16SrRNA在细菌鉴定与分类中的应用

16S rRNA基因在细菌菌种鉴定中的应用
都立辉;刘芳
【期刊名称】《乳业科学与技术》
【年(卷),期】2006(029)005
【摘要】本文综述了应用16S rRNA基因作为靶基因对细菌进行鉴定的各种分子生物学技术,并指出应用16S rRNA基因在乳酸菌鉴定方面的研究进展.
【总页数】3页(P207-209)
【作者】都立辉;刘芳
【作者单位】东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,哈尔滨,150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,哈尔滨,150030
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
1.PCR扩增rRNA基因在细菌菌种鉴定中的应用 [J], 金鑫;李妍;陈代杰
2.16SrRNA基因检测在儿童细菌性脑膜炎早期诊断中的应用 [J], 世淑兰;戴熙廷;赵广周;李小娟;李荣杰;麻明彪
3.16SrRNA基因检测在儿童细菌性脑膜炎早期诊断中的应用 [J], 世淑兰;戴熙廷;赵广周;李小娟;李荣杰;麻明彪
4.细菌16S rRNA基因芯片的构建及其在细菌鉴定中的应用 [J], 薛建亚;翁心华;朱利平;万谟彬
5.16S rRNA基因及16S～23S rRNA基因区间在临床细菌学检验中的应用 [J], 毕春霞;闫志勇;王斌
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第39卷　第4期2003年12月青岛大学医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE QIN G DAO UNIV ERSITATISVol.39,No.4December 2003[收稿日期]2002210218;　[修订日期]2003202216[作者简介]毕春霞(19692),女,硕士,主管检验师。

16S rRNA 基因及16S ～23S rRNA 基因区间在临床细菌学检验中的应用毕春霞1,闫志勇2,王　斌2(1　青岛市市立医院检验科,山东青岛　266011;　2　青岛大学医学院微生物学教研室) 核糖体16S RNA (16S rRNA )为所有细菌所共有,其编码基因兼保守性和变异性于一身,素有细菌的“分子化石”之称。

通过对16S rRNA 基因保守区引物进行聚合酶链反应(PCR )扩增,可早期、快速判断细菌的存在与否,因此在临床细菌感染的检验中有较高的应用价值。

本文就细菌16SrRNA 基因的特征、在检测临床细菌感染中的应用,以及一种新方法———16S ～23S rDNA 区间序列在分类及鉴别细菌的应用研究等作一综述。

1　16S r RNA 基因及16S ～23S r RNA 基因区间的基本特征细菌的核糖体RNA 按沉降系数分3种,分别为5S 、16S 和23S 。

其编码基因(rDNA )的链长依次为3300、1540和120个核苷酸。

一般来说,原核生物基因组结构不像真核生物那样具有高度重复序列,但细菌中的rDNA 在染色体上却以多拷贝形式存在,且微生物中rDNA 的拷贝数与其生长速率相关,现已确知大肠杆菌中rDNA 的拷贝数是7,结核杆菌中为2,枯草杆菌是10,这就使针对细菌rRNA 基因进行的分子生物学检测具有较高的灵敏度。

