16SrRNA在细菌鉴定与分类中的应用

16S rRNA基因在细菌菌种鉴定中的应用
都立辉;刘芳
【期刊名称】《乳业科学与技术》
【年(卷),期】2006(029)005
【摘要】本文综述了应用16S rRNA基因作为靶基因对细菌进行鉴定的各种分子生物学技术,并指出应用16S rRNA基因在乳酸菌鉴定方面的研究进展.
【总页数】3页(P207-209)
【作者】都立辉;刘芳
【作者单位】东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,哈尔滨,150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,哈尔滨,150030
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
1.PCR扩增rRNA基因在细菌菌种鉴定中的应用 [J], 金鑫;李妍;陈代杰
2.16SrRNA基因检测在儿童细菌性脑膜炎早期诊断中的应用 [J], 世淑兰;戴熙廷;赵广周;李小娟;李荣杰;麻明彪
3.16SrRNA基因检测在儿童细菌性脑膜炎早期诊断中的应用 [J], 世淑兰;戴熙廷;赵广周;李小娟;李荣杰;麻明彪
4.细菌16S rRNA基因芯片的构建及其在细菌鉴定中的应用 [J], 薛建亚;翁心华;朱利平;万谟彬
5.16S rRNA基因及16S～23S rRNA基因区间在临床细菌学检验中的应用 [J], 毕春霞;闫志勇;王斌
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第39卷　第4期2003年12月青岛大学医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE QIN G DAO UNIV ERSITATISVol.39,No.4December 2003[收稿日期]2002210218;　[修订日期]2003202216[作者简介]毕春霞(19692),女,硕士,主管检验师。

16S rRNA 基因及16S ～23S rRNA 基因区间在临床细菌学检验中的应用毕春霞1,闫志勇2,王　斌2(1　青岛市市立医院检验科,山东青岛　266011;　2　青岛大学医学院微生物学教研室) 核糖体16S RNA (16S rRNA )为所有细菌所共有,其编码基因兼保守性和变异性于一身,素有细菌的“分子化石”之称。

通过对16S rRNA 基因保守区引物进行聚合酶链反应(PCR )扩增,可早期、快速判断细菌的存在与否,因此在临床细菌感染的检验中有较高的应用价值。

本文就细菌16SrRNA 基因的特征、在检测临床细菌感染中的应用,以及一种新方法———16S ～23S rDNA 区间序列在分类及鉴别细菌的应用研究等作一综述。

1　16S r RNA 基因及16S ～23S r RNA 基因区间的基本特征细菌的核糖体RNA 按沉降系数分3种,分别为5S 、16S 和23S 。

其编码基因(rDNA )的链长依次为3300、1540和120个核苷酸。

一般来说,原核生物基因组结构不像真核生物那样具有高度重复序列,但细菌中的rDNA 在染色体上却以多拷贝形式存在,且微生物中rDNA 的拷贝数与其生长速率相关,现已确知大肠杆菌中rDNA 的拷贝数是7,结核杆菌中为2,枯草杆菌是10,这就使针对细菌rRNA 基因进行的分子生物学检测具有较高的灵敏度。

rRNA 操纵子被转录成前rRNA 时包含以下几个成分(从5′→3′):16S 、区间、tRNA 、区间、23S 、区间和5S rDN A 序列[1]。

第39卷　第4期2003年12月青岛大学医学院学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE QIN G DAO UNIV ERSITATISVol.39,No.4December 2003[收稿日期]2002210218;　[修订日期]2003202216[作者简介]毕春霞(19692),女,硕士,主管检验师。

16S rRNA 基因及16S ～23S rRNA 基因区间在临床细菌学检验中的应用毕春霞1,闫志勇2,王　斌2(1　青岛市市立医院检验科,山东青岛　266011;　2　青岛大学医学院微生物学教研室) 核糖体16S RNA (16S rRNA )为所有细菌所共有,其编码基因兼保守性和变异性于一身,素有细菌的“分子化石”之称。

通过对16S rRNA 基因保守区引物进行聚合酶链反应(PCR )扩增,可早期、快速判断细菌的存在与否,因此在临床细菌感染的检验中有较高的应用价值。

本文就细菌16SrRNA 基因的特征、在检测临床细菌感染中的应用,以及一种新方法———16S ～23S rDNA 区间序列在分类及鉴别细菌的应用研究等作一综述。

1　16S r RNA 基因及16S ～23S r RNA 基因区间的基本特征细菌的核糖体RNA 按沉降系数分3种,分别为5S 、16S 和23S 。

其编码基因(rDNA )的链长依次为3300、1540和120个核苷酸。

一般来说,原核生物基因组结构不像真核生物那样具有高度重复序列,但细菌中的rDNA 在染色体上却以多拷贝形式存在,且微生物中rDNA 的拷贝数与其生长速率相关,现已确知大肠杆菌中rDNA 的拷贝数是7,结核杆菌中为2,枯草杆菌是10,这就使针对细菌rRNA 基因进行的分子生物学检测具有较高的灵敏度。

rRNA 操纵子被转录成前rRNA 时包含以下几个成分(从5′→3′):16S 、区间、tRNA 、区间、23S 、区间和5S rDN A 序列[1]。

一、实验目的1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。

二、实验原理细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。

16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。

16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。

是一种快速获得细菌种属信息的方法。

16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。

在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。

16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：细菌基因组的提取：PCR 的基本原理 ：PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。

PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

菌种鉴定通用引物引言菌种鉴定是微生物学领域中的一项重要工作，它对于疾病诊断、环境监测和食品安全等方面具有重要意义。

菌种鉴定的关键是通过引物对目标微生物的DNA序列进行扩增和分析，从而确定其分类地位和种属鉴定。

本文将介绍菌种鉴定通用引物的原理和应用。

一、引物的选择原则菌种鉴定通用引物的选择需要考虑以下几个因素：1. 引物的特异性：引物应具有足够的特异性，只能扩增目标微生物的DNA序列，而不扩增其他非目标微生物的DNA序列。

2. 引物的保守性：引物应选择在目标微生物的DNA序列中高度保守的区域，以确保扩增的目标序列的一致性。

3. 引物的长度：引物的长度应适中，一般为18-30个碱基对，过长的引物可能导致扩增效率降低，而过短的引物可能导致特异性降低。

4. 引物的G+C含量：引物的G+C含量应适中，一般在40-60%之间，过低或过高的G+C含量可能影响扩增效率。

5. 引物的互补性：引物的两个端部应互补，以确保引物在目标DNA 序列上的结合和扩增。

二、常用的菌种鉴定通用引物1. 16S rRNA通用引物：16S rRNA序列是细菌和古菌中高度保守的基因序列，因此广泛用于细菌和古菌的鉴定。

常用的引物包括27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

2. 18S rRNA通用引物：18S rRNA序列是真核生物中高度保守的基因序列，因此广泛用于真菌和原生动物的鉴定。

常用的引物包括ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。

3. 基因编码区通用引物：除了rRNA序列外，一些基因编码区的引物也被广泛应用于菌种鉴定。

例如，ITS区（内转录间隔区）是真菌常用的鉴定区域，常用的引物包括ITS1和ITS4。

16s rDNA序列是细菌和古细菌特有的一种特征序列，是通过测定16s rDNA基因所编码的16s rRNA的序列而得到的。

在分子生物学和微生物学领域，16s rDNA序列被广泛应用于微生物分类、微生物多样性研究和微生物系统进化研究中。

本文将从以下几个方面对16s rDNA 序列进行介绍和分析。

一、成因和结构16s rDNA序列是细菌和古细菌特有的一种特征序列，它是细菌和古细菌核糖体小亚基rRNA基因的一部分，通常有约1500个核苷酸碱基对，可由16s rRNA基因编码。

这一序列在细菌和古细菌的核糖体RNA中起着重要的作用，它能够稳定地与核糖体蛋白结合，形成核糖体的小亚基，并参与到细菌和古细菌的蛋白质合成过程中。

二、意义和应用1. 微生物分类16s rDNA序列在微生物分类中具有重要意义，通过对16s rDNA序列进行测序分析可以鉴定和分类细菌和古细菌的种属和亚属。

这是因为16s rDNA序列在不同种属和不同亚属的细菌和古细菌之间存在一定的变异，可以作为分子生物学特征用于分类鉴定。

2. 微生物多样性研究通过对环境样品中的16s rDNA序列进行测序分析，可以了解微生物裙落的组成和结构，揭示微生物在自然界的分布和多样性。

这对于研究微生物的生态学、环境适应性和生态功能具有重要意义。

3. 微生物系统进化研究利用16s rDNA序列进行系统进化研究，可以揭示细菌和古细菌的系统发育关系和演化过程，为了解细菌和古细菌的起源、多样性和进化提供重要的分子学证据。

三、研究方法1. PCR扩增通常情况下，从细菌或古细菌的DNA中提取16s rDNA序列，然后利用PCR技术进行扩增。

通过选择适当的引物和反应条件，可以特异性地扩增出16s rDNA序列，为后续的测序分析做准备。

2. 测序分析测序是获取16s rDNA序列信息的关键步骤，目前常用的测序方法包括Sanger测序和高通量测序。

通过测序分析，可以获得16s rDNA 序列的具体碱基序列信息，用于后续的分类鉴定和系统进化研究。

004　16s rRNA 序列同源性分析与细菌系统分类鉴定中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所　(北京　100050)焦振泉　刘秀梅综述　孟昭赫审校 摘要　本文介绍了16s rRNA 序列测定及同源性分析的方法,并阐述了其在细菌系统分类鉴定中的重要作用。

关键词　16s rRNA 序列同源性分析　细菌　分类鉴定 近10多年来,随着分子生物学理论和技术的迅速发展,特别是作为生物技术里程碑的聚合酶链反应(PCR )技术的出现及核酸测序技术的不断完善,产生了许多新的分类方法,如:质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、脉冲场凝胶电泳、PCR 指纹图、r DNA 指纹图、16s rRNA 序列分析等。

它们主要是对细菌染色体进行直接的DNA 分析或对染色体外的DNA 片段进行分析,从遗传进化的角度去认识细菌,从分子水平进行分类与鉴定,使细菌的分类越来越科学和精确,特别是16s rRNA 序列分析方法的出现使细菌进化可以通过试验研究来证实。

