｒｔａＢｅｅｆＰｒｏｄｕｃｅｒｓ．２００７，０７－０３４．［３］㊀ＳｎｉｄｅｒＤＢ，ＺｉｎｎＲＡａｎｄＳｔｕａｒｔＲＬ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｎｊｅｃｔａｂｌｅｆａｔ－ｓｏｌｕｂｌｅｖｉｔａｍｉｎｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ａｄｓａ－ａｓａｓ－ｃｓａｓＪｏｉｎｔＭｅｅｔｉｎｇ．２０１４．［４］㊀中国兽药典委员会．２０１７年版兽药质量标准化学药品卷［Ｓ］．㊀ＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ．ＱｕａｌｉｔｙＳｔａｎｄ⁃ａｒｄｓｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＤｒｕｇｓ，２０１７ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｈｅｍｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅＶｏｌ⁃ｕｍｅ［Ｓ］．［５］㊀中国兽药典委员会．中华人民共和国兽药典２０１５年版第一部［Ｓ］．㊀ＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ．ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａｏｆｔｈｅＰｅｏｐｌｅ＇ｓＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＣｈｉｎａ，２０１５ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔ１［Ｓ］．［６］㊀张志清，白琦，刘传波，等．ＨＰＬＣ法测定饲料原料中脂溶性维生素含量［Ｊ］．粮油加工，２０１０（７）：８６－８９．㊀ＺｈａｎｇＺＱ，ＢａｉＱ，ＬｉｕＣＢ，ｅｔａｌ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆａｔｓｏｌｕｂｌｅｖｉｔａｍｉｎｓｉｎｆｅｅｄｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｂｙＨＰＬＣ［Ｊ］．ＣｅｒｅａｌｓａｎｄＯｉｌｓＰｒｏ⁃ｃｅｓｓｉｎｇ，２０１０（７）：８６－８９．［７］㊀朱姜，张鹏，杨嘉，等．高效液相色谱－串联质谱法测定奶粉中维生素Ａ㊁维生素Ｄ㊁维生素Ｅ［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２０１５，２５（１１）：１７３３－１７３９．㊀ＺｈｕＪ，ＺｈａｎｇＰ，ＹａｎｇＪ，ｅｔａｌ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｖｉｔａｍｉｎＡ，Ｄ，ＥｉｎｍｉｌｋｐｏｗｄｅｒｂｙＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅａｌｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，２５（１１）：１７３３－１７３９．［８］㊀谭青松，付洁，何瑞国．高效液相色谱法测定鱼样中维生素Ａ㊁维生素Ｄ３和维生素Ｅ［Ｊ］．动物营养学报，２００７，１９（５）：６３６－６４０．㊀ＴａｎＱＳ，ＦｕＪ，ＨｅＲＧ．ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｖｉｔａｍｉｎＡ，ｖｉｔａｍｉｎＤ３ａｎｄｖｉｔａｍｉｎＥ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕ⁃ｔｒｉｔｉｏｎ，２００７，１９（５）：６３６－６４０．［９］㊀郭茂章，郭新东，罗海英，等．测定饲料添加剂中维生素Ａ㊁Ｄ３㊁Ｅ含量的新方法［Ｊ］．广东饲料，２００６，１５（３）：４２－４３．㊀ＧｕｏＭＺ，ＧｕｏＸＤ，ＬｕｏＨＹ，ｅｔａｌ．Ａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｏｆｄｅｔｅｒｍｉ⁃ｎａｔｉｏｎｏｆｖｉｔａｍｉｎＡ，Ｄ３，Ｅｉｎｆｅｅｄａｄｄｉｔｉｖｅ［Ｊ］．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＦｅｅｄ，２００６，１５（３）：４２－４３．［１０］张晓宇，侯磊，陈雪艳．ＲＰ－ＨＰＬＣ检测注射用脂溶性维生素（ＩＩ）中间品含量［Ｊ］．中国医药导报，２０１０，（１０）：８２－８３．㊀ＺｈａｎｇＸＹ，ＨｏｕＬ，ＣｈｅｎＸＹ．Ｃｏｎｔｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｄ－ｐｒｏｆｅｃｔｉｏｎｏｆｆａｔｓｏｌｕｂｌｅｖｉｔａｍｉｎｓ（ＩＩ）ｆｏｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎｂｙＲＰ－ＨＰＬＣ［Ｊ］．ＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＨｅｒａｌｄ，２０１０，（１０）：８２－８３．［１１］张慧，裴志东，初正云，等．ＨＰＬＣ测定注射用脂溶性维生素中４中成分的含量［Ｊ］．中国现代应用药学杂志，２００９，２６（６）：４８０－４８２．㊀ＺｈａｎｇＨ，ＰｅｉＺＤ，ＣｈｕＺＹ，ｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｆｏｒｆｏｕｒｃｏｍ⁃ｐｏｕｎｄｓｉｎｆａｔ－ｓｏｌｕｂｌｅｖｉｔａｍｉｎｆｏｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎｂｙＨＰＬＣ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｄｅｒｎＡｐｐｌｉｅｄＰｈａｒｍａｃｙ，２００９，２６（６）：４８０－４８２．［１２］徐萍蔚，徐海燕，潘澄，等．注射用复合维生素冻干粉针中１０种维生素的含量测定［Ｊ］．沈阳药科大学学报，２０１１，（６）：４４２－４４７，４５２．㊀ＸｕＰＷ，ＸｕＨＹ，ＰａｎＣ，ｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ１０ｋｉｎｄｓｏｆｖｉｔａｍｉｎｓｉｎｍｕｌｔｉｖｉｔａｍｉｎｆｏｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｈｅｎｙａｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１１，（６）：４４２－４４７，４５２．［１３］梅渲．超高效液相色谱法检测奶粉中的水溶性维生素和脂溶性维生素［Ｄ］．江西农业大学，２０１３．㊀ＭｅｉＸ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅｖｉｔａｍｉｎａｎｄｆａｔ－ｓｏｌｕｂｌｅｖｉｔａｍｉｎｉｎｍｉｌｋｐｏｗｄｅｒｂｙＨＰＬＣ［Ｄ］．ＪｉａｎｇｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉ⁃ｖｅｒｓｉｔｙ，２０１３．［１４］范菲，杨会鸽，周娜，等．ＨＰＬＣ法同时测定多维元素片中维生素Ａ和维生素Ｅ的含量［Ｊ］．西北药学杂志，２０１６，３１（６）：５９０－５９２．㊀ＦａｎＦ，ＹａｎｇＨＧ，ＺｈｏｕＮ，ｅｔａｌ．ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｖｉｔａｍｉｎＡａｎｄｖｉｔａｍｉｎＥｉｎｖｉｔａｍｉｎｓｗｉｔｈｍｉｎｅｒａｌｓｔａｂｌｅｔｓｂｙＨＰＬＣ［Ｊ］．ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，２０１６，３１（６）：５９０－５９２．（编辑：陈希）。

