生物化学实验 血清、乳蛋白含量测定

酚试剂法（改良 Lowry 法）测定血清蛋白质含量【目的】1 ．掌握酚试剂法测定蛋白质含量的含量与操作技术。

2 ．熟悉标准曲线的制作方法和分光光度计的应用。

【原理】蛋白质分子中所含的肽键在碱性溶液中与 Cu 2+ 络合产生紫红色化合物 ( 双缩脲反应 ) ，同时使肽链展开，其中带有酚基的酪氨酸残基充分暴露，后者在碱性条件下使酚试剂中磷钨酸 - 磷钼酸还原，生成钼蓝和钨蓝的化合物，其蓝色深浅与蛋白质含量成正比，与已知浓度的标准蛋白质溶液进行比色，即可计算出测定样品中蛋白质的含量。

酚试剂法测定样品中蛋白质的含量，其特点为方法简便，灵敏度高，能够测定2 ～100 μ g 的微量蛋白质。

其方法比凯氏定氮法操作简便，其灵敏度比双缩脲法高 100 倍左右。

因此经常被用于科研与临床检验。

【器材】1 ．座标纸2 ． 50ml 容量瓶3 ． 722 型分光光度计【试剂】1 ．碱性铜试剂甲液称取无水碳酸钠 2 . 0g ，溶于 0 . 1mol ／ L 氢氧化钠溶液 100ml 中。

乙液取硫酸铜(CuSO 4 ·5H 2 O) 0 . 5g 溶于 1 ％酒石酸钾溶液 100ml 中。

临用前取甲液 50ml, 乙液 1ml 混合，即为碱性铜试剂。

2 ．标准蛋白质溶液 ( 0.25g /L)准确称取结晶人血清清蛋白 25mg ，溶于 0 . 9 ％氯化钠溶液中，以容量瓶定容至 100ml 。

3 ． 0 . 9 ％氯化钠溶液4 ．酚试剂（有成品出售）取钨酸钠(Na 2 WO 4 ·2H 2 O) 100g 和钼酸钠(Na 2 MO 4 ·2H 2 O) 25g , 溶于 700ml 蒸馏水中，再加入 85 ％磷酸 50ml 和浓盐酸 100ml 混合，置于1500ml 圆底烧瓶中温和地回流 10h ，回流结束后加入硫酸锂(LiSO 4 ·H 2 O) 150g ，水 50ml ，溴 3 ～ 4 滴，除去回流装置，继续沸腾 15min ，以除去剩余的溴，冷却后稀释至 1000ml ，过滤，溶液应呈黄色或金黄色 ( 如带绿色者不能使用，应继续加溴煮沸 ) 。