这是细菌分类史上的一次革命,必将使人们对生物进化及其与其它生物学科关系的认识更加深入。

1　16s rRNA 的结构与性质16s rRNA 为原核生物核糖体中一种核糖体RNA 。

目前,在细菌的系统分类学研究中最有用的和最常用的分子钟是rRNA ,其种类少,含量大(约占细菌RNA 含量的80%),分子大小适中,存在于所有的生物中,特别是其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称。

rRNA 在大多数原核生物中都具有多个拷贝[1],5s 、16s 和23s rRNA 的拷贝数相同[2],16s rRNA 由于大小适中,约115kb 左右,既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术来较容易地得到其序列,故被细菌学家及分类学家所接受[3]。

所以,“细菌系统学研究特设委员会”建议依据系统发育关系分类。

通过对其序列的分析,可以判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近。

第23卷第1期 海　洋　水　产　研　究　Vo l.23,No.1 2002年3月 MARINE FISHERIES RESEARCH M ar.,2002文章编号:1000-7075(2002)01-0058-06・综述・16S rRNA在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中的应用洪义国　孙　谧　张云波　李勃生(中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071)摘要 16S rRNA序列分析作为微生物系统分类的主要依据已得到广泛认同,随着微生物核糖体RNA数据库的日臻完善,该技术成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。

本文总结了16S rRNA作为海洋微生物系统分子分类鉴定的理论基础和具体方法,分析了用16S r RNA研究海洋微生物的进化关系,并且对16S rRNA在海洋微生物分子检测中的应用作一评述。

关键词 16S rRNA 海洋微生物 分子分类鉴定 分子检测中图分类号:Q939;Q522+.3 文献识别码:AThe application of16S rRNA in molecular classification, identification and molecular examination in marine microbic systemHO N G Yi-g uo　SU N M i　ZHA N G Yun-bo　L I Bo-sheng(Yellow Sea Fisher ies Resear ch I nstitute,Q ing dao266071)ABSTRACT T he theoret ical base and det ailed met hod of16S rRN A application in molecular classif ication,identificat ion and ex aminat ion in marine microbic sy stem w ere summarized.T he evolutional relationship of marine bacteria studied w ith16S rRNA w as analyzed,t he applicat ion of16S rRNA to molecular examinat ion of marine microbe w as review ed.KEY WORDS 16S rRN A M arine microbeM olecular classification and identificat ion M olecular examinat ion 随着分子生物学和分子遗传学的飞速发展,16S rRNA在海洋微生物学的研究中起到越来越重要的作用,作为海洋微生物系统分类和有害海洋微生物的分子检测的主要依据已得到广泛认同。

结课论文题目名称：16S rRNA 在细菌鉴定与分类中的应用学生姓名：刘*学号：*************专业：生物化学及分子生物学结业课程：系统细菌学中国·武汉2016 年12 月16S rRNA在细菌鉴定与分类中的应用刘* 2016304110***华中农业大学生命科学学院，武汉[摘要]：由于细菌种属间生理生化特征的相似，单凭传统的表型和化学鉴定方法已无法准确对其进行分类鉴定。

随着包括PCR技术、测序技术等分子技术的不断进步，细菌的分类鉴定也由在最初的表型和化学鉴定演变到分子水平，使人们可以通过对细菌的DNA鉴定来达到区分种属的目的。

细菌的16S 核糖体RNA(rRNA)以其在进化上的特征性序列，基因序列的保守性和存在的普遍性，应用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一种强有力工具。

本文就16S rRNA在细菌鉴定与分类研究中的进展做一综述。

关键词：16S rRNA；细菌分类鉴定；DNA测序；高级结构传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定。

大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。

20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。

在PCR技术的产生发展基础上，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR指纹图、rRNA基因(rDNA)指纹图、16S核糖体核糖核酸(rRNA)序列分析等。

这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。

16S～23S rRNA基因序列在细菌鉴定中的应用于超;郭海勇;魏嘉良;钱爱东【摘要】近些年围绕16S～23S rRNA基因间隔区发展起来的分子生物学技术为细菌多样性的研究开辟了新的途径,使得人们在细菌多样性的研究中得以摆脱传统分离培养的束缚,进而使分析方法得以长足拓展,并为指导实践提供可靠的理论依据,作者就16S～23S rRNA基因间隔区序列的特点、应用及发展前景作一简述.%In recently years.molecular biology techniques,based on the intergenic spacer region between 16S rRNA and 23S rRNA, has developed some new approaches to study the bacterial diversity. This technique which doesn't depend on traditional ways expands related analysis methods and provides reliable theoretical basis. This study reviewed the sequence features, applications and development prospects of 16S to 23S rRNA intergenic spacer region.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)002【总页数】4页(P57-60)【关键词】16S～23S rRNA基因间隔区;细菌;多样性【作者】于超;郭海勇;魏嘉良;钱爱东【作者单位】吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林师范大学生命科学学院,吉林四平 136000;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】Q522+.3自然界中微生物（以细菌为主）无处不在，它们繁殖速度快、数量庞大、适应性强、种类繁多。