rRNA 操纵子被转录成前rRNA 时包含以下几个成分(从5′→3′):16S 、区间、tRNA 、区间、23S 、区间和5S rDN A 序列[1]。

炎 支 原 体 的 统一 标 准 。 参 考 文 献
［ ］ 雷正瑜．６ ｒ Ｎ １ １ＳＤ Ａ序列分析技术在微生物分 类鉴定 中的应用 ［ ］ 湖北 Ｊ． 生态工程职业技术学院学报 ，０ ６４（ ） ３— ． ２ ０ ， １ ： ７ ［ ］ Ｍｉ ｅ ｗ Ｉ ＯｓｎＫ，ｏａｏＪｅ ａ． ａｎ ｓｃ ｔｉ ｎ ｌ ｉａ ｓｎｆ ２ ｃ ｌ Ｃ， ｌ Ｌ ｚｎ ，ｔ Ｄｉ ｏｔ ｉｔ ａｄｃｉｃｌｉ ｉ ｈｏ ｅ １ ｇ ｉｕ ｌ ｙ ｎ ｇ － 从（ 上表中可以看出） 采用 １ Ｓ Ｎ ， ６ ｒ Ａ基 因检查诊 断支原体肺炎 较采用 Ｒ 血清学检查诊 断支原体肺炎在假 阳性率 、 敏度、 灵 耗时方面有明显的优势 ， Ｐ ＜ ．５ 比较差 异有统计学意义 。 Ｏ０ ，
标准。
【 关键词 】６ ｒ Ｎ １ＳＲ Ａ基 因； 医学微生物检 定； 效果评价 ｄ ｉ１ ．９ ９ｊｉ ｎ １０ ０：０ ３ ６ ／．ｓ ．０ ６—１５ ．０ １０ ．７ ｓ ９ ９２ １ ．８０ ９ 文章编号 ：０ ６—１５ （ ０ １ ０ ３ ９ １０ ９９ ２ １ ）一 ８— ５ ４—０ ２ １Ｓ Ｎ ６ ｒ Ａ基因序列检测技术的原理是 ： Ｒ 细菌染 色体上编码 ｒ Ｎ Ｒ Ａ的相 对 应 的 Ｄ Ａ序列存在于所有细 菌及衣 原体 、 克次体 、 Ｎ 立 支原体 、 旋体 、 线 螺 放 菌等原核生物的染色体基 因中 ， 不存在 于病毒 、 真菌等非 原核生 物体 内， 而 目前 ， 几乎所有病原 菌的 １ Ｓ Ｎ ６ ｒ Ａ基因测序均 已完成 ， Ｒ 这样 ， 使得采用基 因 序列图谱进行对比分 析测试 病原菌 的种 类成为 了可能 ， 过该技术 可 以准 通 确快速的鉴定细菌的种类 … 。 养、 免疫学和生化反应等方法 ， 这些检测方 法的检 测结果受 多种因索影响 ， 均存在特异性差、 耗时长 、 敏感 度低等问题 ， 以满 足临床 医学 检验的发展 难 要求 Ｌ． 。近年来 ， ２ ｊ Ｊ 随着聚合酶链式反应 （ Ｃ 技术的出现及核酸研究技术 Ｐ Ｒ） 的不断完善以及其它分子生 物学技术 的迅 速发展 ， 生了很多新 的细菌分 产 类鉴定 方法 ， 常见 的如 限制 性片段 长度多态 性分 析、 质粒 图谱 、 Ｎ ｒ Ａ基 因 Ｒ （ ｒ Ｎ ） 即 Ｄ— Ａ 指纹 图 、 Ｃ Ｐ Ｒ指纹 图、 ６ １ Ｓ核糖 体核 糖核 酸 （ｉ ｓ ａ Ｒ Ａ ｒｏ ｍ ｌ Ｎ 。 ｂｏ １资 料 与 方 法 ． ｒＮ 序列分析等＿ 。这些 技术均 基于对细 菌染色 体或染 色体外 的 Ｄ Ａ Ｒ Ａ） ４ Ｊ Ｎ １ １ 一般资料 ： ． 本组 ５ ４例患者 中 ， 男性 ２ ３例 ， 女性 ３ １例 ， 年龄 ２一ｌ 片段进行分析 ， １ 从分子遗传的角度对细菌进行分类鉴定 ， 从而使细菌分类更 岁， 平均年龄 ６ ２ ．３岁 。所有患者均进行血清学检查诊 断和 １ＳＲ Ａ基 因序 精确 、 ６ｒＮ 更科学。特别今年来出现的 １ＳＲ Ａ基因序列分 析技术 ， 以做到用 ６ｒＮ 可 列检测肺炎支原体。以上患者的临床表现主要有 ： 头痛、 发热伴有无力 和干 实验 研 究 来 研 究 证实 细 菌 进 化 与 否 ， 是 细 菌 分 类 史 上 的一 次 革 命 【ｊ 目 这 ５。 咳等。 前， 大多 数致病 菌 的 １ ＳＲ Ａ基 因序 列 已经被测 定 完成 ， 于 Ｐ Ｒ扩增 ６ ｒＮ 关 Ｃ １２ 检查方法 ： ． 分别对 ５ ４例患 者进行血清 血检查 诊断 和 １ＳＲ Ａ基 １ＳＲＮ ６ｒＮ ６ ｒ Ａ基因用 于细菌分类和鉴定 的研究越来越多ｔ］ ６。 因序列检查诊 断， 统计两种检查方法的假阳性率 、 灵敏 度、 检测耗时等指标 ， 肺炎支原体是一类能在无生命人 工培养基 中生 长、 繁殖 的最小 的原核 分析两种检测 方法在诊断肺炎支原体感 染时的优劣 。 型微生物 ， 曾被称 为胸膜炎微 生物（ ｌ ｒｐ ｅｍ ｎａ ｉｅｏｇｎｓ Ｐ Ｌ 。 ｐｅ ｏ ｎｕ ｏｉ —ｌ ｒａｉ ｕ ｋ ｍ， Ｐ ０） １２ １ 血清学检查诊断 ： 体感染肺 炎支原 体后 ， ．． 人 血清 中除了出现 特 临床 的上呼吸道感染 、 气管支气 管炎及非典 型肺炎经 常是 由肺炎支原 体感 异性抗体外还存在冷凝素 ， 患者的稀释血清 与 Ｏ型红细胞在 ４Ｃ ＂ 下可发生凝 染引起 。由于肺炎支原体感染 所致 的肺 炎患者临床表现 症状不典型， 需 集， 此为 Ｉ 型抗体 。以 Ｅ Ｉ ｇ Ｍ ＬＳ Ａ方法检 测患者 血清 中 Ｍ Ｐ—Ｉ ｇ Ｍ。以 Ｍ 要经过 １ Ｐ— ０～２ ｄ的潜伏期才 能表现 出来 ， ０ 临床 症状主要 为非特异性 的头痛 Ｉ ｇ Ｍ≥ｌ８ 和 （ ） 凝集 试验 ≥１３ ： ０ 或 冷 ： ２判断为有支原体感 染， 结合临床有发 和发热 ， 患者常常伴有无力和干 咳 ， 根据这些 临床 症状较难判断为肺炎支原 热、 头疼、 无力 、 干咳等症状判定为感染肺炎支原体 。 体感染 ， 因此临床 常被忽视而导致 严重 的并 发症 ， 因此 ， 利用实验 检查 就成 １２ ２ ６ ｒＮ ． ． １ Ｓ Ａ基因序列 检查 ： Ｒ 从鼻咽和 口腔采用拭子采 样进行 Ｐ Ｒ 为 了诊断肺炎支原体感染的主要依 据【 。近年来 ， Ｃ ８ Ｊ 对于肺 炎支原体感 染的 扩增 ， 引物取 自 肺炎支原体的 １ＳＲ Ａ， 照肺 炎支原体 的基 因序列进行对 流 行 病 学 特 征 、 病 机 制 、 子 生 物 学 检 测 方 法 的 研 究 报 道 较 多 。 目前 ， ６ ｒＮ 按 致 分 用 比分析 ， 符合肺炎支原体基因序列并 伴有发热 、 头疼 、 无力 、 咳等症状判定 于诊断支原体肺炎 的方法是取上呼吸道标本做 Ｐ Ｒ和急性期血 Ｉ 千 Ｃ ｓ Ｍ的复合 为感染肺炎支原体 。 测定 。但人们对于上呼吸道 ＭＰ携带者与急性 期肺炎上 呼吸道标本的 Ｐ Ｒ Ｃ １３ 统计学方法 ： ． 计量资料采用 ｔ 检验 ， 数资料采用 ｘ 检 验 ， 计 且以 Ｐ 阳性者较难区分， 且对于儿童诊 断 ＭＰ肺炎取材 的理想位置和方法还未明 而 ＜ ． ５为有统计学意义 。 ００ 确建立 。因此 ， 找到一种有效、 快速 、 期的支 原体肺 炎鉴定方法 就显 得尤 早

