当前位置：文档之家 › 免疫学实验抗血清制备及抗体效价检测ppt 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术

免疫学实验抗血清制备及抗体效价检测ppt 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术

  • 格式：pdf
  • 大小：1.69 MB
  • 文档页数：42

下载文档原格式

  / 42

合集下载

免疫原和抗血清的制备PPT课件

免疫原和抗血清的制备PPT课件

（六）亲和层析
亲和层析是利用生物大分子的生物学特 异性，即生物分子间所具有的专一性亲 和力而设计的层析技术。例如抗原和抗 体、酶和酶抑制剂、酶蛋白和辅酶、 DNA 和 RNA 、激素和受体等 之间有特 殊的亲和力,在一定的条件下,二者能紧 密地结合成复合物。如果将复合物的已 知一 方固定在固相载体上,则可从溶液 中专一性地分离和提纯另一方。
上清液中含有 可溶性抗原
上清 1万—2万转/分，20到30分钟
沉淀
2. 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备
制备抗原的细胞包括正常细胞、传代细胞或 病理细胞 ( 如肿瘤细胞 )。
(1) 反复冻融法；(2) 超声破碎法；(3) 自溶 法；(4) 酶处理法；(5) 表面活性剂处理法。
( 二 ) 超速离心分离法
绵羊红细胞、细菌、毒素、寄生虫和真 菌抗原的制备
二、可溶性抗原的制备和纯化
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、细菌毒素、 酶、补体和核酸等都是良好的可溶性抗 原。
（一） 组织和细胞粗抗原的制备
1. 组织细胞抗原的制备所用组织必须是新鲜
的或低温保存的。
高速组织捣碎机
器官或者组织
处理
粉碎 研磨法
离心3000r/min，10分钟
一、佐剂的种类
1. 具有免疫原性的佐剂 如卡介苗、枯草 分支杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、 革兰阴性杆菌内毒素 ( 脂多糖 ) 和细胞 因子等。
2. 非免疫原性佐剂如氢氧化铝、磷酸铝、 磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、 藻酸钙、多聚核昔酸和胞壁肽等。
1. 福氏佐剂 (Freund adjuvant,FA) 是目 前动物免疫中最常应用的佐剂 , 可分为 福氏不完全佐剂 ( 石蜡油 + 羊毛脂 ) 和福氏完全佐剂 ( 石蜡油 + 羊毛脂 + 卡介苗 ) 两种 。

免疫原和抗血清的制备35页PPT

免疫原和抗血清的制备35页PPT
免疫原和抗血清的பைடு நூலகம்备
11、战争满足了，或曾经满足过人的 好斗的 本能， 但它同 时还满 足了人 对掠夺 ，破坏 以及残 酷的纪 律和专 制力的 欲望。 ——查·埃利奥 特 12、不应把纪律仅仅看成教育的手段 。纪律 是教育 过程的 结果， 首先是 学生集 体表现 在一切 生活领 域—— 生产、 日常生 活、学 校、文 化等领 域中努 力的结 果。— —马卡 连柯(名 言网)
13、遵守纪律的风气的培养，只有领 导者本 身在这 方面以 身作则 才能收 到成效 。—— 马卡连 柯 14、劳动者的组织性、纪律性、坚毅 精神以 及同全 世界劳 动者的 团结一 致，是 取得最 后胜利 的保证 。—— 列宁 摘自名言网
15、机会是不守纪律的。——雨果
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左

临床免疫学检验 抗血清制备PPT

临床免疫学检验 抗血清制备PPT

标准抗原 待测抗原
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
多价诊断血清
标准抗原 待测抗原
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
Cohn乙醇分段法
pH 乙醇浓度(%) 分段
分段组分（%） 纤维蛋原 白蛋白 α球蛋白 β球蛋白 γ 球蛋白
7.2
8
Ⅰ
61
7
8
15
9
6.8
25
Ⅱ+Ⅲ 5
4
6
48
37
Fc
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
七)、纯化抗原的鉴定： １、免疫双扩散法 ２、免疫电泳法 ３、聚丙烯酰胺凝胶电泳法
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
IgM IgG
白蛋白
Sephadex G-200凝胶
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke
Central south university department of clinical immunology Gongdaoke

