核酸检测在血液筛查中的应用PCR(新).ppt

答
采样后请立即将拭子放入采样管中，并旋紧管盖。
操作演示与学员练习
操作演示
通过PPT展示或现场演示的方式，向 学员展示正确的鼻咽拭子采集方法。
学员练习
在指导老师的监督下，学员分组进行 鼻咽拭子采集练习，确保掌握正确的 操作方法。
03
口咽拭子标本采集方法
口咽拭子采集部位及操作要点
采集部位：口咽部， 包括咽后壁、扁桃体 隐窝及侧壁等部位。
单独处理。
06
总结回顾与考核评估
总结回顾本次培训内容要点
01
02
03
04
新冠病毒核酸检测的基本原理 和重要性
标本采集的种类、方法和注意 事项
标本保存、运输和处理的规范 操作
实验室生物安全和个人防护措 施
考核评估学员掌握情况并反馈结果
针对学员提出的问题和困惑进行 解答和指导
根据考核结果，对学员进行针对 性的指导和建议，帮助其进一步 提高操作技能水平
操作演示
通过PPT展示口咽拭子采集的详细步 骤，包括采样前准备、采样部位选择 、采样操作及标本保存等。
学员练习
在模拟人上进行口咽拭子采集操作练 习，确保每位学员都能熟练掌握采集 方法。同时，学员之间可相互监督、 指正操作中的不足之处，共同提高操 作技能。
04
血清标本采集方法
血清标本采集部位及操作要点
采样人员应站在患者侧 方，让患者头部微仰， 用拭子贴鼻孔进入，沿 下鼻道底部向后缓缓深 入，由于鼻道呈弧形， 不可用力过猛，以免发 生外伤出血。
待拭子顶端到达鼻咽腔 后壁时，轻轻旋转一周 （如遇反射性咳嗽，应 停留片刻），然后缓缓 取出拭子，将拭子头浸 入含2～3ml病毒保存液 的管中。
注意事项与常见问题解答

36
34
32
30
CT
28
26
24
22
20 0.001
Sample
y = -1.2908Ln(x) + 27.187 R2 = 0.997
0.010
0.100
1.000
(Log N) initial concentration
10.000
100.000
DNA标准品扩增图
50 ng/ µL
Smaller the CT number the more DNA detected
约40％
假基因
基因片段
内含子，非翻 译序列
串联重复序列/ 成簇重复序列
散在重复序列
人类基因组的组织成分
DNA指纹技术基本流程图
DNA指纹图的遗传规律
遗传方式：子代图谱中所有的片段都可以在双亲的图谱 中找到，片段的传递符合孟德尔遗传规律。
个体的组织同一性：即来源于身体不同部位与类型的组 织，其DNA指纹图谱是一致的。
Threshold – 即能够检测到的荧光信号域值，通过比较不
同样品达到域值所需的循环数，从而可以比较不同样品的 浓度。
CT (Cycle Threshold) -在荧光定量PCR技术中，有一
个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表 threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到 达设定的域值时所经历的循环数。
STR分析个体基因型原理
引物
AATG AATG AATG
7 repeats
引物
引物
引物
8 repeats
重复单位的不同决定了个体之间的特异性
纯合子 = 双等位基因等长 杂合子 = 双等位基因不等长

PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
第一代：手动/机械手式水浴基因扩 增
➢ 用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在 三个温度：PCR的高温变性温度（如94℃）低温复 性温度（如58℃），适温延伸温度（如72℃）。 再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在不同 温度的水浴箱中依次水浴。
➢ 核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。 DNA和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA 所含的戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而 RNA含脲嘧啶U。
➢ 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是
单核苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一
➢ 这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易 因疲劳引起差错P；CR技术而及临优床应用点原、理新是冠病毒:核设酸检备测 简单，投资少，
第二代：自动化控制型PCR
使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电 泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操 作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风 险大等不足。且无法对起始模板准确定量， 无法对扩增反应实时检测。
➢周而复始的升降温度进行扩增，每 PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
PCR扩增步骤
➢DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA 模板在热作用下，氢键断裂，形成 单链DNA。
➢退火（25℃-65℃）：系统温度降 低，引物与DNA模板结合，形成局
PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理
PCR扩增示意图
➢ 因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突 变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结 果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测 原理