利用16S rRNA基因序列分析进行微生物分类鉴定【实验目的】1. 了解微生物分子鉴定的原理和应用。

2. 掌握利用16S rRNA基因进行微生物分子鉴定的操作方法。

3. 运用软件构建系统发育树并对微生物进行系统发育关系分析。

【实验原理】长期以来，对微生物的分类鉴定主要采用分离培养、形态特征、生化反应和免疫学等方法。

但这些传统手段均存在耗时长、特异性差、敏感度低等问题，难以满足现代细菌学研究的发展要求。

随着分子生物学技术的迅速发展，特别是聚合酶链式反应( PCR) 技术的出现及核酸研究技术的不断完善，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR 指纹图、rRNA 基因（即rDNA）指纹图、16S 核糖体核糖核酸（ribosomal RNA，rRNA）序列分析等。

这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA 片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。

其中原核生物16S rRNA 基因（真核18S rRNA 基因）序列分析技术已被广泛应用于微生物分类鉴定。

核糖体rRNA对所有生物的生存都是必不可少的。

其中16 S rRNA在细菌及其他微生物的进化过程中高度保守，被称为细菌的“分子化石”。

在16S rRNA分子中含有高度保守的序列区域和高度变化的序列区域，因此很适于对进化距离不同的各种生物亲缘关系的比较研究。

其具体方法如下：首先借鉴恒定区的序列设计引物，将16S rRNA基因片段扩增出来，测序获得16S rRNA基因序列，再与生物信息数据库（如GenBank）中的16S rRNA基因序列进行比对和同源性分析比较，利用可变区序列的差异构建系统发育树，分析该微生物与其他微生物之间在分子进化过程中的系统发育关系（亲缘关系），从而达到对该微生物分类鉴定的目的。

通常认为，16S rRNA基因序列同源性小于97 %，可以认为属于不同的种，同源性小于93~95 %，可以认为属于不同的属。

16SrDNA序列在微生物的分类鉴定上的应用摘要随着生物技术的迅速发展，16SrDNA分析技术在微生物分类鉴定及分子检测中得到广泛应用。

根据16SrDNA的保守域和高变域，可以进行种属的鉴定。

16SrDNA分析技术克服了传统生物培养法的限制，操作方便，检测快，准确度高且灵敏度高，已被广泛应用到菌种鉴定、群落对比分析、群落中系统发育及种群多样性的评估，是一种客观且可信度高的分类方法。

关键词16SrDNA 微生物分类鉴定传统的微生物分类是根据菌落的形态特征和生理生化特性，对菌种进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征及免疫学特性加以鉴定。

但近几十年来，传统微生物分类鉴定得到了巨大的革新，许多新技术和方法在微生物分类中得到广泛应用，使微生物分类鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定。

1.微生物形态比较分类法的局限性1.1 不能正确反映微生物形态由于微生物菌群在进行纯培养时，不可避免地会造成菌株的富集或衰减，人为地改变了原始菌群的微生物生态构成，对研究结果造成了较大的偏差①。

这样在应用上就只能局限于对简单环境下的微生物的研究，而对复杂环境下的微生物不能加以有效分析，严重影响了微生物基因组的研究。

1.2微生物资源大量丢失许多研究研究表明，在自然环境中有相当多的菌种（约90%～99%）用纯培养方法无法培养出来。

同时，纯培养分离方法采用配制简单的营养基质和固定的培养温度，忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少，仅占环境微生物总数的0.1%～1%②。

因此，由于绝大多数微生物无法培养得到，丢失了大量微生物资源，对微生物多样性的认识较片面。

1.3不能保证分类的准确性和科学性对形态特征、理化特征、菌体某些化学成分等特征完全相同时，可较准确的分类，但是对某特性中有某些差异的，往往难以判断。

而且，方法繁琐耗时。

2. 16SrDNA及其鉴定依据2.1 16SrDNA简介16SrDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因,长度约1500bp,是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”, 其序列包含10 个可变区( variable region ) 和与之相间的11 个恒定区( constantregion) ,可变区因细菌而异,且变异程度与细菌的系统发育密切相关。