4-2抗体的产生和制备 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术

4-2抗体的产生和制备 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术

4.6 抗体的产生和制备4.6.1 抗体生物合成的一般性和特殊性抗体合成过程1、在DNA转录及mRNA剪接之后，携带遗传信息的mRNA移至粗面内质网上的核糖体，轻链在190-200S小多聚核糖体（含4-5个核糖体）上合成；重链在270-300S大多聚核糖体（含11-18个核糖体）上合成。

2、重链、轻链从粗面内质网进入光滑内质网中，装配为四肽链。

H+L→HL；HL+HL→H2L2 或H+H→H2、L+L→L2；H2+L2→H2L23、装配好的Ig分子进入高尔基体，然后向细胞膜移动，在移动过程中加糖，形成完整的Ig分子后，分泌到细胞外。

抗体的生物合成过程4.6.2 抗体产生多样性的分子生物学基础日本科学家利根川进在20世纪70年代阐明了免疫球蛋白的基因结构，证实了其基因的重排和突变是抗体多样性的原因，使免疫球蛋白多样性的遗传控制找到了依据。

1987年获得诺贝尔生理和医学奖。

免疫球蛋白基因定位人的Ig的基因组成κ链：Vκ(约100个)、 Jκ(5个)、 Cκ(1个)λ链：Vλ(约30个)、 Jλ-Cλ(4个) H链：V基因(约95个)D基因(27个)J基因(6个)C基因(9个)轻链基因的重排重链基因的重排先重组的 V H D H J H基因片段可在不同的C H基因之间转换，使 B 细胞经过同一抗原刺激后合成具有不同 C 区的各种类别 Ig，并可介导不同的效应功能。

Ig的类别转换（class switching）B 细胞最初表达 IgM 和/或 IgD，然后 DNA 进一步重组。

一个B细胞克隆在分化过程中V-D-J功能性基因片段保持不变，而发生C基因重排，使其表达的抗体分子发生H链类的改变，称为类别转换。

B细胞克隆→ IgM →抗体类别转换抗体产生多样性的途径人免疫球蛋白各组成成分的多样性估量基因片段重链轻链( 组合) H κλV基因 100-1,000 100 10 D基因 20 0 0 J基因 6 5 6 V ×J(×D)基因 12,000-120,000 500 60重链－轻链组合H×κ 6×106-6×107H×λ 7.2×105-7.2×1062、重组基因连接的多样性D H -J H 、VH -DH 、JH和V L、J L的交接处出现的连接方式不够明确D region T GG C C C Pro Trp C C C C C C V geneT G G D region C C C C C C V gene T GG C G G C C C Pro ArgC C C C C C V geneT GG D region C GC C C C Pro Pro密码子内发生的连接位置的多样性由于连接方式不明确，导致读码框架移动CAG C CG GAT CAGCAGCGATCAG-GTCAATG-GTCAATG -+Break DNAN region insertionIntron J D J J J DD D N 区 核 苷 酸 插 入（V D J 衔接点的插入方式之一）3、体细胞基因突变只改变VJ或VDJ单个片段的个别核苷酸二、在蛋白质水平上：由轻链和重链的随机选择和配对引起4.6.3 抗体产生的一般规律抗体产生的一般规律4.6.4 抗体产生的机理4.6.4.1模板学说（诱导学说，t e m p l a t e theory）2、间接模板学说：4.6.4.2 选择学说（selective theory ）自然选择学说→克隆选择学说（c l o n a lselective theory ）（无性繁殖系选择学说或细胞选择学说）克隆选择学说基本论点（基本要点）克隆选择学说的证据n通过动物模型实验：n选择性的去除某细胞株后，再经相应抗原剌激而不能发生相应免疫反应：抗原A剌激而不能发生相应免疫反应，克隆选择学说亚细胞选择学说从分子水平上解释克隆选择学说（无性繁殖系选择学说）：4.6.5 影响抗体生成的因素4.6.5.1 机体的免疫功能1）、遗传因素（应答者）A、种类的影响：肺炎球菌多糖 →小鼠→有反应肺炎球菌多糖 →豚鼠→无反应艾滋病毒→某些人类→有反应艾滋病毒→非洲绿猴→无反应B、品系的影响：多聚L赖氨酸→豚鼠2系→有反应多聚L赖氨酸→豚鼠13系→无反应C、个体免疫差异艾滋病毒→一部分人→有反应艾滋病毒→另一部分人→无反应如肯尼亚“买春女“→无反应n 2）、生理因素：年龄、营养、健康状况和激素水平（神经与内分泌系统对免疫功能的影响）。