4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824 9
荧光PCR的原理
10
PCR技术的特点
灵敏度高 特异性强 快速简便 应用范围广
11
Ct值的意义
FQ-PCR
Ct值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行96次
扩增
Ct值与浓度 不同的模板达到荧光域值时的Ct
值不同
12
荧光定量PCR的临床应用
28
HCV
(二) HCV-RNA定量检测的临床意义
1. 早期诊断 a. 临床以< 80 copy/ml做为无感染或治愈标准。 b. HCV感染1-3W，即可检出HCV-RNA的存在。 c. 严格筛选献血员 ,提高对窗口期感染者的检出率。
HBV
5. HBsAb (＋) 、 HBcAb (＋) 、 HBeAb (＋)三抗体阳性 与HBV DNA 2.5× 103 copy /ml 结果解释。
24
HBV
(三) HBV-DNA定量检测的临床意义
1. HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性
2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效
a. 专家提出<103 copy /ml做为阴性或临床治愈标准 b. HBV-DNA定量分析与干扰素治疗(前、中、后) c. 拉咪呋啶
一般不存在于血循环中
HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM
提示HBV处于复制状态
HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好
22
HBV
（二） HBV-DNA与“两对半” 1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；

28
多重PCR（multiplex PCR）
Multiplex PCR: How
• Same as regular PCR • Care in primer design
– Much greater chance of primer-dimers – Much greater chance of artifacts – Annealing temperatures must be close
……
26
2.1 多重PCR（multiplex PCR）
多重PCR（multiplex PCR）:What
• PCR using several primer pairs SIMULTANEOUSLY
• Typically generates a product band for each primer pair
21
PCR的扩增？
22
The first cycle
The second cycle
How does PCR work
23
The third cycle
The fourth cycle
24
How does PCR work
2. PCR的类型
25
1. 多重PCR（multiplex PCR） 2. 巢式PCR（nested PCR） 3. 定量PCR（quantitative PCR） 4. 不对称PCR（asymmetric PCR） 5. 反向PCR（inverse PCR） 6. 逆转录PCR（reverse transcription PCR） 7. Overlap PCR
平台期
平台期
基线期
Cycle（循环数）
39

三、PCR技术简介
➢ 高温可以使双链DNA解链成为单链，这一过 程称为变性。
➢ 变性后的DNA通过降温可以重新接合为双链， 这一过程称为复性。
➢ PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过 程，它的特异性取决于与靶序列两➢ 设计引物作为启动序列，加入DNA聚合酶、
➢ 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷 酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合 成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延 伸，DNA的含量既增加一倍。
PCR扩增示意图
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 12
二、PCR的发展史
➢ 1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开 启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物化学, 分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的迅速发展。
➢ 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
➢ 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其 扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望 的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。
24
38
4 16
5 32
30次循环后靶序列扩增6的数量64
20 1,048,576
常用的ＰＣＲ技术
➢ 定性ＰＣＲ 电泳检测、放射自显影 特异性差、易污染、只能定性
➢ ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ 特异性较好，极易污染、定量不准确
➢ 终点法荧光ＰＣＲ 特异性很好，不易污染，定量线性范围小，重复性不好
➢ 实时荧光ＰＣＲ 特异性很好，不易污染，线性宽重复性较好
和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA所含的 戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧 啶U。 ➢ 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核 苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为 戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。

经过治疗后的HBsAg转阴，ELISA方法 检测阴性的献血者。
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3
NAT与ELISA互补
病毒变异 免疫静默期 实验操作失误 病毒感染的窗口期
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4
病毒检测窗口期
项目 HBsAg 抗-HCV 抗-HIV
ELISA窗口期 项目 NAT窗口期
56
HBV 25
72
HCV 59
22
《全国艾滋病检测技术规范》用于核酸定性检 测时，采集的抗凝全血应在48h内分离PBMC和 血浆，否则应在2448h内分离血浆和血细胞。
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试剂的稳定性
试剂的灵敏度 试剂内标的最佳标准 试剂与全自动工作站的磨合
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完善实验室管理
• 技术要求更高 • 操做要求更专业 • 质量控制更严格
核酸检测在血液筛查中的应用
深圳市血液中心
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1
血液筛查是否需要进行核酸检测
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2
无偿献血的新动态
“定期无偿献血者是低危的献血者” ，但是“以体检为目的定期无偿献血 者是高危献血者”而且这部分人群的 献血队伍正在扩大。这部分人群窗口 期的机率高于其他人群。因为在他们 中间高危的传播行为经常发生。
HCV、HIV窗口期浓度高，因此对灵敏度要求较低。
美国FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被 检出
HBV的窗口期标本在30-300IU/ml之间，因此对灵敏 度要求高
低于灵敏度也有检出的可能，这与取样几率有关
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9
血液筛查常用的NAT技术
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容性强的设备、试剂销路好) 试剂成本 质量成本