血清蛋白含量测定实验报告实验目的：本实验旨在通过测定血清中蛋白质的含量来了解血清的营养状态，并探究不同条件下血清蛋白含量的变化情况。

实验原理：血清是血液中去除了红细胞和凝血因子的部分，主要由蛋白质组成。

蛋白质含量是衡量血清中营养状况的重要指标之一。

本实验利用比色法测定血清中总蛋白质的含量，其原理是利用试剂与蛋白质发生特定颜色的反应，通过光度计测定反应产物的吸光度来推算蛋白质的浓度。

实验步骤：1. 准备工作：取适量标准蛋白溶液（如丙酮酸钙溶液）按一定比例稀释，制备一系列标准溶液，其浓度分别为1、2、3、4、5 g/L。

2. 取血清标本：从受试者血液中取得一定量的血清标本。

3. 样本处理：将血清样本与提取试剂按照一定比例混合，待沉淀形成后，离心分离，收集上清液。

4. 加入试剂：将上述收集到的上清液分别与试剂液按照一定比例混合，充分搅拌，反应一定时间。

5. 测定吸光度：将反应溶液分别放入光度计中，设置为适当的波长，记录吸光度值。

6. 绘制标准曲线：将实验得到的吸光度值与对应的标准溶液的浓度进行配对，绘制标准曲线。

7. 测定血清样本：将血清样本与试剂按照一定比例混合，重复步骤5，测定吸光度。

8. 计算血清蛋白含量：根据标准曲线，将血清样本的吸光度值转换为蛋白质的浓度。

实验结果与讨论：根据实验步骤进行操作并记录各个标准溶液和血清样本的吸光度值。

根据标准曲线计算出血清样本中蛋白质的浓度。

讨论血清蛋白含量的变化情况，可以比较不同个体、不同年龄段或不同疾病状态下的血清蛋白含量是否存在显著差异。

并结合其它相关指标进行综合分析与判断。

结论：根据实验数据计算出的血清蛋白质含量为X g/L，证明了血清样本中存在蛋白质，并可作为评估营养状况的指标。

实验结果进一步揭示了血清蛋白质含量在不同条件下的变化情况，为疾病诊断、个体健康管理等提供了一定的参考依据。

乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测YLNB 2.8一、凯氏定氮仪常量检测法1.原理样品中加入催化剂和浓硫酸，经加热后硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。

有机物被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质的氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵，硫酸铵在碱性溶液中进行蒸馏。

将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，再用酸标准溶液滴定，根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质含量。

2.试剂所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。

2.1浓硫酸2.2硫酸钾2.3硫酸铜2.4氢氧化钠溶液：400g/L2.5硼酸溶液：30g/L2.6甲基红一澳甲酚绿混合指示剂：用体积分数为95%的乙醇，将澳甲酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液，使用时按1g/L澳甲酚绿：1g/L甲基红为5： 1的比例混合。

2.7硫酸标准溶液：c (H+)=0.1000±0.005mol/L2.7.1标准溶液的配制：取3ml浓硫酸加到15ml水中，冷却后洗入1000ml容量瓶中，定容。

2.7.2标准溶液的标定：（见GB/T601-2002 ）2.7 3硫酸铵：干燥后最低含量99.9%,使用前直接将硫酸铵在102±2℃干燥至少2h，在干燥器中冷却至室温。

3.仪器及器材3.1凯氏定氮仪，包括消化炉、废气排放装置、蒸馏单元及电位滴定仪3.2消化管，适用于凯氏定氮仪（3.1）3.3接收瓶：300ml三角瓶或烧杯4.方法4.1样品称取4.1.1原料奶和纯牛奶样品：称取约5g4.1.2乳饮料：称取约8g4.1.3冰淇淋：称取约5g4.1.4乳粉：称取约0.5g4.2测量4.2.1消化4.2.1.1将上述样品称入消化管中，同时称取5g硫酸钾，0.5g 硫酸铜，然后加入15-20ml浓硫酸，将消化管放入消化炉中，将温度旋钮设定在大约6档左右，连接好排气装置并打开开关，开始进行消化，消化30分钟或直到白烟消失后，将消化炉旋钮调节至9档，继续消化直到消化液透明。

动物生物化学实验教程正式实验一血清蛋白质含量测定牛血清蛋白：BSA。

血浆：指血液的液体成分，淡黄色（因含胆红素）。

含白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原。

血液经抗凝处理、离心沉淀后，获得的液体部分。

血清：血液凝固后，释出的液体。

不含纤维蛋白原及游离钙离子。

蛋白质定量分析是动物生物化学和其他生命科学研究中经常用到的实验项目。

蛋白质是生物体内最为重要的生物大分子之一，其种类繁多、结构多样、功能各异，而且分子量相差很大，所以很难建立一个理想而通用的蛋白质定量分析方法。

目前测定蛋白质含量的方法很多，常用的测定方法有Folin—酚法（Lowry法）、紫外吸收法、凯氏定氮法、考马斯亮蓝染料结合法等，每种方法在实践中都有其优点和局限性。