7-1 免疫学技术 血清学技术 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术

7-1 免疫学技术 血清学技术 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术
3)结合价：Ag为多价，Ab为二价或二价以 上。多价才形成网状结构的凝聚物。
2.外在因素
抗
复
适宜
合 抗体过剩
原
物
抗原过剩
抗
沉 淀
体
量
抗原浓度
的
结
合
比 例
抗体过剩,形 成最小的沉淀 物
抗原抗体比例 合适,形成最大 的沉淀物
抗原过剩 成最小的 物
2) 电解质（NaCl） 3) pH值： 4) 温度：
加入标准抗原 致敏的RBC
标准抗体
待测抗原
形成抗原抗 体复合物
发生凝集抑制
间 接 血 凝 抑 制 试 验 结 果
7.1.5.4 协同凝集试验 （Co–agglutination）
原理：
反应过程：
协同凝集反应
含A蛋白的金黄 IgG
色葡萄球菌
与IgGFc段结合的 金黄色葡萄球菌
相应抗原
发生协同凝集反应
3、植物病毒检测中的应用
免疫学方法已被植物病毒学家广泛应用 于植物病毒的检测，病毒病的普查、口岸和 产地检疫等。如ELISA方法,具有灵敏度高 快速等特点。
4、生物学上的应用 A、物种的分类鉴定：动物、植物、微生物的鉴
定，品种品系、血清型；各种生物之间的差异 都可表现在抗原性不同，物种种源越远，抗原 性差异越大，可用区分抗原性的血清学反应， 进行包括微生物在内的物种鉴定、物种的分类 等。
中和反应
RBC
噬菌体 或病毒
抗体 产生血凝抑制
思考题
胶为
普查肝癌甲胎蛋白；采用聚苯乙烯乳
7.1.5.3 间接凝集抑制试验
原理：待检的可溶性抗原与相应抗体混合后，经一 定时间后加入用同一抗原致敏的载体颗粒，将因抗 体已被先加入的抗原结合而不能再与致敏的颗粒结 合，因此不能出现凝集现象，此为阳性反应；若待 测样品中无相应抗原，加入抗体后，再加入致敏颗 粒，抗体则与致敏颗粒结合而出现凝集现象。

免疫学实验抗血清制备及抗体效价检测ppt 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术

免疫学实验抗血清制备及抗体效价检测ppt 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术
清颜色；去血块，离心取上清（3000rpm,20min），加 叠氮钠（终浓度为0.1%，注意防护！！），混匀，分装 小管，作好标记，-20或-80℃保存待测。
实验三：抗体效价检测
（一） 间接ELISA法测定 （二）双向免疫扩散试验测定
ELISA原理
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay， 简称ELISA)是在免疫酶技术的基础上发展起 来的一种新型的免疫测定技术。ELISA过程包括抗 原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体( 抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的 底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收 计算抗体(抗原)的量。
双扩实验步骤
1、融化凝胶、倒胶制备凝胶板（每人1板）。 2、Ag、Ab稀释（见图、4人1套）。 3、打孔、点样（加Ag、Ab，每孔8ul）。 4、37℃保温保湿扩散1d，结果观察。
记号：学号
01
ck
Ab低浓度 Ag高浓度
Ab高浓度 Ag低浓度
Ag：牛血清白蛋白
Ag稀释示意图
0.10ml
生
0.10ml
动物抓取方式
动物控制和免疫演示……
实验二：抽血、放血，分离抗血清
颈静脉或颈动脉采血
尾 部 采 血
（一）耳静脉抽血
• 用于小量抽血，验血测抗体效价，以便决 定加强免疫或放血。
• 与耳静脉注射方式相反。
（二）心脏抽血
• 家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心 脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的 12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注 射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再重 复上述操作继续抽血，直至抽完。