16SrRNA基因测序技术在临床细菌学鉴定中的应用国医学检验杂志加陀年8月第3卷第4期Chlm~V o1.3.No.4 gionmethylationwillbeapromis~approachforusingDI~IA.basedlnalrkelrfortheearlydetectionofhumanrcan.Cers.1~affm[1]Jaaes,P.A.,andTatid.D.(2001)"lllemleDI~IAmethylationinn瑚皿如.啪~,,eties.Sciet,lee293.1068—1070.[2Jl~lass,S.J.,}kⅡⅫ,J.G.,C-6bri~,E.,lvea.seia,P.w.,Pad,F.F.,1)avidsola,N.E,andG神,J.R.(zooo)Abetl~tmethylafi~theesIecept饵andF.,-caltlelln5'c_.pcislands.mmB∞with一nallt∞inlⅡlm聃breast删嘲.G帅.叮Res.60,43464348.[3JBayli.,SB.,H∞m,J.G.,G神,J.R.,Y e~ino,P.M.,mdlssa,J.P.(199~)Alte~ratiainDI~IAmethylation=afundamental∞:ctIleo一.Adv.Caiic~es.72,141—196[4]Palmim,w.A.,DivineK.K.,SG,~omarmoG.,Ginil,~lG.D.,BaylinS.B.,Hl∞mJ.G.,andBelimkyS.A.(zooo)PrctiIIglullgcⅢbd曲ectiIlgaben'antpr,m~methylationinsputum.C,allC~rRes,60,5954-5958[5]F~eller,M.,Coin,P.G.,B,,yli.,S.B.,andH口mm,J.G.(2001)Ag,mehyr,em~ylationlⅡⅡmc.Gm.目Res,61,3225—329.[6]lIttp://,H~w.intea'ganeo.eom/methylation.hmai口]H口mm,】.G.,Graft,J.R.,l~lyollanen,S.,N,B.D.,andB陆,S.B.(1996)Metl叫硼一甲ec访cPER-.anovelP(assayfor methylationslatusc_.pcislandsProe.NailAcadSei,93,9821-9826.[8]b,Y.M.,~/ontg,1.H.,刁Ⅷ唱,J.,'rein,M…SNg,M.H.,andHjcIm,N.M.(1999)Quantitativeanalysisabea'rantp16methylationIlls—iIlgreal-tiraequ~titativemdl印础c~y,,msedulinI憎dim.C日Res,59,3899-39Q3【9]Ends,C.A.,岫,KI).,Kawkami,K.,虹,LIB.,Blake,C,Shib~,D.,mn,P.V.andIJild,P.W.(2OOO)l~lethyllght-.ahiO,-~assayto~JtreDI~IAmethylation.NudeieAcidsRes,28,E32E10]~mntg,x.,~ma,L.,and1)avidson,N.E.(2001)I)NAmethylationin bl,east咖.F_lldoerRelatCam,8,l15-127.[11]Esldk,M.,andHl邪1弧,J.G.(2ID吆)c锄oer硝锄印c缸:DI~IAmethylationanddⅡq瑚吐ica】I刮inlnJ咖tumouls.J411+Pathol,196-.1-7E12]Eit~ei-,M.,Sac啤船,M.,Iell,R.,Sil,D.,Baylin,SB.,andltemm,J,G.(1999)[1~teeliola蛔nI吐∞瞳0'一盯~lafion铷pI啊嘲8ruesin钾哪DI~IAfrom脚—m—l!celllIlng咖t~ie,lts.GmoerRes.59,67-70.【13JEvlmn,E.,Dooley,W.C.,IJmbrieht,C.B.,R,D.,S~ehi.N.,b6els∞,E,Soito,A.B.,flung,D.T.,mg,B.,,N.E.,andSdoJmr,S.(2001)Detectionbreast瑚Iloefcellsindue—tall唧fluidbymethylation-specificP(.,357,1335-1336.[14]Sand№CqIes,M.,E8telk,M.,wu,LI,NM∞叵-mish,H.,~oo,G.H.,Koch,W.M.,Jen,J..ttemm,J.G.,andSi由岫,D.(2000)(pr,m~hypennethylationinIIirlw-m~andserI啦head andneck咖t~ie,lts.C∞目Res,60,892-895[15]LiuzJ,MaekawaM,ItoriiT,M皤ilaMandKmnoT.(2002)"lllemIll—titlepr,m~methylafionPR伊晴and腿ag,meinn附cells.日中川医学研究者制度第l0期特别研究者研究报告会报告集.2002年3月,东京(收稿日期:2002-08-17)16SrRNA基因测序技术在临床细菌学鉴定中的应用TECIINOLOGYOF16SrRNAGENESEQUENCINGANDITS CLlMCAIAIPICATICAlNBAC【IA】[1[Ij团T】[15'】.(L1ON傅占江,刘宝文,江源,刘体全(白求恩军医学院检验教研室,河北050081)[中图分类号]R446.5[文献标识码]A[文章编号]1606—8O25(2OO2)04一O223—04 关键词:16SrRNA;序列测定;细菌鉴定/l删n凼:16SrRNA;gonesoq1.m~ba咖嘲棚厅c甜0n临床细菌学鉴定的发展方向是快速,准确,成本低.分子生物学方法能够比较快速的鉴定病原菌,限制其大规模走向临床的主要因素就是其成本较高.但是对于诸如结核分枝杆菌等生长比较缓慢的致病【综述】【Review]菌的鉴定来说,分子生物学技术的应用尤为必要.