本实验采用考马斯亮蓝染料结合法（Bradford法）。

(灵敏度最高)一、实验目的1．掌握分光光度法测定的原理，分光光度计的结构和基本操作要点（光源-单色器-样品室-检测器-显示器）2．掌握考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的原理和操作方法3．掌握微量移液器的使用方法4．了解蛋白质含量测定中标准曲线的制作方法二、实验原理染料考马斯亮蓝G-250（R250，结合后可以解离）在游离状态下呈红色，最大吸收峰为465nm。

它能与蛋白质的疏水微区结合，形成蓝色复合物，该复合物的最大吸收峰为595nm，在一定浓度范围内（为什么在一定范围内），其吸光度值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质含量的测定。

三、实验操作步骤表1-1考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量试管号稀释的血清样品（mL）0.9%NaCl溶液（mL）考马斯亮蓝G-250溶液（mL）空白管-0.15样品管0.1-5室温静置5min，于波长595nm处，以空白管调“0”，测定样品管的吸光度值，查标准曲线，吸光度测定值所对应的蛋白质浓度就是稀释样品的蛋白质含量，然后乘以血清的稀释倍数（10倍），可得血清中蛋白质的含量。

四、实验试剂1．考马斯亮蓝G-250溶液（0.01%）：称取考马斯亮蓝G-250100mg，溶于50mL95%乙醇中，再加入100mL85%(W/V)浓磷酸，然后用蒸馏水定容至1000mL，置棕色瓶过夜（如有不容物，可用二层滤纸过滤）。

凯氏（ Kjeldahl ）微量定氮法测定血清蛋白质含量【目的】1 ．掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括未知样品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。

2 ．熟悉微量凯氏定氮法的原理。

【原理】凯氏定氮法是蛋白质含量测定的经典方法，它是根据蛋白质分子中含氮量来测定的，各种蛋白质含氮量比较近似，平均约为 16 ％，即 1g 氮相当于 6.25g 蛋白质。

由测定出的氮量即可换算出蛋白质含量。

血清蛋白质或其它有机含氮物与浓硫酸加热进行消化 ( 氧化 ) 时，其中碳、氢、氧元素分别被氧化为二氧化碳和水，而氮原子则转变成氨，后者与硫酸结合生成硫酸铵，留在溶液中，为了加速有机物质的氧化分解，在消化时加入硫酸铜做为催化剂，加入硫酸钾以提高消化液的沸点。

硫酸铵与氢氧化钠作用，放出氨，通过水蒸气蒸馏将氨带入接收瓶中被硼酸溶液吸收，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，用已知浓度的标准盐酸滴定，直至原来溶液中氢离子的浓度恢复，即指示剂变为原来的颜色。

根据所消耗的标准盐酸量，即可计算出样品中的总氮量。

化学反应式如下：1 ．消化含氮化合物 +H 2 SO 4 —→CO 2 ↑+H 2 O +(NH 4 ) 2 SO 4 +SO 2 ↑2 ．蒸馏(NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH—→2NH 4 OH+Na 2 SO 4NH 4 OH—→NH 3 ↑+ H 2 O3NH 3 +H 3 BO 3 —→(NH 4 ) 3 BO 33 ．滴定(NH 4 ) 3 BO 3 +3HCl—→3NH 4 Cl+H 3 BO 3以上测定为样品中的总氮量，由总氮量减去非蛋白氮，即为蛋白质含氮量，再乘以 6 . 25 即为血清蛋白质含量。

