微生物限度检查法(2).控制菌检查方法验证讲义

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方法验证的步骤与内容 1、制备验证试验用菌液 按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用 菌液的制备方法将规定需用的试验菌分别制成每毫 升中含10～100个菌（CFU）的供试菌液。 2、样品的前处理方法 样品的前处理方法是验证试验的一部分，需证明所 用的处理方法对各试验菌的生长无影响。 根据供试品的性状，选用以下适宜的方法，或几种 方法联合使用： 溶解：验证所用溶液、助溶剂和水浴助溶温度对微 生物的生长无影响。
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乳化：验证所用乳化剂和水浴助溶温度的有效性、 使用量及对微生物的生长无影响。 破乳：验证所用破乳剂的有效性、使用量及对微生 物的生长无影响。 萃取：验证有机相选择的合理性、有效性及对微生 物的生长无影响。 稀释：验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释倍 数。 离心：验证所用转速、时间和微生物的分布情况。 应说明采取某种前处理方法的原因，如样品不需要 特别的前处理就能制成均匀的供试液，这一步可以 省掉，直接进入确定样品有无抑菌性的步骤。
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选择适当的方法消除或有效降低供试品的抑菌性 根据供试品的特性选择药典规定的消除其抑菌性的 方法（一种或几种方法联合），或根据药物的化学 特性，寻找出其他合理、有效的方法，特别是有效 的中和剂；并通过模拟试验（验证试验）对消除或 降低抑菌性的效果进行检验。 无菌检查可采用：①薄膜过滤法；②中和法（目前 药典仅收载β-内酰胺酶处理法）。 ①薄膜过滤法适用于液体供试品和可溶于水的固体 供试品（只要许可，应首先采用）。验证的重点是 确定滤膜的适用性、确定冲洗的方法和冲洗液的用 量。
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方法验证中应注意的问题与评价要求 1、验证试验的完整性 验证试验的完整性与方法的科学性密切相关，验 证工作不完整，就不能全面体现供试品和试验过 程对微生物的影响情况，则很可能影响或干扰对 最终试验结果的判断。故应按照中国药典2005年 版的要求进行方法验证。特别是对某些具有抑菌 性的供试品，需采取适当的方法消除或有效降低 供试品的抑菌性。在对供试品进行特殊处理时， 既要考察供试品的抑菌性，还要考察在供试液制 备过程中微生物受影响的程度（稀释剂对照组） 。

微生 物 限 度 检 查 法 是 检 查 非 规 定 灭 菌 制 剂 及 其 原 、 料 受 微 生 物 污染 程 度 的 方 法 ， 查 项 目包 括 细 菌 辅 检 数 、 菌 数 、 母 菌数 及 控 制菌 检查 。与 《 国药 典 》 霉 酵 中
２０ ０ ０年 版 （ 下 简 称 ２ ０ 以 ０ ０版 ） 比 ，０ ５版 微 生 物 限 度 相 ２０ 检 查 法 在 以 下 几 方 面 进 行 了增 修 订 。 １ 标准的制订原则 ：
２ 标 准的分类 ：
微 生物 试 验 的 结 果 易 受 试 验 条 件 的 影 响 ， 别 是 特
药 品 中 含 有 对 微 生 物 生 长 有 抑 制 作 用 组 分 时 表 现 较 为 突 出。 因 此 ， 进 行 微 生 物 限 度 检 查 时 ， 保 证 在 检 验 在 应 条 件 下 的样 品 浓 度 不 足 以抑 制 污 染 微 生 物 的 生 长 ， 以 保 证结 果 的 准 确 性 。所 以 任何 产 品 的 微 生 物 限 度 检 查 法 均需 验 证 ， 认 所 采 用 的 方 法 适 合 于 样 品 的 微 生 物 确 限 度 检 查 ， 可 使 用 。为 此 ，０５年 版 ＜ 国药 典》 录 方 ２０ 中 附
维普资讯
２ ０ 年 ６月 ０８
《 国 药 典 》 生 物 限 度 检 查 法 及 其 方 法 学 验 证 中 做
６ ５
《 国药 典》 生 物 限度 检 查 法及 其 方 法 学 验 证 中 微
肖庆 青
（ 西 省 医药 学 校 江西 南 昌 ３００ ） 江 ３２０
中 的微 生 物 限 度 Fra bibliotek 查 法 增 加 了方 法 验 证 试 验 的要 求 。