第39卷　第4期2003年12月青岛大学医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE QIN G DAO UNIV ERSITATISVol.39,No.4December 2003[收稿日期]2002210218;　[修订日期]2003202216[作者简介]毕春霞(19692),女,硕士,主管检验师。

16S rRNA 基因及16S ～23S rRNA 基因区间在临床细菌学检验中的应用毕春霞1,闫志勇2,王　斌2(1　青岛市市立医院检验科,山东青岛　266011;　2　青岛大学医学院微生物学教研室) 核糖体16S RNA (16S rRNA )为所有细菌所共有,其编码基因兼保守性和变异性于一身,素有细菌的“分子化石”之称。

通过对16S rRNA 基因保守区引物进行聚合酶链反应(PCR )扩增,可早期、快速判断细菌的存在与否,因此在临床细菌感染的检验中有较高的应用价值。

本文就细菌16SrRNA 基因的特征、在检测临床细菌感染中的应用,以及一种新方法———16S ～23S rDNA 区间序列在分类及鉴别细菌的应用研究等作一综述。

1　16S r RNA 基因及16S ～23S r RNA 基因区间的基本特征细菌的核糖体RNA 按沉降系数分3种,分别为5S 、16S 和23S 。

其编码基因(rDNA )的链长依次为3300、1540和120个核苷酸。

一般来说,原核生物基因组结构不像真核生物那样具有高度重复序列,但细菌中的rDNA 在染色体上却以多拷贝形式存在,且微生物中rDNA 的拷贝数与其生长速率相关,现已确知大肠杆菌中rDNA 的拷贝数是7,结核杆菌中为2,枯草杆菌是10,这就使针对细菌rRNA 基因进行的分子生物学检测具有较高的灵敏度。

rRNA 操纵子被转录成前rRNA 时包含以下几个成分(从5′→3′):16S 、区间、tRNA 、区间、23S 、区间和5S rDN A 序列[1]。

对于临床菌株，美国CLSI组织的文件MM-18A《DNA靶基因序列鉴定细菌和真菌的解释标准；批准指南》详细介绍了广谱基因测序技术（broad-range gene sequencing）在细菌与真菌鉴定中的应用，其中综合了细菌的生化反应、rRNA靶基因与其他靶基因序列分析的方法。
表16S rRNA基因序列鉴定细菌的通用解释标准
可能的新属新种，并注明“亲缘关系最近的菌属”
< 95%
模式菌株或有效命名的菌株
可能的新属新种
相似度
序列的类型
相似度差是否大于0.8%
结果报告
评述
≥99.0%
模式菌株
是
属名和种名
≥98%）
属名和多个种名
低鉴定度的鉴定
97.0-98.9%
模式菌株或有效命名的菌株
能与其他属区分
属
需注明“亲缘关系最近的菌种”
95.0-96.9
模式菌株或有效命名的菌株

一、实验目的1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。

二、实验原理细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。

16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。

16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。

是一种快速获得细菌种属信息的方法。

16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。

在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。

16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：细菌基因组的提取：PCR 的基本原理 ：PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。

PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

菌种鉴定通用引物引言菌种鉴定是微生物学领域中的一项重要工作，它对于疾病诊断、环境监测和食品安全等方面具有重要意义。

菌种鉴定的关键是通过引物对目标微生物的DNA序列进行扩增和分析，从而确定其分类地位和种属鉴定。

本文将介绍菌种鉴定通用引物的原理和应用。

一、引物的选择原则菌种鉴定通用引物的选择需要考虑以下几个因素：1. 引物的特异性：引物应具有足够的特异性，只能扩增目标微生物的DNA序列，而不扩增其他非目标微生物的DNA序列。