【器材】1 ．电炉2 ．铁三角架3 ．酒精灯4 ．锥形瓶5 ．消化管（凯氏烧瓶）6 ．滴定管7 ．微量凯氏定氮器8 ．刻度吸量管9 ．玻璃珠10 ．漏斗11 ．血清【试剂】1 ．硫酸钾粉末2 ． 12 . 5 ％硫酸铜水溶液3 ．浓硫酸4 ． 2 ％硼酸水溶液5 ．混合指示剂取 0 . 1 ％溴甲酚绿乙醇溶液 10ml 与 0 . 1 ％甲基红乙醇溶液 4ml 混合6 ． 30 ％氢氧化钠溶液7 ． 0 . 0lmol / L 盐酸标准溶液【操作】一、消化取消化管二支，标明测定管与空白管，按下表进行操作：混匀，置于电炉上加热消化（图 3-1 ），开始有水蒸气逸出，继而溶液呈现棕色并冒出白烟 (SO 3 ) ，此时火力应减小，并在管口上盖一小漏斗，以免硫酸损失过多，再继续消化至溶液变为澄清的蓝绿色，即消化完毕 ( 此过程约需 25 分钟左右 ) ，冷却后加水 3 . 8ml ，使总量成为 5ml( 内有 1 . 2ml 硫酸 ) ，混匀，准备蒸馏。

乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测乳与乳制品中常见的蛋白质种类包括酪蛋白、乳清蛋白和乳酸菌蛋白等。

其中，酪蛋白是乳与乳制品中最主要的蛋白质组分，占据了乳中总蛋白质的75%以上。

乳清蛋白是乳与乳制品中的另一主要蛋白质成分，它具有良好的水溶性和生物利用度。

常规理化指标检验蛋白质含量的方法主要有几种，包括Kjeldahl法、琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收光谱法等。

Kjeldahl法是一种用于测定有机氮含量的经典方法，也是乳与乳制品中蛋白质含量检测的常用方法之一、该方法的原理是通过将样品中的蛋白质分解为氨基酸，然后将氨基酸转化为氨，并以氨的形式测定样品中的氮含量。

通过乘以适当的因子，可以计算出样品中蛋白质的含量。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的蛋白质分析方法，可以用于检测乳与乳制品中蛋白质的组成和含量。

该方法利用蛋白质在电场中的迁移速率与其分子量之间的关系，通过测定蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以推断出蛋白质的分子量和含量。

紫外吸收光谱法是一种基于蛋白质在特定波长下具有吸光性的原理，通过测定吸收光谱的变化来确定样品中蛋白质的含量。

这种方法简单、快速，并且无需破坏性地处理样品，因此在乳与乳制品中蛋白质含量的检测中得到了广泛应用。

除了上述常见的方法外，还有其他一些新型的蛋白质检测方法正在不断发展中，例如质谱法、免疫测定法等。

这些方法具有高灵敏度和高选择性，能够准确地测定乳与乳制品中蛋白质的含量。

在实际的生产和质量控制中，对乳与乳制品中蛋白质含量的检测是至关重要的。

通过对产品中蛋白质含量的监测，可以及时发现和解决质量问题，确保产品的标准化和稳定性。

总之，常规理化指标检验乳与乳制品中蛋白质含量的方法多种多样，每种方法都具有其特定的优点和适用范围。

选择适当的方法，并根据实际情况进行合理的检测，对于乳与乳制品的生产和质量控制具有重要的意义。

实验三 血清总蛋白的测定 及其计量反应曲线的制作【目的要求】1.双缩脲法测定蛋白质含量的实验原理、关键技术和特点意义。

2.熟悉双缩脲法测定蛋白质的剂量反应曲线的制作方法与原则*3.熟悉721分光光度计的使用和常规维护【实验原理】两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H 2N-OC-NH-CO-NH 2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu 2+发生双缩脲反应 [A]，生成紫红色络合物。

蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu 2+发生双缩脲反应[B]，生成的紫红色络合物，且在540nm 处的吸光度与蛋白质的含量在10~120g/L据此，对已知系列浓度的蛋白标准液（S1~S5）做双缩脲反应，用其浓度作横坐标，吸光度为纵坐标，即可绘出一条过原点的蛋白质双缩脲反应剂量曲线。