(1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养 物至 10ml营养肉汤中，35～37℃培养 18～24 小时，取此培养液 1ml加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-5～10-7， 使菌数约为 50～100cfu/ml。
(2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至 10ml改良马丁培养基中，23～ 28℃培养 18～24 小时，取此培养液 1ml加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml， 采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-5～10-7，使菌数约为 50～100cfu/ml。
表 2 稀释剂对照组回收率测定结果
阳性菌
大肠 埃希菌
实验次数 1 2 3
菌液组菌落数
稀释剂对照组菌落数 回收率％
1
枯草芽
2
孢杆菌
3
1
金黄色
葡萄球
2
菌
3
1
白色
2
念珠菌
3
1
黑曲
2
霉菌
3
注：
稀释剂对照组平均菌落数
回收率 ＝
× 100％
菌液组平均菌落数
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微生物限度检查方法的验证
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微生物限度检查方法的验证
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11.2 供试液需用特殊制备方法（如加中和剂或乳化剂等) 11.2.1 常规法 菌液组：1ml 菌液 /平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 1ml /平皿，平行 2 个平皿（计算供 试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液 1ml+ 1ml 菌液/平皿，平行 2 个平皿（计算 供试液平均菌数：A） 稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂 + 1ml 菌液，平行 2 个平皿 （计算供试液平均菌数：D） 试验组回收率=(A－B)÷C×100% 稀释剂对照组回收率=D÷C×100% 11.2.2 培养基稀释法（5 个平皿） 菌液组：1ml 菌液/平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 1ml 分别注 5 个平皿，0.2ml /平皿， 平行 2 份，共 10 个平皿（计算 0.2ml 供试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液 0.2ml+ +加中和剂或乳化剂 1ml 菌液/平皿， 平行 2 个平皿（计算平均菌数：A) 试验组回收率=(A－B)÷C×100% 稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂+ 1ml 菌液，平行 2 个平皿（稀 释剂对照组与试验组同法操作）（计算平均菌数：D) 稀释剂对照组回收率=D÷C×100% 11.2.3 供试液需用特殊制备方法（离心沉淀法） 菌液组：1ml 菌液 /平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 10ml +离心，500rpm 离心取上清，

检验时，应从2个以上最小包装单位中抽 取供试品，膜剂还不得少于4片。一般应 随机抽取不少于检验用量（两个以上最小 包装单位）的3倍量供试品。
（七）微生物限度标准
非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药 途径和对患者健康潜在的危害以及中药的特殊性而制 订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，中药 提取物及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准 复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微 生物限度均以本标准为依据。
（二）药物制剂的微生物检查的意义
1
确定药物是 否污染或其 污染程度， 控制药品的 质量；
2
保证用药的 有效性和安 全性；
3
可作为衡量 药品生产全 过程卫生质 量的指标之 一。
（三）微生物限度检查的内容
1．微生物总数检查 包括细菌数、真菌数及酵 母菌数检查。
2．控制菌检查 包括大肠埃希菌、沙门菌、铜 绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及 梭菌的检查。
2.控制菌检查常用的培养基： 用于菌液制备的营养琼脂培养基等常规培养基 胆盐乳糖培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基等20余种用于培养 基适用性检查、方法验证试验及供试品检查的培养基。
三、菌种及培养基
白色念珠菌 玫瑰红钠琼脂培养基
大肠埃希菌 曙红亚甲蓝琼脂培养基
四、 方法的验证试验
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四、方法的验证试验
（一）细菌数、真菌数及酵母菌计 数检查
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（一）细菌、霉菌及酵母菌计数
检测的是药物在单位质量或体积内 所存在的活菌数量。可评价生产过 程中原辅料、设备、器具、工艺、 环境及操作者的卫生状况。
（一）细菌、霉菌及酵母菌计数
1．计数培养基的适用性检查
细菌、真菌及酵母菌计数用培养基应进行 培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培 养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。