2. 引物的保守性：引物应选择在目标微生物的DNA序列中高度保守的区域，以确保扩增的目标序列的一致性。

3. 引物的长度：引物的长度应适中，一般为18-30个碱基对，过长的引物可能导致扩增效率降低，而过短的引物可能导致特异性降低。

4. 引物的G+C含量：引物的G+C含量应适中，一般在40-60%之间，过低或过高的G+C含量可能影响扩增效率。

5. 引物的互补性：引物的两个端部应互补，以确保引物在目标DNA 序列上的结合和扩增。

二、常用的菌种鉴定通用引物1. 16S rRNA通用引物：16S rRNA序列是细菌和古菌中高度保守的基因序列，因此广泛用于细菌和古菌的鉴定。

常用的引物包括27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

2. 18S rRNA通用引物：18S rRNA序列是真核生物中高度保守的基因序列，因此广泛用于真菌和原生动物的鉴定。

常用的引物包括ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。

3. 基因编码区通用引物：除了rRNA序列外，一些基因编码区的引物也被广泛应用于菌种鉴定。

例如，ITS区（内转录间隔区）是真菌常用的鉴定区域，常用的引物包括ITS1和ITS4。

鉴定上的应用[J].重庆中草药研究,2010,22(1):29. [3] 周永运 , 许彦梅 , 崔志刚 , 等 . 肠球菌为主要菌群的腹泻标本的 16SrRNA与PFGE分析[J].中国人兽共患病学报,2010,26(3):205. [4] 郭世奎,王昆华.16SrRNA基因与结直肠癌患者肠道相关分子微 生态研究进展[J].云南医药,2010,22(2):211. [5] 张志明,孙海英,李建平.16SrRNA在医学微生物鉴定中的应用 [J].中国医学检验杂志,2008,22(6):170. [收稿日期：2011-02-22 编校：苏建东]
其中16srrna比真核生物的相应rrna略小16srrna及其基因在微生物鉴定中有重要作用由于细菌各种属间生理特征和生化特征相似单凭传统方法已无法准确的进行分类鉴定随着科技的发展现在已经能通过对细菌dna最常用的是16srrna基因的进行鉴定区分细菌资料与方法11一般资料
吉林医学2011年4月第32卷第12期
1 资料与方法
1.1 一般资料：选择洁净级小鼠 20 只，体重接近， 10 只空腹 20 h腹腔注射STZ，72 h后加强注射，以血糖值＞11 mmol/L为标 准作为样品组；10只作为对照组，以无菌方式采取新鲜粪便，进 行DNA提取。根据长双歧杆菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌和肠球菌 16SrDNA基因序列，设计相应菌属的引物。并对比PCR引物序列 的相应菌属特异性。将提取的DNA样品以PCR产物制备的标准曲 线进行分析。 1.2 统计学方法：PCR仪用系统内置软件处理后的定量结果。
16SrRNA in medical microbe application are discussed MA Zhang-lin1, TANG Shu-ming2, LOU Xu-bai1(1.Shenzhen baoan

ＰＣＲ 扩 增 含 有 高 变 区 的 部 分 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基 因， 然后用根据 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因中高变区的序列 设计出一系列的种特异性的探针与之杂交。通过 １６Ｓ ｒＲＮＡ 种属特异性的探针与 ＰＣＲ 产物杂交以 获得微生物组成信息。此外， 探针也可以直接与样 品进行原位杂交检测， 通过原位杂交不仅可以测 定微生物的形态特征和丰度， 而且能够分析它们 的空间分布， 该方法简单快速， 主要应用于快速检 测， 但可能出现假阳性或假阴性结果。
收稿日期： ２００６－ ０５－ １２； 作者简介： 都立辉（ １９８１－ ） ， 男， 硕士研究生， 主要从事食品微生物 方面的研究； 基金项目： 国家“８６３ 计划”课题资助（ ２００２ＡＡ２４８０４１） 。
出来， 利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种 的 细 菌 进 行 分 类 鉴 定 。 但 较 其 它 方 法 而 言 ， １６Ｓ ｒＲＮＡ 序列测定分析更适用于确定属及属以上分 类单位的亲缘关系。
表 １ 目前比较通用的几种 １６Ｓ ｒ ＲＮＡ 基因 ＰＣＲ 扩增引物
引物
序列（ ５’－ ３’）
ｆＤ１
ｃｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｃａａｃＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣ
ｆＤ２
ｃｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｃａａｃＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＣ
ｆＤ３
ｃｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｃａａｃＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＡＧ
２ １６Ｓ ｒ ＲＮＡ 在乳酸菌鉴定方面的研究进 展
近年来 Ｔ Ｙａｍａｍｏｔｏ 等设计和合成出人肠道 区系中常见的双歧杆菌属 ５ 个种（ 两歧双歧杆菌、 青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双 歧杆菌） 的特异性的寡核苷酸探针， 它们具有 １６￣
１９ 个碱基长度， 并与这 ５ 个种的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 序列 互补。用天然高分子量的 ＲＮＡ 制备物作为靶子， 这些寡核苷酸探针对于人肠道中这些种的菌株具 有高度的种特异性， 结果表明用此法检测这 ５ 个 种的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 序列能取得所期望的结果， 并且 整个试验过程从获得纯细胞物后只需 ６ｈ 可完成。