测定饲料中维生素A和维生素E含量方法的研究裘丞军;任玉琴【摘要】本文旨在建立一种能同时准确测定饲料中维生素A和维生素E含量的方法,试验将样品在碱性条件下65℃水浴超声皂化提取,冰乙酸调pH至中性,乙醇稀释后直接用高效液相色谱法(HPLC)进行测定.结果表明:维生素A在0.036～108 IU/mL线性关系良好,相关系数为1.00000,检出限1000 IU/kg,方法回收率为95.8％～98.8％,RSD为0.8％～4.4％(n=5);维生素E在0.6～125 μg/mL线性关系良好,相关系数为0.99998,检出限15 mg/kg,方法回收率为95.3％～102.2％,RSD为0.8％～ 4.2％(n=5).本方法快速简便,适用于配合料、浓缩料、维生素预混料和复合预混料中同时准确测定维生素A和维生素E的含量,相对于国标法节省了大量的时间和试剂,可应用于日常大批量饲料检测中.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2019(000)011【总页数】5页(P56-60)【关键词】高效液相色谱;维生素A;维生素E;饲料;皂化【作者】裘丞军;任玉琴【作者单位】浙江省兽药饲料监察所,浙江杭州311199;浙江省兽药饲料监察所,浙江杭州311199【正文语种】中文【中图分类】S816.17维生素A和维生素E是维持动物体正常代谢所必需的脂溶性维生素，具有促进生长，提高免疫力等作用，已经广泛应用于大规模畜禽养殖中。