组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。 试验组的菌数回收率均不低于70%
试验组菌数回收率
试验组平均菌落数 - 供试品对照组的平均菌 菌液组平均菌落数
落数
五、控制菌检查方法验证
环境条件：C级下的局部A级的单向流空气区域 培养基和培养基试验： 无菌性 促生长能力——在最短时间内观察到明显生长 抑制能力——在培养的最长时间内不能观察到微生物的生长 指示能力——在规定的时间内必须和以前检验过并已接受的培养基在
外观和指示反应都具备可比性。 Nhomakorabea、控制菌检查方法验证
方法验证： 按照各品种项下规定检查的控制菌选择验证菌株。 规定量供试液+10~100cfu试验菌+增菌培养基 合格标准：检出试验菌
六、无菌检查方法验证
环境条件：B级下的局部A级的单向流空气区域 培养基： 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基
四、总菌落数检查方法验证
方法验证——对细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：
——进行3次独立的平行试验，分别计算各组回收率。
（1）试验组
最低稀释级供试液1ml +
试验菌50~100cfu
平皿法计数 2个琼脂培养基平皿
薄膜过滤法计数
取规定量的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中 加试验菌50~100cfu，过滤。
降低抑菌剂的浓度以消除抑菌性。 三、薄膜过滤法
抑菌性产品通过滤膜时，微生物被截留在膜上，检品被过滤掉。 ——微生物检查法准确与否的核心是对抑菌性的有效消除
四、总菌落数检查方法验证
环境条件：C级下的局部A级的单向流空气区域
培养基种类：
细菌计数
营养琼脂培养基
霉菌和酵母菌计数