分子生物学技术不但快速,准确,并且适用于几乎所有致病菌的检测甚至发现新的病原菌.一但一种新技术建立起来,就要对其进行一系主垦匿堂熊堕盘查生旦蔓鲞蔓塑JⅢcImlofMedicalLab嘎帅Teehnok~2[112..3.№.4 列方法学分析.比如基于探针杂交原理的Gen—Probe技术就提供了针对不同病原菌的试剂盒[].这种技术比较特异,但是对于每一个分离纯化的细菌都要单独进行杂交检测,其限制因素就是提供的探针种类数目有限.高探针密度的微阵列技术(芯片)可以将针对所有常见病原菌的探针固定,以改变传统杂交一一对应杂交而实现对病原菌快速,准确鉴定【7-9J.杂交技术的缺点就是对新的致病菌的鉴定无能为力,而基因序列测定技术正是解决这个问题的有力工具.多年来,由于16SrRNA基因的高度保守分子特性,使得其序列分析在细菌基因多态性及分类鉴定中发挥着重要作用.并且在可疑感染中,16S rRNA基因的序列测定在发现新的致病菌方面也具有重要意义.下面就将该技术相关情况综述如下:116SrRNA的基因16SrRNA的基因有几个显着特点使得细菌学家青睐于临床细菌学的鉴定.一是该基因存在所有细菌体内;二是该基因基本高度保守,所以随机变异几率远远大于选择性变异[1o];三是该基因序列足够长(1.5kb),包含大约50个左右的功能域,功能域较多就使得选择性变异所导致的功能域变化发生的范围较窄,考虑到这种情况,我们可以利用其他功能域进行细菌的分类或鉴定[12].遗憾的是16SrRNA基因序列并不是鉴定特异菌株的完美分子标志.因为株间序列的差异主要靠DNA—DNA同源性来确定. 细菌分类学家将具有70%以上DNA同源性的菌株划分为同一菌株[11],在这个水平上,16SrRNA基因的.同源性可达到97%以上[12].16SrRNA基因同源性低于97.5%两种细菌可以不考虑为同一种属.然而,有一些菌株,比如龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌,DNA同源性还不到50%,而它们的16SrRNA基因的I茜丑源性却达到99%甚至100%[13引.根据这种情况, 只靠16SrRNA基因来进行分类是不科学的,应该考虑多种因素在内来进行细菌分类与鉴定.依据现有技术,在临床,相对于传统细菌鉴定方法来说,对16SrRNA基因进行全序列测定不是完全可取的.目前,基因测序仪一次只能测定500bp的序列,要对1500bp的序列进行测定需要几个反应,其成本与复杂性限制了其在大多数临床实验室的开展.更何况对于多数细菌鉴定来说,没有必要对其全序列进行测定,因为基因的异质性大多存在于5端5OO个碱基范围内[15-17],因此只需对5端5OO 个碱基序列进行测定就可以满足临床纯化菌株的鉴定,但是对于新的病原菌,还是需要对全序列进行测定.2序列测定(测序)技术不同的生产商所提供的试剂与设备决定了测序步骤的多样化,但是原理都是相同的(见图1).细菌菌落J提取DNAJPCR扩增J纯化扩增产物J凝胶电泳对产物进行检测J测序循环J纯化测序产物J序列数据分析J数据库中比较图1序步骤DNA提取方法很多,但是,不同提取方法对细菌DNA测序鉴定结果的影响是不同的[18-19].提取的DNA经PCR扩增后,要对扩增产物进行凝胶电泳分析以确保目的片移的忠实扩增.接下来的测序循环以及对凝胶电泳后的数据读取,剪切,编辑,在数据库中相似性对比查找等步骤都比较统一.AppliedBiosystems公司提供了16SrRNA基因序列分析试剂盒,其中包括相关的试剂,软件以及序列数据库.有两种型号的试剂盒:一种可以对全序列进行测定,包括一个扩增反应和12个测序反应(正向和反向各6个);另一种是500bp试剂盒,只对5端的500bp进行测定.包括两个测序反应(正向和反向各一个).这些试剂盒的设计考虑到了细菌鉴定的通用性,比如引物是针对所有细菌基因最保守的序列而设计的.MecroSeq软件提供了序列拼接,编辑,数据库中的比较查找,文件管理等功能.该软件的突出优点就是其数据库提供了近1100种不同的序列,并且几乎所有这些序列都来自标准典型菌株,以确保数据结果的可靠性与权威性.尽管Microseq是目前唯一的商品化的16SrRNA基因序列测定系统,但实验室可以根据自己的情况建立起自己的反应系统,因为这些反应在任何温度循环仪上都可以进行,另外,可供选择的相关的数生垦匿堂焦苤查笙8月第3鲞蔓期ChlneeeJ叫|lalofMedicalbb0mchn0l2OO2.AI*坷tv01.3.No.4据库,软件也比较多(见表1).GenBank收集了几乎所有公开的DNA序列,它是最完备的序列数据库.核糖体数据库计划(RibosomalDatabaseProject, RPD)和医学微生物核糖体基因差异数据库(Riboso—malDifferentiationofMedicalMicmb-organisms,RIDOM) 只收集了核糖体基因的序列数据和医学相关的细菌核糖体基因序列J.至于数据库的选择,主要考虑因素就是其准确性,有效性.对于GenBa来说,任何个人都可以向该库递交序列,并标记上一个种类名字,如果利用该库来进行临床细菌学的鉴定将是非常危险的.但是这并非否定该库巨大的生物信息资源,只是说,如果要走向临床应用,有些数据还要得到相关权威部门的认可.目前,最好的办法就是公用与商用数据库结合使用,以寻找适合自己实验室的可行方法.表116SrRNA基因序列数据库数据库网址GenBank公用核糖体数据库计划 Ⅵ/f∞PIml/index.}血liwww.ridom.dewww.rotate,me.eh测序结果基本都比较明确,如果测序结果出现杂乱现象(比如电泳图谱模糊),考虑到的主要因素是培养基的污染,也可能是由于纯化的细菌携有多个拷贝的16SrRNA基因.16SrRNA基因的拷贝数在不同菌株中是有差异的,比如E.Coil携有7个拷贝,分枝杆菌携有1～2个拷贝,并且这些拷贝的序列都是特异的,出现这种现象的原因还不十分清楚J.在临床有关这方面的报道目前只有两篇文献,出现这种现象的原因可能是大家太注意前期的扩增步骤,没有考虑到少数细菌的这种特性.这种细菌的扩增产物可以将其插入到克隆载体中再进行测序. 如果细菌存在多个拷贝的16SrRNA基因,无疑增加了16SrRNA基因的特异性.3基于16SrRNA基因序列测定的临床应用研究表明,针对生长比较缓慢,非特异的以及用传统方法难以鉴定的细菌,该技术尤为实用.