通过此曲线，便可查出测定管的蛋白质浓度，进而求算出标本的总蛋白浓度。

亦可通过测定管吸光度、任一标准管的吸光度和该标准管的蛋白质浓度，算出标本中的总蛋白浓度。

【实验准备】一、器材1.试管及试管架NH 2O=CNH O=C NH 2 NH 2C=O HN C=O H 2NCu 2+ 紫红色络合物［A ］C OHC R C OHC R2.0.2ml微量吸管或200μl微量加液器3.1ml、2ml、5ml刻度吸管4.721型分光光度计5.坐标纸及绘图工具二、试剂1.0.9% NaCl溶液用医用生理盐水代替或按文献自配。

2.6mol/L NaOH溶液称取AR级NaOH 240.0g，溶于约800ml新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，冷却后稀释至1OOO.0ml，贮存于有盖塑料瓶中。

若用非新开瓶的NaOH，须先配成饱和溶液，静置2周左右，使碳酸盐沉淀，其上清饱和NaOH溶液经滴定后，算出准确的浓度再使用。

3.双缩脲试剂称取AR级的结晶硫酸铜（CuSO4·5H2O ）3.0g，溶于新鲜制备的蒸馏水（或刚煮沸冷却的去离子水）500ml中，加入AR级酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）9.0g，用以结合Cu2+，防止CuO在碱性条件下沉淀，再加入KI 5.0g，防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2O的离析。

一、实验目的1. 掌握乳蛋白素的提取方法。

2. 了解乳蛋白素的纯化过程。

3. 分析乳蛋白素的性质。

二、实验原理乳蛋白素是一种从乳清蛋白中提取的生物活性肽，具有多种生物学功能，如抗氧化、抗炎、抗高血压等。

本实验采用酸沉法提取乳蛋白素，通过盐析、凝胶过滤、离子交换等步骤进行纯化。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：乳清蛋白、硫酸铵、盐酸、氢氧化钠、离子交换树脂、凝胶过滤柱、pH计、离心机、冰箱等。

2. 实验仪器：电子天平、烧杯、移液管、滴定管、酸度计、水浴锅、紫外-可见分光光度计等。

四、实验步骤1. 乳蛋白素的提取（1）称取一定量的乳清蛋白，加入适量的去离子水，搅拌溶解。

（2）用盐酸调节pH至4.5，在室温下静置1小时。

（3）用离心机离心，取上清液。

（4）用硫酸铵饱和溶液调节上清液至饱和，静置过夜。

（5）用离心机离心，收集沉淀。

2. 乳蛋白素的纯化（1）将沉淀溶解于去离子水中，用盐酸调节pH至7.0。

（2）将溶液通过离子交换树脂柱，用去离子水洗涤。

（3）将洗脱液通过凝胶过滤柱，收集洗脱峰。

（4）将收集到的洗脱液用盐酸调节pH至7.0，离心去除杂质。

（5）将离心后的溶液冷冻干燥，得到乳蛋白素。

五、实验结果与分析1. 乳蛋白素的提取通过酸沉法提取乳蛋白素，得到沉淀的乳蛋白素含量较高。

2. 乳蛋白素的纯化通过盐析、凝胶过滤、离子交换等步骤，将乳蛋白素纯化，纯度达到90%以上。

3. 乳蛋白素的性质（1）紫外-可见分光光度法测定乳蛋白素的含量，结果表明其含量较高。

（2）通过SDS-PAGE电泳分析，乳蛋白素呈现单一条带，表明其纯度较高。

（3）通过抗氧化实验，乳蛋白素具有良好的抗氧化活性。

六、实验结论1. 本实验成功提取了乳蛋白素，并通过纯化得到了高纯度的乳蛋白素。

2. 乳蛋白素具有良好的抗氧化活性，具有潜在的应用价值。

3. 本实验为乳蛋白素的提取与纯化提供了可行的方法，为乳蛋白素的研究与应用奠定了基础。

七、实验展望1. 进一步研究乳蛋白素的生物学功能，为乳蛋白素的应用提供理论依据。