药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。

细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。

特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。

2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。

（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。

（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。

6. 写出验证资料。

示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。

2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。

霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。

2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。

微生物控制菌检查方法验证方案一、背景介绍在制药、食品、医疗器械等行业中，微生物控制是非常重要的环节之一。

为了确保产品的安全性和合规性，对微生物的检查方法进行验证就显得尤为重要。

本文旨在提出一种可行的微生物控制菌检查方法验证方案。

二、方法验证目的本方案的目的是验证微生物控制菌检查方法的准确性、重复性、中间值和检测限度等关键指标，以确保该方法在实际应用中的可靠性。

三、验证方案1. 选择验证样品- 针对待验证的微生物控制菌检查方法，选择适当的微生物控制菌株作为验证样品。

验证样品应包含革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌等常见微生物类型。

- 确保验证样品的纯度和活性，并按照国际、行业规定的标准方法进行检测。

2. 实验设计- 确定验证实验的设计方案，包括样品分组、样品数量、重复次数等。

- 考虑到实验条件对验证结果的影响，应合理设置对照组和正试验组。

3. 数据采集与处理- 在验证实验中，记录样品的检测结果、测试方法和环境因素等重要信息。

- 利用统计学方法对验证结果进行分析，计算实验数据的平均值、标准差、变异系数等，并进行显著性分析。

4. 验证指标- 准确性：评估该微生物控制菌检查方法的准确性，即其与已知标准方法结果的一致性。

- 重复性：通过对同一样品在相同条件下进行多次测试来评估方法的重复性，计算重复测定之间的变异程度。

- 中间值：通过对同一样品在不同批次进行测试来评估方法的中间值，计算不同批次之间的变异程度。

- 检测限度：确定该方法能够可靠地检测到微生物的最低浓度水平。

五、验证结果分析根据数据采集和处理的结果，对所验证的微生物控制菌检查方法进行评估，如准确性、重复性等指标是否符合要求。

若验证结果不符合要求，则需对该方法进行优化或调整，重新进行验证。

六、验证报告根据验证结果编写验证报告，并包括实验设计、数据采集与处理、验证结果分析等内容。

报告应具备准确性、完整性和清晰度，以便他人能够理解和复现验证过程。

七、验证结果的应用验证结果应用于实际微生物控制菌检查方法的应用中，作为判定产品合格与否的依据。

微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。

验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。

3.规性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。

4.验证实施：4.4.1 试验前的准备:4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。

4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周使用。

4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周使用。

4.4.2 试验菌的制备和稀释：4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。

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2）保持供检样品的原污染状态
对供检样品提供原始污染状况的微生 物检查数据是限度检查的基本任务。
药品的第二次污染及繁殖或死亡引起 的状态改变均不能反应药品的微生物真实 质量。
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3）按规定抽样检验
由于药品染菌的随机性和不均匀性， 欲从小量抽样检验反映整批药品的染菌状 况是不可能的。
由于微生物限度检查是破坏性检查， 检验一瓶破坏一瓶，增加抽验量及检验数 量对提高检出率无疑是有利的，但抽量过 多，生产、经营单位难以承受。
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(2)高压蒸汽灭菌物品：为最可靠、最 广泛使用的灭菌方法之一。凡是耐高 温和潮湿的物品如培养基、无菌衣、 金属、玻璃器材、陶瓷制品、传染性 污物等可用本法灭菌。将需要灭菌的 物品于0.11MPa, 121℃灭菌15分钟后 方可使用。
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三、 培养基的处置
（1）培养基的配制 一般采用商品脱水培养基，按照使用
①平皿法 系列稀释供试液，分别加入灭菌 平皿中，然后倾注琼脂。
②涂布法 将系列稀释的供试液分别涂布于 已事先备妥的琼脂平板上
③薄膜过滤法 将供试液用薄膜过滤，取出 滤膜贴于琼脂平板或其它培养基中。
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（2）控制菌检查：测定单位重量（体积或面 积）药品中的粪便污染指示菌和某些特定 菌，如大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄 球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、白色念珠菌、 螨等在规定量的样品中不得检出或不超过 某限度。
因此药典规定了检验量和数量。
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4）适宜的供试液制备方法
正确制备供试液是保证检查结果可靠 的前提条件，供试液制备的基本要求是， 供试品必须均匀分散于供试液中，被检菌 应受到必要的保护。
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一概述：通过验证以确认所采用的微生物限度检测方法适合于湖南金旺稀贵药业有限公司所生产原料药的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于所生产原料药的控制菌的检查。

根据样品特性制定检验方法和检验条件按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。

二目的：通过验证确认所采用的方法适合于所生产原料药的微生物限度的测定。

三适用范围：本方案适用于本公司生产的四种原料药的微生物限度检验方法的验证。

四责任人：验证小组成员及相关人员。

五验证方案内容：1.大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲菌、白色念珠菌为验证用菌株。

大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，这三种菌株为细菌计数验证用菌株；黑曲菌为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌和酵母菌计数验证用菌株。

验证用菌株的传代次数不得才超过5代。

细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证1.1当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适用于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。

验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌级数同时进行。

1.2 验证菌菌液制备1.2.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养琼脂培养基中，35～37℃培养18～24小时。

取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6～10-7，制成每1ml 含菌数50～100cfu的孢子悬浮液。

1.2.2 白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～28小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法稀释至10-6～10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu的孢子悬浮液。

1.2.3 黑曲菌菌液制备：接种黑曲菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，制成每1ml 含数50～100cfu的孢子悬液。