最新整理抗血清制备及抗体效价测定培训讲学

摘要 (4)【实验过程】 (4)PartⅠ. NDV 抗血清制备 (5)一、实验原理 (5)二、实验仪器、材料和试剂 (6)1. 仪器 (6)2. 材料 (6)3. 试剂 (6)三、方法和步骤 (6)（一）NDV 兔抗血清制备 (6)1. 家兔捉拿方法 (6)2. 家兔固定方法 (7)3. 初次免疫 (8)4. 二次免疫 (8)5. 终末免疫 (8)6. 试血 (8)7. 颈动脉放血 (8)8. 血清分离 (9)9. 抗血清保存 (10)（二）NDV 鼠抗血清制备 (10)1. 小白鼠的捉拿和固定 (10)2. 初次免疫 (10)3. 二次免疫 (12)4. 终末免疫 (12)5. 试血 (12)6．放血 (13)7．血清分离 (14)8．抗血清保存 (14)Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价 (14)一、基本原理 (14)二、实验仪器、材料和试剂 (14)1. 仪器 (14)2. 材料 (14)3. 试剂 (15)三、方法和步骤 (15)1. 灭活鸡新城疫病毒Ulster 2C 株抗原提取 (15)2. 1%琼脂糖配制 (15)3. 倒平板 (15)4. 打孔 (15)5. 稀释抗血清 (16)6. 加样 (16)7. 孵育 (16)8. 结果观察 (17)Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定NDV 抗血清效价 (17)一、基本原理 (17)二、实验仪器、材料和试剂 (17)1. 仪器 (17)2. 材料 (18)3. 试剂 (18)三、方法和步骤 (18)1. 鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活抗原提取 (18)2、抗原包被 (18)3. 封闭 (18)4. 洗板 (18)5. 稀释抗血清 (18)6. 加抗血清 (19)7. 洗板 (19)8. 加酶标二抗 (19)9. 洗板 (19)10. 显色 (19)11. 终止 (19)12. 读数 (20)13. 结果判定 (20)Part Ⅳ. 免疫印迹实验鉴定抗体的特异性 (20)一、基本原理 (20)二、实验仪器、材料和试剂 (21)1. 仪器 (21)2. 材料 (21)3. 试剂 (21)（1）SDS-PAGE 相关试剂： (21)（2）Western blotting 相关试剂： (21)三、方法和步骤 (22)1. SDS-PAGE (22)2. 转膜 (23)3. 免疫检测 (24)（1）膜的封闭 (24)（2）洗膜 (24)（3）加入一抗 (24)（4）洗膜 (24)（5）与二级抗体作用： (24)（6）洗膜 (25)（7）Odessey 近红外成像仪扫描成像 (25)【实验结果及分析】 (25)NDV 抗血清制备及抗体效价测定摘要：抗血清，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。

免疫学实验抗血清制备及抗体效价检测 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术


v 10月14日 2.0ml 耳静脉
v 10月25日 2.5mL 耳静脉
一、采血
（一）心脏抽血
v 家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心 脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的 12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注 射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再 重复上述操作继续抽血，直至抽完。
v 将双扩实验结果用铅笔绘图并分析判断： （1）待测Ag中至少有几种组分？ （2）待测Ag各组分相对应的Ab的效价？
如：待测抗原组分一相对应的抗体的效价为1：X。
v 注意沉淀线的数量、部位、走向、粗细、 清晰度等。
★结果分析
v 1、本实验采用的是什么Ag、Ab？
v 2、 Ag、Ab为什么要设置一系列的 浓度 (方阵排列) ？ “效价”是指Ag的、 还是Ab的？与Ag、Ab的浓度有何关 系？
本次实验目的
1、分析待测抗原的组分数量； 2、测定各组分相应抗血清的效价。
以出现沉淀线抗体的最高稀释倍数为该抗 体效价。
1、融化凝胶、倒胶制备凝胶板（每人1板）。 2、Ag、Ab稀释（见图、4人1套）。 3、打孔、点样（加Ag、Ab，每孔8ul）。 4、37℃保温保湿扩散1d，结果观察。
记号：学号
四、免疫途径
五、免疫时间间隔
v 羊、马、鸡、猴、豚鼠、兔都是常用的免疫动物， 在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属 关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、 免疫血清的要求以及动物个体等因素。
v 免疫用动物应选适龄、健壮．最好为雄性。
v 最常用的实验动物是家兔，一般选择选择年龄在 6个月以上当年繁殖的♂性，体重2 ～3公斤，健 康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或 用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。