16s rDNA序列是细菌和古细菌特有的一种特征序列，是通过测定16s rDNA基因所编码的16s rRNA的序列而得到的。

在分子生物学和微生物学领域，16s rDNA序列被广泛应用于微生物分类、微生物多样性研究和微生物系统进化研究中。

本文将从以下几个方面对16s rDNA 序列进行介绍和分析。

一、成因和结构16s rDNA序列是细菌和古细菌特有的一种特征序列，它是细菌和古细菌核糖体小亚基rRNA基因的一部分，通常有约1500个核苷酸碱基对，可由16s rRNA基因编码。

这一序列在细菌和古细菌的核糖体RNA中起着重要的作用，它能够稳定地与核糖体蛋白结合，形成核糖体的小亚基，并参与到细菌和古细菌的蛋白质合成过程中。

二、意义和应用1. 微生物分类16s rDNA序列在微生物分类中具有重要意义，通过对16s rDNA序列进行测序分析可以鉴定和分类细菌和古细菌的种属和亚属。

这是因为16s rDNA序列在不同种属和不同亚属的细菌和古细菌之间存在一定的变异，可以作为分子生物学特征用于分类鉴定。

2. 微生物多样性研究通过对环境样品中的16s rDNA序列进行测序分析，可以了解微生物裙落的组成和结构，揭示微生物在自然界的分布和多样性。

这对于研究微生物的生态学、环境适应性和生态功能具有重要意义。

3. 微生物系统进化研究利用16s rDNA序列进行系统进化研究，可以揭示细菌和古细菌的系统发育关系和演化过程，为了解细菌和古细菌的起源、多样性和进化提供重要的分子学证据。

三、研究方法1. PCR扩增通常情况下，从细菌或古细菌的DNA中提取16s rDNA序列，然后利用PCR技术进行扩增。

通过选择适当的引物和反应条件，可以特异性地扩增出16s rDNA序列，为后续的测序分析做准备。

2. 测序分析测序是获取16s rDNA序列信息的关键步骤，目前常用的测序方法包括Sanger测序和高通量测序。

通过测序分析，可以获得16s rDNA 序列的具体碱基序列信息，用于后续的分类鉴定和系统进化研究。

004　16s rRNA 序列同源性分析与细菌系统分类鉴定中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所　(北京　100050)焦振泉　刘秀梅综述　孟昭赫审校 摘要　本文介绍了16s rRNA 序列测定及同源性分析的方法,并阐述了其在细菌系统分类鉴定中的重要作用。

关键词　16s rRNA 序列同源性分析　细菌　分类鉴定 近10多年来,随着分子生物学理论和技术的迅速发展,特别是作为生物技术里程碑的聚合酶链反应(PCR )技术的出现及核酸测序技术的不断完善,产生了许多新的分类方法,如:质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、脉冲场凝胶电泳、PCR 指纹图、r DNA 指纹图、16s rRNA 序列分析等。

它们主要是对细菌染色体进行直接的DNA 分析或对染色体外的DNA 片段进行分析,从遗传进化的角度去认识细菌,从分子水平进行分类与鉴定,使细菌的分类越来越科学和精确,特别是16s rRNA 序列分析方法的出现使细菌进化可以通过试验研究来证实。

这是细菌分类史上的一次革命,必将使人们对生物进化及其与其它生物学科关系的认识更加深入。

1　16s rRNA 的结构与性质16s rRNA 为原核生物核糖体中一种核糖体RNA 。

目前,在细菌的系统分类学研究中最有用的和最常用的分子钟是rRNA ,其种类少,含量大(约占细菌RNA 含量的80%),分子大小适中,存在于所有的生物中,特别是其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称。

rRNA 在大多数原核生物中都具有多个拷贝[1],5s 、16s 和23s rRNA 的拷贝数相同[2],16s rRNA 由于大小适中,约115kb 左右,既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术来较容易地得到其序列,故被细菌学家及分类学家所接受[3]。

所以,“细菌系统学研究特设委员会”建议依据系统发育关系分类。

通过对其序列的分析,可以判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近。

第23卷第1期 海　洋　水　产　研　究　Vo l.23,No.1 2002年3月 MARINE FISHERIES RESEARCH M ar.,2002文章编号:1000-7075(2002)01-0058-06・综述・16S rRNA在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中的应用洪义国　孙　谧　张云波　李勃生(中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071)摘要 16S rRNA序列分析作为微生物系统分类的主要依据已得到广泛认同,随着微生物核糖体RNA数据库的日臻完善,该技术成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。

本文总结了16S rRNA作为海洋微生物系统分子分类鉴定的理论基础和具体方法,分析了用16S r RNA研究海洋微生物的进化关系,并且对16S rRNA在海洋微生物分子检测中的应用作一评述。