在饲料添加剂中主要以维生素A乙酸酯和dl-α-生育酚乙酸酯的形式存在，并且通过各种壁材包被保护（杨优敏，2016）。

目前测定饲料中维生素A和维生素E的方法已有国家标准GB/T 17812-2008和GB/T 17817-2010，主要是皂化萃取法和甲醇直接提取法，还有碱性蛋白酶水解法（赵晓华等，2010）。

皂化萃取法操作步骤繁琐，时间长，消耗试剂多；甲醇直接提取法和酶解法结果不稳定，有些包被产品未能被有效提取。

分析与检测Oct 2018 CHINA FOOD SAFETY29现行的饲料中维生素A 、维生素D 3、维生素E（以下简称“VA、VD 3、VE”）的检测方法均为液相色谱法，其中VA 的检测方法为GB/T 17817-2010，定量限为1000IU/kg；VD 3检测方法为GB/T 17818-2010，定量限为500IU/kg；VE 的检测方法为GB/T 17812-2008，定量限为1IU/kg。

饲料原料中VA、VD 3、VE 含量在方法的定量限之下时，上述方法无法准确检出它们的含量。

虽然饲料原料中VA、VD 3、VE 的含量很低，但由于饲料原料的添加比例很大，因此饲料中VA、VD 3、VE 的总量十分很可观，故研究适用于饲料中VA、VD 3、VE 低含量的检测方法是一件十分有价值的工作。

1 研究内容1.1 优化前处理方法1.1.1 皂化反应溶液需先离心：皂化反应后的样液转移至离心管中，离心取上清液转移至分液漏斗中，防止样品残渣堵塞分液漏斗。

1.1.2 用石油醚代替乙醚：石油醚的提取效率和乙醚的提取效率基本相同，且因为石油醚的毒性低于乙醚，因此用石油醚代替乙醚。

1.2 考查线性相关性用甲醇溶液配置VA、VD 3、VE 工作液，其系列浓度分别为0.1IU/L、0.5IU/L、1.0IU/L、5.0IU/L、20.0IU/L、100IU/L。

相同条件下，用串联质谱检测上述曲线各点的峰面积，VA 的浓度与峰面积的相关系数为0.9998，VD 3的浓度与峰面积的相关系数为0.9999，VE 的浓度与峰面积的相关系数为0.9995。

1.3 净化小柱的选择根据VA、VD 3、VE 的性质特点，应选取吸附特性为非极性的净化小柱。

经查阅资料，选择安捷伦公司提供的Bond Elut ENN、Bond Elut LMS、Bond Elut ENV、Bond Elut PLEXA4种净化小柱。

笔者分别考察并进行了VA、VD 3、VE 过净化小柱的回收率，其中，Bond Elut PLEXA 净化小柱VA、VD 3过柱回收率达到99%，VE 过柱回收率达到93%。

饲料中维生素A的测定方法解析作者：谈暠媛鲁小翠来源：《湖北畜牧兽医》2014年第12期摘要：针对饲料中维生素A含量的检测方法-HPLC进行了详细的解析，对各个步骤应该注意的事项进行了归纳总结，为饲料中维生素A的含量检测提供参考意见。

关键词：维生素A；皂化法；高效液相色谱中图分类号：S816.2 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）12-0062-01维生素是动物所需的五大营养素之一。