7-2免疫学技术 标记免疫分析技术 华中农业大学免疫学基础及免疫学技术


标记免疫分析技术根据标记物不同分为： 免疫荧光技术 放射免疫测定技术 免疫酶技术 免疫电镜技术 胶体金标记分析技术 发光免疫分析技术 以及由此延伸的其它各种免疫检测方法
用途：对样品进行定性、定位及定量分析。
1、荧光抗体的制备
2、抗原标本的制备
3、抗原与荧光抗 体反应
4、荧光显微镜观察
细胞
含义：
先用酶标记抗体（或抗原）与被检样中的相 应抗原（或抗体）结合后，可形成抗原-抗体-酶 复合物，在相应底物作用下，产生可溶或不溶有 色反应产物，此产物颜色深浅与标本中的抗原 （或抗体）的结合量成正比。
免疫酶技术的种类
免疫酶技术按照抗原抗体系统是定位于组织细胞上还是存在 于液体样品中分为:
免疫酶组织抗原定位法（免疫酶定位技术，免疫酶组织化学技术）
凝集抑制试验 乳等颗粒和各种凝集 +++
协同凝集试验 现象
+++
抗球蛋白试验
+++
补体参与反应 补体溶血试验 以裸眼或光电比色仪 ++ 补体结合试验 观察测定溶血现象 +++
中和反应 病毒中和试验 病毒感染性丧失 + 毒素中和试验 外毒素毒性丢失 ++
免疫标记技术 荧光免疫技术 检测荧光现象
++++
125I是最常用的标记物
- 表达式： *
*
*
结合的Ag*；
游离Ag*
待测Ag 标记Ag
+
+
Ab
B
F
游离的标记Ag
B
F
结合的标记Ag
结合率（B/F)的计算

1-1 免疫血清制备及效价测定-1


尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。
这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损
伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器
官。
3. 尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮
下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后
在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，
6
实验内容
1、免疫动物
初次免疫小鼠为腹腔注射40%绵羊红细胞 （SRBC）0.2ml，以后分别于第4天、第7天和第10 天时间，以相同免疫剂量、相同免疫途径加强免疫。
精选版课件ppt
7
精选版课件ppt
8
小鼠腹腔注射
1. 小鼠腹腔注射可以用1ml的注射器，配合4号针头。
2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的
• 免疫原性的本质——异物性
• 与机体亲缘关系越远，组织结构的差异越 大，异物性越强。
精选版课件ppt
4
精选版课件ppt
5
实验材料
1. 40% SRBC
2. 18-22g的BALB/C系小白鼠
3. 无菌1ml 注射器
4. 抗凝剂（枸橼酸钠或肝素）
5. 新鲜豚鼠血清（作为补体用）
6. 小试管等
精选版课件ppt
定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原决定簇受体的B淋巴细胞系产生
针对该决定簇的抗体，因此用抗原免疫动物获得的免疫血清一般为多克隆抗体
（polyclonal antibody）。
制备的免疫血清的质量（特异性、亲ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ力及效价高低）受多种因素的影响，
主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