关键词 16S rRNA 海洋微生物 分子分类鉴定 分子检测中图分类号:Q939;Q522+.3 文献识别码:AThe application of16S rRNA in molecular classification, identification and molecular examination in marine microbic systemHO N G Yi-g uo　SU N M i　ZHA N G Yun-bo　L I Bo-sheng(Yellow Sea Fisher ies Resear ch I nstitute,Q ing dao266071)ABSTRACT T he theoret ical base and det ailed met hod of16S rRN A application in molecular classif ication,identificat ion and ex aminat ion in marine microbic sy stem w ere summarized.T he evolutional relationship of marine bacteria studied w ith16S rRNA w as analyzed,t he applicat ion of16S rRNA to molecular examinat ion of marine microbe w as review ed.KEY WORDS 16S rRN A M arine microbeM olecular classification and identificat ion M olecular examinat ion 随着分子生物学和分子遗传学的飞速发展,16S rRNA在海洋微生物学的研究中起到越来越重要的作用,作为海洋微生物系统分类和有害海洋微生物的分子检测的主要依据已得到广泛认同。

16S rRNA的系统发育分析
NCBI Blast： /
与数据库中已知细菌比较获得样品种属的信息，找到 同源性比较高的细菌。
通过LPSNhttp://www.bacterio.cict.fr/index.html 查找得到比对后同源性较高细菌的DNA序列。
再将得到的DNA序列输入MEGA软件进 行建树。
16S rRNA 基因序列分析技术的问题：
1、首先是数据库的完整性,尽管数据库收录的细菌 种类在不断增加, 但还会遇到不能确定的情况;早期 所测定的结果也不尽正确。
2、数据库中有些序列中还存在很多不清楚的位点。 其序列中存在着突变速度很快的“热点”区域和 高度保守的区域 , 因此其确切的进化速度目前还不 清楚。
16SrRNA基因序列分析
—物种鉴rRNA 基因序列是编码 rRNA 相对应的 DNA序 列，存在于所有原核生物的基因组中。
特征
在众多的生物系统发育相关性水平指标 中，16SrRNA 基因序列由于具有如下特征：
(1)
具有重要且恒定的生理功能； (2) 既含有高度保守的序列区域，又有中度保守 和高度变化的序列区域； (3) 基因序列长度适中； (4) 普遍存在于原核生物中且易于提取。
ＤＮＡ测序获得 １６ＳｒＤＮＡ序列
判断16SrＤＮＡ序列扩增是否成功：
经琼脂糖凝胶电泳在1500bp附近出现条带， 说明16s rDNA已经扩增成功.由于16s rDNA序列 长度一般1500bp左右。
DNA测序获得16SrRNA处理后得到的结果
GCATGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGA ACTGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCG CATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACC ATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGT AGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTA AAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGG CTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAG ATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAG CATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT TCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACA GGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGC ATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCT GGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGG ATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTT GTACACACCGCCCGTCACACCTGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGACAG AGATGG