临床最早应用的是对各种分枝杆菌的鉴定.Ro#l等【is]是最早介绍只用16SrRNA基因的5端序列就可以满足以临床常见分枝杆菌的鉴定.Krischner等人[矧采用一种特异性引物来对临床分离到的分枝杆菌进行DNA扩增和测序,得到了较好效果.Tang等人【驯利用MicroSeq5500bp试剂盒对棒状杆菌以及棒状杆菌相关菌进行了鉴定.对于药物治疗以后难以分离和鉴定的病原菌,可以采用该技术直接对标本进行检测,有关这方面的报道也比较多,这里不一一赘述.在发现新的致病因子方面,采用该技术用于惠普尔疾病(肠原性脂肪代谢障碍)以及杆菌性血管瘤(巴尔通体菌引起)诊断,发现了新的病原体.另外,人欧利希病和少菌性骨髓炎致病因子也是通过PCR扩增16SrRNA进行序列分析发现的.该技术需要一定的试剂,温度循环扩增仪和序列测定仪,用已知的序列数据库来对序列测定结果进行相似性比较,以确定相应的或是新致病菌.目前相关试剂已经商品化,适于临床实验室的温度循环扩增仪机序例测定仪的应用也有报导,同时公用和商用的相关数据库的数目在不断增长.尽管条件完全允许,但是所有这些对一些普通的临床实验室来说还是相对比较昂贵.任何一项新技术的诞生,除技术本身的优越性外,其成本效益是临床考虑的主要因素.基因的序列测定相对来说是一项比较昂贵的技术.有关实验室初步估计其单项检测(无阴阳性对照)费用在加～85美元不等[-32],如果加上阴阳性对照,成本可能还要高.尽管如此,不可否认16SrRNA基因测序技术的优越性,只有开发比较自动化的技术方法以降低成本才是其大规模临床应用的前提.4结语近十多年来,随着分子生物学理论和技术的迅速发展,特别是PCR的出现及核酸测序技术的不断完善,产生了许多新的包括16SrRNA基因序列分析在内的细菌分类鉴定方法.它们主要是对细菌染色体进行直接的DNA分析或对染色体外的DNA片段进行分析,从遗体进化的角度去认识细菌,从分子水平进行分类与鉴定,使细菌的分类与鉴定越来越科学和精确,特别是本文提到的分析方法,它必将使人们对生物进化及其与其他生物科学关系的认识更加深入.参考文献【ljLebmnL,Fapim~F,PocedaJD,eta1.Evaluation0fncllladi4Mic~ DNAproesfmidentification0fmycoimcteria.JQiIlMicrobiol,l992,30: 钉B2d78.[2]lk~beauPP,HeiterBJ,e0fGin-ProbeAccupr0beB~tococctmtesttodetectgroupBstreptococciinbrothcultures0f一nal-anorectalspecimensfrompremtmm:c0哪,aris∞wit}ltradititml culturemethod.JQiIlMicrnbiol,l997,35:l44_l47.[3]DenysGA,liB.Identification0f啊,t0spIlm∞withaDNAprobe.JCainMicrnbiol,1992,30:2"/25-2727.[4]Y ongH,MoyesAS.c0qwativeevalu~on0fAccuPro~cultureidmt/fl—226垦医堂捡验杂志20o2年8月第3卷第4期cbine cationtestforNeisseria蛐眦Ill0朗eandotherrapidmethods.JOinMicro—bid,1993,31:1996-1999.[5]PadhyeAA,s;商tllG,Me]ml~linD,ela1.c0q脚veevahiati~0fdwⅢm血leDNApand8nexoantigentestforrapididentifieatkmofH-塔placElp日d砷Im.JClinMici~ol,1992,30:3108—3111.[6]nAA,SmithG,Sumd~lPG,eta1.C(~al-aliveevahiati~0fdwⅢm血le咖tDNApmbeassaysandexoantigeatestsforrapididentifi一ofBl哪∞dennatitidisandCoecidioidesinanitis.JaMierobi—ol,1994,32:867-870.[7]WesfinL,MiuC,V ollmerD,ela1.Antimierohialresistanceandbac—terialidentificationll曲r-gamicmelectnmlcchiparray.JC1inMierobiol, 2001,39:1097-1104.[8]山0nyRm,BrownTJ,FrenchGL.P,~pid吐ofbacte~miabyu—nivel~al口c越i∞of23Srib0∞malDNAfollowedbyhybridiTnli~to蹰diganudeoddearray.JOinMierobilo,20OO,38:781-788.[9]TmeschA,NguyenH,MiyMaCG,ela1.Mycobacterinmspeciesidenti—fieatimaand呷resistancetestingwithhigh-densityDNAprobeair—rays.JOinMidD0b,1999,37:49-55.[10]WoeseCR.Bacterialevolution.MierobiolRev,1987,51:221-271.[11]i9d.1U,S,HmakZ,ela1.unbohemicumsp.Nov,anewslow-g~wing吕c0t0c|uc0I瑚llicmycobacterium.IntJSystBacteriol,1998,镐Pt4:1349—1355.[12]StackebrantE,BML.Taxonomicnote.*AplaceforDNA-DNA16SrRNAreamociatkmand16SrRNAse【IIlmm面inthepresem speciesJefinifi~inRac~do,1994,44:846-849.[13]Kmun~dS,EzakiT.P10p0s日l0fM't叫pe删Imsp,nov.,n衄.Bey.,andelevation0fMyc0bacteIumchelanae.Abfl~58sus (gubicael81.)tospecies或姐ls:Mycobacteritmabscessuscomb.1ntJSy吐Bacteriol,1992,42:240-245.