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实验八、聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳

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实验八、聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳

实验八、聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳

点样：取血清100µl，40%蔗糖100µl，溴酚蓝100µl于 白磁盘中混匀，上样15µl。 电泳：浓缩胶时电压80V（约40min）,分离胶160V(约 3h)。 待溴酚蓝快到管口时停止电泳，倒出缓冲液。 取胶：带长针头的注射器吸水，沿管壁慢慢插入同 时注水，慢慢转动，胶会慢慢滑出或用洗耳球吹出 于试管中。不要用力过猛，且试管应先放些水，以 防止胶断裂。 染色：将试管里水倒掉，加入染色液，染色40min。 脱色：倒出染色液，加入脱色液，更换3次脱色液每次 脱色10min，然后隔一天换一次脱色液，直到蛋白带 清晰为止。
电荷效应
当各种离子进入pH8.9的小孔径分离胶后，甘氨酸离 子的电泳迁移率很快赶上蛋白质，高电势梯度也随 之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各 种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场 中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白 质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。
分子筛效应
由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不 同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同， 故因迁移率不同而被分离。此处分子筛效应是指样 品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小 分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分 子大小顺序排列成相应的区带。
结果
观察管状胶条染色条带。
注意事项
1. 丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有神经毒性 ， 尽 丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有神经毒性， 量避免吸入和接触。 量避免吸入和接触。 2.考马斯亮蓝染色、脱色，染液回收。 考马斯亮蓝染色、脱色，染液回收。 3.电泳注意正负极。 电泳注意正负极。
聚合反应是由溶于水的AP产生自由基S2O8-→SO4-自 由基SO4-，催化TEMED使之成为带不成对电子的活化 分子，活化的TEMED可随机与Acr分子或Bis分子结合 并转移自由基使之活化。被活化的Acr可以同样的方 式结合另一分子Acr并转移自由基使其活化，如果反 应物中只有Acr分子，按反应机理可以使所有Acr分 子结合成长链，使其末端的Acr分子始终带有被转移 的自由基活性，但仅Acr分子的多聚体只能形成长链， 尽管呈黏稠状，但不能形成带孔的凝胶。

烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶

烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶

实验八 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１ 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

２ 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。

３ 掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。

４ 掌握过氧化物酶的活性的测定。

二 实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr ）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺 Bis ）在加速剂（N,N,N ’,N ’－四甲基乙二胺 TEMED ）和催化剂（过硫酸胺 (NH 4)4S 2O 8 简称AP ）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。

（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１ 聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr 和Bis 在催化剂（AP ）或核黄素（C 17H 20O 6N 4）和加速剂（TEMDA ）的作用下聚合而成的三维网状结构。

催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：① AP-TEMED 属化学聚合作用② 核黄素－TEMED 属光聚合作用２ 凝胶孔径的可调性及其相关性质① 凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr 与Bis 之比： 00100a b T m+=⨯ a:b<10 脆硬乳白交联度： 00100b c a b=⨯+ a:b>100糊状易断 ② 凝胶浓度与孔径的关系T （Acr 和Bis 总浓度）增加 孔径减小 移动颗粒穿过网孔阻力增加③ 凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加 阻力增加 移动速度减慢。

同时还与分子形状及分子电荷有关系。

在操作时，可以选用007.5凝胶。

因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。

３ 试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告引言聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的生物分子分析技术。

它通过应用电场，将带电的生物大分子（如DNA、RNA和蛋白质）在聚丙烯酰胺凝胶上进行分离和测量。

本实验旨在通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析DNA分子的大小和浓度。

材料与方法1. 准备聚丙烯酰胺凝胶：将聚丙烯酰胺粉末加入缓冲液中，并加热至溶解，制备成一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶。

2. 制备样品：将待测DNA样品与DNA标记物混合，加入一定体积的加载缓冲液，并加热至退变。

3. 电泳操作：将准备好的样品注入凝胶槽，连接电源，施加一定电压使DNA分子在凝胶中移动。

4. 染色与观察：将电泳结束后的凝胶进行染色，使用紫外线透射仪观察和记录分离出的DNA带。

结果与讨论通过实验我们得到了一张聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果图。

图中展示了不同大小的DNA分子在凝胶中的分离情况。

根据DNA标记物的迁移距离和已知标准品的迁移距离，我们可以测量待测DNA样品的大小和浓度。

在实验中，我们发现较大的DNA分子在凝胶中迁移较慢，而较小的DNA分子则迁移较快。

这是因为聚丙烯酰胺凝胶具有一定的孔隙结构，较大的DNA分子难以穿过这些孔隙，因此迁移速度较慢。

而较小的DNA分子则能够更容易地通过孔隙，因此迁移速度较快。

我们还观察到，在电泳过程中，DNA分子会受到电场的作用而带有电荷，向阳极（电场的正极）移动。

根据DNA分子的电荷量、大小和凝胶孔隙的大小，我们可以通过调整电场强度和凝胶浓度来控制DNA分子的迁移速度和分离效果。

结论通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，我们成功地分离和测量了DNA分子的大小和浓度。

这项技术在生物学和分子生物学研究中具有重要的应用价值，可以用于DNA测序、基因突变检测和蛋白质研究等领域。

然而，在实际应用中，我们需要注意凝胶浓度、电场强度和染色方法等因素对实验结果的影响，以确保实验的准确性和可重复性。

实验八 表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验八 表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