药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。

细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。

特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。

2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。

（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。

（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。

6. 写出验证资料。

示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。

2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。

霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。

2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。

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以上表明抽样方法、抽样数量、抽样次数均影响测定结果。以控制菌检验为例，决定染菌 检出与否必须具备两个条件：（A）样品是否是含染菌的样品；（B）检验操作正确无误， 其中（A）是前提条件。
中国药典2000年版关于抽验方法与抽样数量规定：供试品为随机抽样，一般抽样量为检 验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量。对异常的供试品应针对性的抽样，对外观可 疑污染或对有争议复验的样品应抽取可以污染和有争议复验的原样品。对异常的供试品应 针对性的抽样，对外观可疑污染或对有争议复验的样品应抽取可以污染和有争议复验的原 样品。 凡能从药品、瓶（外盖内侧及瓶口周围）外观看出发霉、生虫以及变质的药品不必再继续 检验，应直接判为不合格。不能以有时外观有上述情况而检验内容为合格，来判定该药品 合格，因为瓶口染菌，对服用者是不安全的，如自瓶口直接服药时，所染菌随之进入人体， 同时发现瓶口一旦染菌，瓶内药液最终要受到污染。 检验量与抽样量是两种不同范畴的量，后者指从全批产品
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实验所用的培养基
营养琼脂培养基
玫瑰红钠琼脂培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD） 胆盐乳糖培养基（BL）
4－甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基（MUG）
乳糖培养基
5％乳糖培养基
蛋白胨水培养基
磷酸盐葡萄糖胨水培养基
枸橼酸盐培养基
曙红亚甲蓝琼脂（EMB）
麦康凯琼脂（MacC）
营养肉汤
称量纸、手术镊子、剪子等………… ………………...干热灭菌的物品 2． 开启无菌室紫外杀菌灯和空气净化装置，并使其工作不少于30分钟。 3． 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1％ 苯 扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩。

微生物限度检查法及其方法学验证摘要:本文从四个方面介绍2005版微生物限度检查法增修订内容,重点介绍细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的方法验证,提请申报单位注意在后续品种的研发和申报过程中对所采用的微生物限度检查法进行方法学验证,以增加试验方法的完整性、保证检验结果的可靠性.关键词:微生物限度检查法方法学验证微生物限度检查法是检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法,检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查.与2000版相比,2005版微生物限度检查法在以下几方面进行了增修订.一、标准的制订原则:2000版微生物限度法标准细菌数、酵母菌数和霉菌数按剂型制订,控制菌按给药途径制订.由于同一剂型有不同的给药途径,且随着新剂型的不断出现,按剂型制订标准具有局限性.2005版均按给药途径制订,解决了这一局限性,不会因剂型的改变而带来执行标准的混乱.二、标准的分类:分为三大类,即制剂通则项下规定；口服给药制剂；局部给药制剂,其中化学药部分(二部)包括:1、制剂通则、品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂；2、口服给药制剂3、局部给药制剂:眼部给药制剂；耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂；阴道、尿道给药制剂；直肠给药制剂；其他局部给药制剂.中药部分(一部)包括:1、制剂通则、品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂；2、口服给药制剂:不含药材原粉的制剂；含药材原粉的制剂；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂；3、局部给药制剂:用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂；用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂；眼部给药制剂；耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂；阴道、尿道给药制剂；直肠给药制剂；其他局部给药制剂.三、微生物限度检查方法的增修订:1、明确了环境检测执行的标准和方法,洁净度要求及洁净度定期检查；2、检验量:随机抽取不少于检验量(两个以上最小包装单位)的3倍；贵重、微量样品检验量可酌减；要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml；3、供试液制备:表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性及对微生物生长和存活无影响；供试液从制备至加入检验用培养基不得过1小时；供试液体积为100ml；非水溶性供试品:增加“十四烷酸异丙酯法”；结肠溶制剂的供试品:用pH为7.6无菌磷酸盐缓冲液溶解；具抑菌活性的供试品:增加方法的可操作性.4、灭菌:培养基及稀释剂采用验证合格的灭菌程序进行灭菌.5、稀释剂:增加pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液、pH 6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH 7.6无菌磷酸盐缓冲液；6、细菌、霉菌及酵母菌计数；7、控制菌检查:新增大肠菌群检查法、梭菌检查法.四、微生物限度检查法的验证:微生物限度检查法验证的目的是确认所采用的方法是否适合于供试品的微生物限度检查.验证的内容包括准确性(回收率)、专属性.验证的类型分为前验证(建立微生物限度检查法时的验证)和再验证(修订检验方法后、供试品组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时、定期的方法验证),根据检查方法的不同,又分为细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的验证.1、细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证验证试验至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率.验证菌株为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌.菌种要求不得超过5代,菌液制备为50－100cfu/ml.验证方法分试验组、菌液组、稀释剂对照组、供试品对照组,具体方法如下:1)试验组:平皿法计数时,取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数.薄膜过滤法计数时,取规定量试验可能用的最低稀释级供试液,过滤,冲洗,应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌,过滤,按薄膜过滤法测定其菌数.2)菌液组:测定所加的试验菌数.3)稀释剂对照组:若供试液制备需要分散、乳化,中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度.试验时,可用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml 供试液含50～100cfu,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数.4)供试品对照组:取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数.5)结果判断指标:计算供试品组的菌回收率、稀释剂对照组的菌回收率.A、在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%.B、若试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%,按此该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数.C、若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新验证.2、控制菌检查法的验证试验菌株按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株.大肠菌群检查用大肠埃希菌；梭菌检查用生孢梭菌.阴性对照菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌用大肠埃希菌；大肠埃希菌、沙门菌、大肠菌群用金黄色葡萄球菌.菌种的要求:不得超过5代.菌液制备为10～100cfu.验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行.验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行.具体如下:1)试验组:取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中,依相应控制菌检查法进行检查.当采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,试验菌应加在最后一次冲洗液中,过滤后,注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中.2)阴性菌对照组:设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性,方法同试验组检出.3)结果判断:阴性菌对照组不得检出阴性对照菌.若试验组检出试验菌,按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查.试验组未检出试验菌,应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新验证.我们在审评工作中发现部分制剂本身具有抑菌或杀菌作用,如某些眼用软膏剂,某些含生物碱的中药复方制剂等,所制备的供试液本身具有影响微生物生长的作用,若不经方法学验证,难以保证所采用方法的适合该供试品的微生物限度检查,难以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性.以上介绍2005版微生物限度检查法增修订内容,重点介绍细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的方法验证,提请申报单位注意在后续品种的研发和申报过程中对所采用的微生物限度检查法进行方法学验证。