玻片法---人血型鉴定结果判断
标准抗A血清 标准抗B血清
O型 B型 A型 AB型
双向免疫扩散
实验原理：将可溶性抗原和相应抗体分别加到琼 脂糖凝胶板相对应的孔中，两者各自向四周 扩散，若二者相对应，在比例合适处会形成 白色沉淀线。若同时含有多种抗原抗体系统， 则在琼脂层中形成多条沉淀线。同时，还会 因抗原抗体的相对浓度、分子质量的差异而 使沉淀线的部位、形状出现差异，从而对抗 原进行定性、半定量及组分分析，对抗体进 行定性及效价测定等。
动脉开口示意图
正上方
B止血钳
正上方
c止血钳
身
头
E开口处
下前方
占血管直径1/3
A系索线角瓶0.5-1h； 2、用无菌玻棒剥落、松动瓶壁上的血块（利于血清析出）； 3、原样包扎好，做好记号，放进冰箱（4℃）过夜； 4、次日（时间待定）：估计各班分离的血清量并观察描述血
清颜色；去血块，离心取上清（3000rpm,20min），加 叠氮钠（终浓度为0.1%，注意防护！！），混匀，分装 小管，作好标记，-20或-80℃保存待测。
实验三：抗体效价检测
（一） 间接ELISA法测定 （二）双向免疫扩散试验测定
ELISA原理
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay， 简称ELISA)是在免疫酶技术的基础上发展起 来的一种新型的免疫测定技术。ELISA过程包括抗 原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体( 抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的 底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收 计算抗体(抗原)的量。
编号标记方法
实验动物分组后，为了区分、观察并记录每个个体的 反应情况，必须给每只动物进行编号标记。
1．体表颜料着色法 一般对短期试验的白色动物 可用颜料涂搽被毛的方法标记。常用的涂染化学药品 有：
红色：0.5％中性红或品红溶液； 黄色：3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸 酒精饱和液； 咖啡色：2％硝酸银溶液； 黑色：煤焦油酒精溶液。
• 玻片法可用于细菌的快速鉴定和血型鉴定等，是一 种定性试验。
Ⅰ、试管法直接凝集试验方法和步骤：
1、Ag稀释（用生理盐水稀释B.t.H-Ag至相当于 McFarland比浊管第6支的浓度，约10亿/ml）：4人一 组，0.1-0.6mlAg到6ml生理盐水中。
2、Ab稀释（见图）：兔抗4人B.t.H-Ag抗体，4人一组 作1套抗体稀释。
目标：制备高效价的抗血清
1 实验动物的免疫反应性 2抗 原 的 免 疫 原 性 3抗 原 的 剂 量 4免 疫 途 径 5免 疫 时 间 间 隔
实验动物的选择
• 常用的免疫动物： 家兔、羊、马、大鼠、小鼠、豚鼠等。 • 免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性。家兔一般选择
选择年龄在6个月以上当年繁殖的♂性，体重2～3公斤，健 康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂 沫在动物的背部，作出明确的标记。 • 应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免 疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。
直接凝集试验
• 直接凝集试验原理：在电解质存在的情况下，颗
粒性抗原（如细菌菌体或鞭毛、红细胞等）与相应 抗体混合一定时间后，发生特异性结合而生成抗原 抗体复合物，便可出现肉眼可见的凝集块。直接凝 集试验又分试管法和玻片法。
• 直接凝集试验用途： • 试管法不仅用于未知抗原（如细菌）或抗体的鉴定，
还可测定抗体的效价。
为避免伤及内脏，可使动 物处于头低位，使内脏移 向上腹。
免疫的时间间隔
• 可溶性抗原，首免3周后，二免后间隔10天 • 颗粒性抗原，1~2周/次
本季推荐免疫方案
免疫 免疫时间 次数 负责班级
家兔免疫途径
备注
初免 9月28日 脚掌0.2 ml，肌肉0.3 ml，皮 1：1混合完全 （生工） 下共 0.3 ml，耳静脉0.2ml 福氏佐剂
左前
腿上部为
1，左腰 部为2， 左后腿为
3，头部 为4，背 部为5， 尾基部为
6，
右侧从前至后依次为7、8、9。用黄 色表示个位数，红色表示十位数。
抗原的免疫原性
• 完全抗原 or 半抗原？ 半抗原+蛋白质载体
• 免疫原性强 or 弱？ 免疫原性弱的抗原+佐剂
免疫的剂量
合成免疫原为2mg(半抗原约为20～200 μg)。
间接ELISA法原理
间接ELISA法实验方法和步骤