[14]姆B,B0n8efEC,KirsehnerP,ela1.ehylog~yoftheMycobac—t~rimaehel~aae-likem孕Ⅱli∞based∞muc0lliaⅡn印.1ntJSystBacteri—ol,1995,45:262-267.[15]TangYW,WllisNM,H0pkinsMK,ela1.c0D】pofphenotypicand$m0typictedliforidentificationofunusualaerobicIl}cgram-ne~mivebacilli.JClinMierobid,1998,36:3674-3679.[16]R0g日llT,FolhrT,B吣8efEc.Differeatiatimaof∞speciesbydimct嘤IerlciIlgofamplifiedDNA.JGenMicrobiol,1990,136: 1915.1920.[17]WoeseCR,Gutell,R,R,ela1.Detailed~lysisofthehigher- onterstmelureof16S—likefibosamalribonudeicacid.MicrobiolRev,l983,47:621-669.[18]MicmSeq16SrRNAgellekitprotoco1.AppliedBibsystoms,ForestCity. CA,2000(www.appliedbiosystems.n)V01.3.No.4[19]PatelJB,LeonardDG,Panx,ela1.Sequence-treedidentificationof MycabaeleriumspeciesingtheMiamSeq50016SrRNAbacterialidemi—ficati~nsystem.JClinMierobinl,20O0,38:246-251.[20jHarmsenD,Rothgan~rJ,SingerC.ela1.Intuitivehypem~一based molecularident击c越i∞ofmlcro-organi~.Lancet,1999.353:291 [21]HeftingLW,Anderss~Mr,BeevRE,ela1.Seq∞lcelld嚼mi婶inthetwo16SrRNAgenesofPh43[1~lmlleafphytopl~.AEnvironMierobiol,1996,52:3133-3139.[22]Myl"mmS,DennisPP.stxHlcekte∞学tybetweenthetwogenesalo0d16SrRNAthehalopilicⅢdm畦numHaloanmhimmormi.Cdmetics,1992,130:399-410.[23]NubdU,E|哪B,FdskeA,ela1.:st碍黜kte加孽啦姬罄of∞o0ditlg16SrRNAinPamitmeillmPdymyxadetectedbyt日呷dI- tlIIegnldielltgdd舡qlIl0resis.Jlhelefiol,1996,178:5636-5643. [24]WangY,∞gZ,RammanN.'Iheactin~eeleYh containstwodistincttypesofumse~pamallyactive16SrRNAgenes.J Bacteriol,1997,179:3270-3276.[25]UedaK,SekiT,Kadoela1.Twodistinctmechanismse~tlBeht舡l皿of16SrRNA.JBactefiol,1999,181:78-82.[26]NinelB,MonodM,BS,ela1.Twodiffe~mt16SrRNAgenesinamy~alstrain.JCIilIMierobid,1996.34:253l36.【27JReisehlU,FeldmannK,Nm~rmmnL,el81.16SrRNAsequencediw- sityinMyc0∞~Latmnstrainscausedbylmmenceoftwodimmmt copiesof16SrRNAgeme.JClmMierobid,19911.36:1761.1764.[28jKersdmerP,SpB,V耐U,ela1.:C,etm~icidentifiealimof mycohaelefiabynudeicacidse∞∞山把m面妇l:-Retxata2-year既pe,联,inaclinicallab0咖.JClinM|a[0b,1993,31:28.2889.[29jTangYW,V∞GraevmitzA,WaddingtmMG.ela1.Identificationof corynefarmhacterialLsohtesbyribosaa~DNAssequenceBlym.Jdin Mier~iol,2OOO,38:1676-1678.[30]RemmDA,I_outit】s,Sehnfidt1M,ela1.TheaSmtofba础I曩yan- Oom~sis:An却岫dltotheed盈ofulaxdan~p啊曲.NBJMad,1990,323:1573.1580.[31JRelmanDA,SdlmidtTM,MacDetm~lip,ela1.Ideafifieatimofthe unculturedbacilhsofWhln,lesdisease.NBJMed,1992,327:293—301.[32jck咄JE,∞gQ,HewardS.16SrRNAsequence∞Blysis∞are- al-timeadditiontotheclinicalmicrobiology1a咖.C,ene~Meetingof theSll~iP_,anSocietyrdMicrohidogy,Orlando,FL,May20-24,2001 (abstr).'(收稿日期:2OO2-O5-25)欢迎订阅中国卫生检验杂志(双月刊)中国科技核心期刊邮发代号:36—84中国科技论文引文统计源期刊每本定价:12:00元全国各地邮局订阅。