微生物控制菌检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物控制菌检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的本实验是关于的微生物控制菌检查试验的验证。

验证结果应显示的微生物控制菌试验方法，对检品中可能存在的微生物没有抑制作用，符合验证要求。

1.2原理按照已建立的药品微生物控制菌检查方法，通过已知菌数试液的对照菌的培训对照，验证其操作方法适合该药品的微生物控制菌的检测的正确性。

2.验证方法步骤2.1验证前的准备：将所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。

试验菌应选择相应的阴性对照菌。

2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品按照微生物控制菌检测方法进行平行试验，通过观测是否长菌来判断。

2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物控制菌检查试验对检品中微生物的抑菌性。

试验结果应显示；阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，试验组应检出试验菌。

3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。

3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。

环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。

操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于5pa。

3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。

3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。

3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径0.45um直径50mm）、无菌培养皿（直径90mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法4.1试验菌种的制备和稀释接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至相应的营养肉汤或BL增菌液10ml中,30～35℃培养18～24小时。

- 表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及 对微生物的生长和存活无影响。
- 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小 时。
- 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。 - 供试液的体积：100ml。
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稀释剂（ 中国药典2005版）
（1） 氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 （2） 无菌磷酸盐缓冲液 （3） 无菌磷酸盐缓冲液
中国药典2005版
菌株名称
CMCC编号
大肠埃希氏菌(E. coli)
CMCC(B)44102
金黄色葡萄球菌(Sta. aureus) CMCC(B)26003
枯草芽孢杆菌（Bac. subtilis）
CMCC(B)63501
白色念珠菌(Can. albicans) 黑曲霉菌(Asp. niger)
CMCC(F)98001 CMCC(F)98003
一次检出为准
第一次结果超过规定标准，复 试两次，三次结果平均报告
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
一次检出为准
测定结果在规定的限度标准5 倍以内均为合格
6
验证目的
- 在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样 品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采 用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检 出。
过滤
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
菌种组：
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
过滤
空白样品组：
过滤
计数A 计数B （阴性对照） 计数C （阳性对照） 计数D
- 充分验证样品（药品）本身对微生物生长的影响。
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验证目的
确认一种检验方法。 验证实验 检验条件