临床检验杂志 2002 年第 20 卷第 4 期 文章编号 : 1001 764X( 2002) 04 0245 02
Chinese Journal of Clinical Laboratory Science, 2002, Vol 20, N o 4 中图分类号 : R446 5 文献标识码 : A
lu等3根据16srrna基因的高度保守区设计一套引物扩增出了金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌化脓性链球菌无乳链球菌肺炎链球菌肠球菌结核分枝杆菌大肠埃希菌克雷伯杆菌粘质沙雷菌阴沟肠杆菌铜绿假单胞菌奇异变形杆菌流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌等各种细菌扩增产物均为996bp但大部分pcr产物的hae酶切图谱不同金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌不能被hae酶切以mn消化则可产生不同的模菌鉴定中的应用
刘毅 , 韩金祥( 山东省医药生物技术研究中心, 济南 250062)
关键词 : 16S rRNA 基因 : 脑 脊液 ; 细菌 脑脊液 ( CSF ) 病原菌的检测鉴定主要是通过培 养和免疫 学方法 , 但都 存在 明 显的 不足 [ 1, 2] 。目 前 , 大 多数 致病 菌 的 16S rRNA 基因都已测序完成 , 采用 PCR 技术扩增 16S r RNA 基因 , 用于细菌的鉴 别和 分类 , 在脑 脊液 病原 菌检测 鉴定 中 的应用研究越来越多。本文就其近年来的应用作一综述。 1 16 S rRNA 编码基因及其特点 细菌中 编码 r RNA 的 基因 是按 5 16S 23S 5S 3 方式 排 列的 , 由 两 个 非 编 码 的 间 隔 区 序 列 ( internal tr anscribed spacers, IT S) 所分开 , 5S rR NA、 16S rRN A、 23S r RNA 三部 分 组成一个 RNA 操纵子 , 作为一个 单位转录 , 再加 工成为成 熟 的 r RNA 。 16S r RNA 编 码 基 因 是 指 细 菌 染 色 体 上 编 码 r RNA 相对应的 DNA 序列 , 存在于所有细菌的染色 体基因组 中 , 也存在于衣原 体、 立克次 体、 支原体 、 螺旋体、 放线菌等 原 核生物中 , 但不存在于非原核生物如 病毒、 真菌等的 体内 , 它 具有以下 特点 : ( 1) 多拷 贝 : 16S r RNA 编码 基因以 多拷贝 形 式存在于所有细菌染色体基因组中 , 每 个细菌约 含 5~ 10 个 拷贝 , 这使得对 该基 因的 检测具 有敏 感性。 ( 2) 多 信息 : 16S r RNA 编码基因内部结构由可变区和保守区组成。保守区 为 所有细菌所共有 , 细 菌间 无差别 , 有 分 子化 石! 之称。可 变 区在不同细菌之间存在有不同程度的差异 , 具有 属或种的 特 异性 , 可变区与保守区交错排列。可 根据保守区 设计各种 细 菌的通用引物 , 也可根据可变区设计 特定细菌的 特异引物 或 探针。16S rRN A 基因可变 区所含信息的种间差 异使检测 具 有特异性。( 3) 长度 适中 : 16S rRNA 编 码基 因长 度适 中 , 约 1500 bp, 不象 23S r RNA 基 因 序 列太 长 不易 进 行全 序 列 测 定 , 因此 , 各种细菌 16S rRN A 基因的测序工作在微 生物学界 成为热点。目前 , 人体 液中常 见病原菌 的 16S rR NA 基因 几 乎全部 测 序 完 成 , 为 细 菌 的 基 因 诊 断提 供 了 条 件 [ 2] 。 16S r RNA 编码基因的这些特点使之成为较理想的细菌基因分 类 的靶序列 , 逐渐成为细菌鉴别、 分类的金标准。 2 应用程序 2. 1 细 菌 基 因 序 列 查 询 在国 际生物 技术信 息中 心 ( NCBI ) 的 Genebank 数 据 库 ( http: / / www . ncbi. nlm. nih. g ov) 上 , 查询所要检测的细菌所有的 16S rRN A 编码 基因 , 用 计算机软件 Vector NT I Suite5. 5 进行 Allignment 比对 , 各自特异性序列。 2 . 2 BLA ST 比对 在国 际生 物技术 信息 中心 ( N CBI) 公 共 序列库 BLA ST 上 , 粘 贴从 N CBI 的 Genebank 数据库 中获 取 的核酸序列 , 采用 FORM AT 格 式 , 逐个碱 基进 行 BL AST 比 对。 2 . 3 引 物 软 件分 析 在 免 费 在 线 的 PCR 引 物 设 计 程 序 Primer 3( http: / / w ww. genome. wi. mit . edu) 中点 击 Geno me. Center Software 条 目下 的 W WW Primer Picking ( P rimer3) , 粘贴从 N CBI 的 G enebank 数据 库中 获取 的核 酸序 列 , 采 用 FAST A 格式 , 输入引物设计参数 , 由此设计出 最佳引物。 3 在 CSF 病原菌检测中的应用 目前 , 测定 16S rRN A 编 码基因 进行细菌 平行诊 断结 合 培养法 ( 与培养法平行进行 ) , 已在临 床病原菌 的诊断方面 获 得很大成功 , 常用的检测方法如下。 3. 1 PCR- 探针杂交 根据 16S rRN A 编码 基因可 变区 的 序列设计一系列特 异性探 针 , 通 用 P CR 扩 增含 有可 变区 的 部分 16S r RNA 基因 , 然后 与 特异 性 探 针进 行 杂交。 早 在 1994 年 , Gr eisen 等就建立了通用 PCR Sout hern 杂交技术 , 他 们在细菌的 16S r RNA 基因的 保守区 设计了 一套通 用引物 , 检测了 100 多株细 菌 ( 包括引 起败血 症、 脑 膜炎的 主要病 原 菌和临床标 本 中 常 见 的 污 染 菌 以 及 螺 旋 体 和 支 原 体 ) 的 DNA, 另 外 设 计 了 三 套 探 针 与 扩 增 后 的 PCR 产 物 进 行 Southern 杂交 , 第一套包括 通用、 革兰 阳性、 革兰阴 性寡核 苷 酸探针 , 通用探针 R DR 245 选自 16S rRNA 基因的保守区 , 位 于大肠埃希菌 ( E. coli ) 16S rRNA 基因核苷酸 编码位置 1369 ~ 1395 bp 处 ; 革兰阳性 探针 RW O3 和革兰阴性探针 DLO 4、 RDR278 均位于 E col 16S rRNA 基 因的 1190~ 1217bp 处 , 正确鉴定出了大多数被检的细菌 ; 第 二套包括 7 条探针分 别 用来检测脑膜炎奈瑟菌、 流感 嗜血杆 菌、 肺 炎链球 菌、 B 群链 球菌 、 单核细胞增多 性李 斯特 菌、 肠道细 菌和 金黄色 葡萄 球 菌 ; 第三套由 5 条探 针组 成 , 用来 检测常 见的 被认为 是污 染 的细菌 : 如芽胞杆菌、 棒状杆菌、 丙酸 杆菌和凝 固酶阴性葡 萄 球菌。第二套和第三套探针正确鉴定出了代表 18 种 CSF 常 见病原菌和污染菌的 60 多株不 同的标准菌 株。该方法敏 感 性高达 3 CF U 或 10 拷 贝 , 在 临 床 上 可 用 CSF 直 接 提 取 DNA, PCR 扩增然后杂交 , 不必经过培养。将该套引物、 探针 做反向斑点杂交或微孔板杂交 , 就可 对一份脑 脊液得到多 个 探针杂交结果 , 为临床提供了一种快 速敏感的 检测病原菌 的 新方法 [ 1] 。目前 PCR- 反 向斑点 杂交法 因简 便快速 已逐 渐 取代 PCR- Southern 杂交。 PCR- 反向斑点杂交法的原理为 , 将特 异探针 点样于 硝 酸纤维素薄膜或尼 龙膜 , 以 生物 素或 地高 辛标 记的 PCR 产 物与之杂交 , 加入与碱性磷酸 酶结合 的抗体 , 与 PCR 产物 结 合 , 再加入显色底物 , 通过比色检测结果。 Shang 等 [ 2] 以细 菌 16S rR NA 基因 为靶序 列 , 设 计引物 及寡核 苷酸探 针包括 通 用探针、 革兰阳性探针和革兰 阴性探 针 , 采 用 PCR 加反向 杂 交检测标准菌株及临床标本 ( 22 例血培养阳性标本和 4 例脑 脊液 培养阳 性 标本 ) DNA , 均 扩增 出 371 bp 的 DNA 条 带。