其中维生素A的主要营养作用有：维生素A是视紫红质（感光色素）的重要组成成分，维持正常视觉功能；维生素A可保护上皮组织，防止上皮细胞萎缩、角化，保护呼吸道、消化道、生殖泌尿器官黏膜，利于公畜精子生成；增强动物免疫力，促进骨骼发育。

维生素A的化学名是视黄醇，呈淡黄色油状物，易氧化，遇光易变质。

在饲料中的维生素A是通过附着在一定载体上以视黄醇乙酸酯或视黄醇棕榈酸酯的形式添加进去的[1，2]。

1 方法解析目前检测饲料中维生素A的含量主要是分为皂化法[3]和直接提取法。

直接提取法主要适用于维生素预混料，定量限较高。

皂化法一般适用于维生素A含量较低的配合料、浓缩料及复合预混料。

针对GB/T 17817-2010 《饲料中维生素A的测定高效液相色谱法》中第一法皂化提取法提出几点见解。

皂化法分为以下几个步骤：皂化—提取—水洗至中性—浓缩—过膜—供高效液相色谱法检测。

1.1 皂化皂化是指在碱性环境下，油脂被水解生成羧酸盐和醇的反应。

由于维生素A在酸性环境下不稳定，在碱性环境下稳定，易氧化，耐热性好。

所以维生素A的皂化步骤是在碱性环境下，加入抗氧化剂抗坏血酸，在沸水浴上回流30 min，将维生素A提取出来，将其他成分转化成可溶于水的成分。

需注意的是：①L-抗坏血酸乙醇溶液易氧化，所以最好临用新配；②在回流过程中需不时振荡皂化瓶，防止试样粘附瓶壁，导致皂化不充分；③皂化结束时用5 mL 无水乙醇和5 mL水自冷凝水顶端冲洗其内部，将附在冷凝管内壁上的蒸汽水滴冲洗下去。

高效液相色谱法检测饲料中维生素a的方法步骤高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析方法，适用于维生素A等化合物的检测。

下面是使用HPLC法检测饲料中维生素A的方法步骤：1. 样品准备：将饲料样品取出一定量，加入适量的有机溶剂进行提取。

常用的有机溶剂有甲醇、乙醇等。

提取条件可根据实际需要进行优化，如提取时间、提取剂量等。

2. 过滤样品：使用0.45μm的微孔膜过滤器将提取液过滤，以去除杂质和固体颗粒，得到清晰的样品溶液。

3. 样品进样：将过滤后的样品溶液注入到高效液相色谱仪系统的进样器中。

进样器可选用自动进样器，可以提高分析效率和减少人为误差。

4. 色谱柱选择：选择适合维生素A分析的色谱柱，常用的色谱柱有反相色谱柱、正相色谱柱等。

反相色谱柱常用的填料材料有C18、C8等。

5. 色谱条件设置：设置适宜的流动相体系，常用的流动相为甲醇/水。

可根据实际需要优化流动相的组成和流速，以提高分离和检测效果。

6. 检测条件设置：设置适宜的检测波长，维生素A在紫外光区域有较好的吸收峰。

常用的检测波长为325nm。

7. 样品分离：通过色谱柱将样品中的维生素A与其他组分分离。

根据色谱柱和流动相的选择，可以调整梯度洗脱等条件，以提高分离效果。

8. 维生素A定量：根据标准曲线，通过峰面积和浓度的线性关系，计算饲料样品中维生素A的含量。

标准曲线可通过一系列已知浓度的维生素A标准溶液进行建立。

9. 数据处理：对得到的色谱图进行峰识别和集成，计算得到维生素A的含量。

可以使用色谱软件进行自动数据处理和结果输出。

以上就是使用高效液相色谱法检测饲料中维生素A的方法步骤。

HPLC法具有灵敏度高、分析时间短、准确度高等优点，可用于快速、精确地确定饲料中维生素A的含量，为饲料生产质量控制提供科学依据。