和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA所含的 戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧 啶U。 ➢ 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核 苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为 戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。
须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件。
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第二代：自动化控制型PCR
使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电 泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操 作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风 险大等不足。且无法对起始模板准确定量， 无法对扩增反应实时检测。
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第三代PCR：实时荧光定量PCR
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PCR扩增步骤
➢ DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢 键断裂，形成单链DNA。
➢ 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结 合，形成局部双链。
➢ 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷 酸脱氧核甘酸）为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合 成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延 伸，DNA的含量既增加一倍。
26灵敏度高特异性强快速简便应用范围广27新药验证28传染病发病的监控预测与预防29对新型冠状病毒2019ncovorf1ab及编码核衣壳蛋白或e基因的特异性保守序列为靶区域进行了双靶标基因的设计配以pcr反应液在荧光定量pcr应用实时荧光定量rtpcr检测技术通过荧光信号的变化实现样本新型冠状病毒rna检测
PCR技术及临床应用、新冠病毒核 酸检测原理
授课人：刘翔宇
1
目录
一．核酸基本知识 二．PCR的发展史 三．PCR技术简介 四．实时荧光PCR技术 五．实时荧光PCR的临床应用 六．新冠病毒核酸检测原理

市场状况
试剂质量控制方法
编码子系统可读取配置好的录像计划，根据计划实现前端模拟视频的编码、并进行存储操作。编码子系统的主要完成的功能如下：响应控制指令：编码子系统响应配置客户端发出的远程配置指令，对编 码格式、质量等参数进行保存。
感谢聆听
市场状况
现状和趋势
在发现入侵者之后可以自动预警，并通知带 PTZ 的摄像机自动锁定目标进行跟踪监控，形成视频跟踪和摄像机区域联防。这样，保安人员就可以随时掌握着入侵者的行踪，并在事发之前进行预防和控制， 把损失降到最低。
市场状况
实时荧光PCR检测的难点
当然，在特殊场景下还需要特殊功能进行匹配，比如：超低照度、宽动态等等。2、适应复杂环境——与硬盘录像机、交换机所处环境不同，摄像机一般都置于风吹日晒的环境下，天气变化都会影响摄像 机的工作。
核酸提取 探针点膜
PCR 扩增 交联
杂交
显色
结果判读
怎样进行核酸检测？
PCR
对于电梯轿厢，采用电梯专用飞碟摄像机。而对于光照强度不足的楼梯及地下室等位置，采用低照度的枪机。5.1.4 传输子系统设计5.1.4.1.传输方式的类型传输线路是指将前端设备的信号传输至中心控制 设备的各类线路，这部分的造价虽小，但关系到整个电视监控系统的图像质量和使用效果，因此要选择经济、合理的传输方式。
怎样进行核酸检测？
直流输入电源外置，采用双路 1+1 冗余-48V 电源输出。在本设计中，视频综合平台主要提供解码、大屏拼接、显示控制的功能。
怎样进行核酸检测？
传统的大屏幕系统一般由编码器、矩阵、大屏控制器构成，组成比较复杂，每个环节都有可能存在不稳定因素，而且环节越多导致了排查错误约困难，而我司的视频综合平台将编码、矩阵以及大屏控制 器整合在一起，在满足功能需求的基础上操作简便、维护简单、管理简捷。

2
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
3
PCR扩增体系
➢模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可
以是细菌、组织样品等。
➢引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定
1、避免重复碱基，尤其是G。
2、引物退火温度在58-60℃之间。
3、G+C为30-80%。
4、3’端最后5个碱基内不能有多于2个
的G或C。
5、引物的产物大小一般在80-250bp之
间；80-150 bp最为合适（可以延长至
300 bp）。 2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
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Real-Time PCR引物设计原则
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
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引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。
引物3’端错配时，不同碱基引发效率存 在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即 使在错配的情况下，也能有引发链的合成， 而当末位链为T时，错配的引发效率大大降 低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所 以3’端最好选择T。
引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
26
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
30
引物设计的基本原则