结课论文题目名称：16S rRNA 在细菌鉴定与分类中的应用学生姓名：刘*学号：*************专业：生物化学及分子生物学结业课程：系统细菌学中国·武汉2016 年12 月16S rRNA在细菌鉴定与分类中的应用刘* 2016304110***华中农业大学生命科学学院，武汉[摘要]：由于细菌种属间生理生化特征的相似，单凭传统的表型和化学鉴定方法已无法准确对其进行分类鉴定。

随着包括PCR技术、测序技术等分子技术的不断进步，细菌的分类鉴定也由在最初的表型和化学鉴定演变到分子水平，使人们可以通过对细菌的DNA鉴定来达到区分种属的目的。

细菌的16S 核糖体RNA(rRNA)以其在进化上的特征性序列，基因序列的保守性和存在的普遍性，应用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一种强有力工具。

本文就16S rRNA在细菌鉴定与分类研究中的进展做一综述。

关键词：16S rRNA；细菌分类鉴定；DNA测序；高级结构传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定。

大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。

20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。

在PCR技术的产生发展基础上，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR指纹图、rRNA基因(rDNA)指纹图、16S核糖体核糖核酸(rRNA)序列分析等。

这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。

16S～23S rRNA基因序列在细菌鉴定中的应用于超;郭海勇;魏嘉良;钱爱东【摘要】近些年围绕16S～23S rRNA基因间隔区发展起来的分子生物学技术为细菌多样性的研究开辟了新的途径,使得人们在细菌多样性的研究中得以摆脱传统分离培养的束缚,进而使分析方法得以长足拓展,并为指导实践提供可靠的理论依据,作者就16S～23S rRNA基因间隔区序列的特点、应用及发展前景作一简述.%In recently years.molecular biology techniques,based on the intergenic spacer region between 16S rRNA and 23S rRNA, has developed some new approaches to study the bacterial diversity. This technique which doesn't depend on traditional ways expands related analysis methods and provides reliable theoretical basis. This study reviewed the sequence features, applications and development prospects of 16S to 23S rRNA intergenic spacer region.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)002【总页数】4页(P57-60)【关键词】16S～23S rRNA基因间隔区;细菌;多样性【作者】于超;郭海勇;魏嘉良;钱爱东【作者单位】吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林师范大学生命科学学院,吉林四平 136000;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】Q522+.3自然界中微生物（以细菌为主）无处不在，它们繁殖速度快、数量庞大、适应性强、种类繁多。

利用16S rRNA基因序列分析进行微生物分类鉴定【实验目的】1. 了解微生物分子鉴定的原理和应用。

2. 掌握利用16S rRNA基因进行微生物分子鉴定的操作方法。

3. 运用软件构建系统发育树并对微生物进行系统发育关系分析。

【实验原理】长期以来，对微生物的分类鉴定主要采用分离培养、形态特征、生化反应和免疫学等方法。

但这些传统手段均存在耗时长、特异性差、敏感度低等问题，难以满足现代细菌学研究的发展要求。

随着分子生物学技术的迅速发展，特别是聚合酶链式反应( PCR) 技术的出现及核酸研究技术的不断完善，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR 指纹图、rRNA 基因（即rDNA）指纹图、16S 核糖体核糖核酸（ribosomal RNA，rRNA）序列分析等。

这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA 片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。

其中原核生物16S rRNA 基因（真核18S rRNA 基因）序列分析技术已被广泛应用于微生物分类鉴定。

核糖体rRNA对所有生物的生存都是必不可少的。

其中16 S rRNA在细菌及其他微生物的进化过程中高度保守，被称为细菌的“分子化石”。

在16S rRNA分子中含有高度保守的序列区域和高度变化的序列区域，因此很适于对进化距离不同的各种生物亲缘关系的比较研究。

其具体方法如下：首先借鉴恒定区的序列设计引物，将16S rRNA基因片段扩增出来，测序获得16S rRNA基因序列，再与生物信息数据库（如GenBank）中的16S rRNA基因序列进行比对和同源性分析比较，利用可变区序列的差异构建系统发育树，分析该微生物与其他微生物之间在分子进化过程中的系统发育关系（亲缘关系），从而达到对该微生物分类鉴定的目的。

通常认为，16S rRNA基因序列同源性小于97 %，可以认为属于不同的种，同源性小于93~95 %，可以认为属于不同的属。