1、Ag包被过夜：用包被缓冲液稀释Ag至10 μg /ml），每孔加100 μl，4 ℃ 过 夜。次日用PBST满孔洗涤3次。 2、加待测一抗孵育：用PBST倍比稀释Ab至1：500，1：1000，1：2000，1： 4000，1：8000，1：16000，1：32000，1：64000，1：128000，取100 μl 加入 到已包被Ag的孔中，每个稀释度加3个孔(同时做空白、阴性及阳性孔对照) ， 37 ℃ 孵育1h。 PBST满孔洗涤4次，在吸水纸垫上拍干。 3、加酶标二抗：于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(按说明书的要求 以PBST进行稀释) 100 μl ， 37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 4、加底物液反应显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml， 37℃显色10～30分钟。 5、终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50 μl 。 6、结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD 值，若大于0.2且为阴性对照OD值的2.0倍，即为阳性。
如：待测抗原组分一相 对应的抗体的效价为1： X。 汇总本组实验结果， 以出现沉淀线抗体的 最高稀释倍数为该抗 体效价。
Thanks for your attention
E-mail：hym@
实验结果
管 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
号
ck
稀 释 倍 数
凝 集 程 度
待测抗体的效价是1：？
Ⅱ、玻片法—血型鉴定（兴趣实验）
实验材料：
1、Ag：受检血样（红细胞悬液） 2、Ab：标准抗A血清、标准抗B血清
（单克隆抗体，不同于标准A型血清、 B型血清）。
实验方法和步骤：
以出现50%凝集（++）的抗体最高稀释 倍数，为抗体的效价。
凝集反应程度的判断标准：
++++ 100%凝集（完全凝集，上层变清） +++ 75%凝集（绝大部分凝集，上层略浑） ++ 50%凝集（部分凝集，上层较浑） + 25%凝集（很少部分凝集，上层浑浊） - 无凝集（液体浑浊，与阴性对照管相同）
0.10ml
理
Ag
盐 水
2X 4X 8X 16X 32X
学号 01 02 03 04
Ab稀释示意图
0.10ml
生
理
抗 0.10ml 0.10ml
盐
体
水
2X 4X 8X 16X 32X CK（无抗体）
兔抗牛血清抗体或兔抗牛血清白蛋白抗体
次日观察双扩实验结果， 用铅笔绘图并分析判断：
待测Ag各组分相对应的 Ab的效价？
（三）颈动脉放血
• 家兔固定（仰卧，身体及头部固定）---剪毛（颈部）---找颈动 脉管（消毒---剖开颈部；开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动 脉管（桃红色，有脉动））---小心分开动脉上的肌肉、神经（2 条，白色）等---开口（见图）---放血，接入100ml无菌空三角瓶。
• 注意：看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、钝玻棒。注意不 要剪破毛细动脉管！！！
3、加Ag到Ab稀释管。 4、37℃水浴2-4小时。 5、结果观察及判定Ab的效价。
抗体的稀释示意图
生理盐水
注意事项： 1、每一稀释度需换一个枪头； 2、对照管不可加入抗体。 3、抗原、抗体不可在凝集管外相混；抗原 （抗体）不可混入生理盐水瓶。 4、半小时后可以看初步的结果。
H抗原
试管法直接凝集试验结果判断
动物抓取方式
动物控制和免疫演示……
实验二：抽血、放血，分离抗血清
颈静脉或颈动脉采血
尾 部 采 血
（一）耳静脉抽血
• 用于小量抽血，验血测抗体效价，以便决 定加强免疫或放血。
• 与耳静脉注射方式相反。
（二）心脏抽血
• 家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心 脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的 12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注 射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再重 复上述操作继续抽血，直至抽完。
双扩实验步骤
1、融化凝胶、倒胶制备凝胶板（每人1板）。 2、Ag、Ab稀释（见图、4人1套）。 3、打孔、点样（加Ag、Ab，每孔8ul）。 4、37℃保温保湿扩散1d，结果观察。
记号：学号
01
ck
Ab低浓度 Ag高浓度
Ab高浓度 Ag低浓度
Ag：牛血清白蛋白
Ag稀释示意图
0.10ml
生
0.10ml
实验内容
主线：抗血清制备及抗体效价检测
实验一：免疫（4学时） 实验二：抽血、放血，分离抗血清（4学时） 实验三：抗体效价检测（12学时）
（一）ELISA （二) 双向免疫扩散试验 （三）血型鉴定
实验一：免疫
抗血清制备的原理
用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体 后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分 泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免 疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后 采集动物血液，再从血液中分离析出血清， 从而获得抗血清。
家兔为300～600 μg/次（400），每次不超 过2mL；小鼠为10～100 μg /次（10-20），