不连续SDS-PAGE：
①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。
产生三种物理效应：
①电荷效应： ②分子筛效应: ③浓缩效应:
浓缩胶的作用机理
• 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较 大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的 迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓 缩胶选 TRIS/HCl 缓冲液，电极液选 TRIS/ 甘氨酸。电 泳开始后， HCl 解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的 甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移 动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中 。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在 后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比， 因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅 速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面 附近，浓缩成一中间层。
思考题：
•1、影响电泳的主要因素有哪些？ •2、简答不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个 不连续，及三种物理效应。
6．样品处理：向各管中加入80 μl H2O，悬浮细胞后，加入20 μl 5X上洋缓冲 液，混匀后，放金属浴5-10 min,取出后12000rpm离心10 min.
7．上样 取10μl诱导诱导后的和未诱导的样品按顺序依次加入样品池中，并 加入10μl标准分子量蛋白标准品作对照。蛋白分子量标准可以加在靠中间的加 样孔中，也可加在离边的第2道处（最靠边的一道样品往往会明显跑斜）。 8. 电泳 在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下， 电泳时，积层胶电压60V电泳约20min，分离胶电压120V电泳约60min ，电泳 至溴酚兰刚出电泳槽下端的时候停止 9. 关掉电源，停止电泳。将玻璃板从电泳槽中取出，小心地用刀片撬开两玻 璃板，暴露出胶面。将浓缩胶部分切掉不要，分离胶放到玻璃平皿中染色。 10. 染色和脱色：凝胶在考马斯亮蓝染色液中染色过夜（摇床上缓慢振荡）， 然后倾去染色液（染色液回收，可反复用数十次），用自来水洗几下，去掉凝 胶上和玻璃平皿中的染色残液，加脱色液脱色（摇床上缓慢振荡），每1小时 后换一次脱色液，振荡脱色（共需3次）。彻底脱色后的凝胶蛋白条带清晰， 背景透明干净。这时可以将凝胶拍照或用扫描仪进行扫描，作为永久记录。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量(垂直板型电泳)

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量(垂直板型电泳)

/bio101/molecular/et/200609/6871.html1．学习SDS—PAGE测定蛋白质分子量的基本原理。

2．掌握垂直板型电泳的基本操作技术。

二、原理：由实验十五中已知，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。

1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。

在一定条件下，蛋白质的分子量与电泳迁移率间的关系，可用下式表示：因此，测定某个蛋白质的分子量，只需比较它和一系列已知分子量的蛋白质在SDS-凝胶电泳时的迁移率就可以了。

后来，Weber等人基本按Shapiro的方法对约40种蛋白质进行了研究，进一步证实了这个方法地可行性(见图16-1)。

用这种方法测定蛋白质的分子量，简便、快速，只需要廉价的设备和微克量的蛋白质样品；所得结果，在分子量为15,000—200，000的范围内，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在±10%以内。

因此，近几年来，SDS-凝胶电泳测定分子量的方法，已得到非常广泛的应用和迅速的发展。

为了阐明SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理，许多人进行了深入的研究。

实验证明，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。

在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4克SDS/1克蛋白质。

由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。

蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪匣烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A，而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。

生化大实验实验聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳

生化大实验实验聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳

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5
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不 溶；
(3)对pH和温度变化较稳定；
(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致， 则样品分离重复性好；
(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g
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15
SDS的作用
SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质 的氢键、疏水键打开，并结合蛋白质疏水部 分，形成SDS-蛋白质复合物。在一定条件下， SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质。由于SDS带有负电荷，使各 种SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电 荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量，因而掩盖了不同蛋白质分子原有的电 荷和形状的影响，电泳速度只与蛋白质的分 子量有关。
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3
电泳概述：
电泳：带电荷的质点，在一定条件的电场作用下，可向一极 移动，如带正电荷的质点移向负极，这种现象称为电泳。
影响电泳的主要因素： 1） 电泳介质的pH 2） 缓冲液的离子强度 3） 电场强度 4） 电渗作用 5） 对支持物的选择 6） 温度对电泳的影响 电泳分类： 按原理分：区带电泳、移界电泳、等速电泳、聚焦电泳
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11
不连续凝胶分离蛋白质原理：
（1）样品浓缩效应
(a)凝胶孔径不连续性：
(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；
在pH6.7的凝胶缓冲体系中
前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)
尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根
m代cl表cl甘>m氨p酸p根>m)有G效G迁(C移l代率表=氯m根，，mP代为表迁蛋移白率质，，为G

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白

聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白[实验目的](1)学习聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳原理。

(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。

(3)比较醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白的操作效果。

[实验原理]带电质点在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N'，N'—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。

[实验试剂]1、待测样品：新鲜血清2、制备分离胶、浓缩胶有关试剂：(1)凝胶缓冲液：称取1 mol/L HCl 48ml,Tris(三羟基氨基甲烷)36.6g,TEMED 0.23mL,加重蒸馏水至80mL 使其溶解，调pH8.9，然后加重蒸馏水定容至100mL ，至棕色瓶，冰箱储藏。

(2)分离胶贮液，一般有两种配法：ⅰ28％Acr-0.735％Bis贮液：丙烯酰胺28.0克，甲叉双丙烯酰胺0.735克,加重蒸馏水使其溶解然后定容至100mL.ⅱ30％Acr-0.8％Bis贮液:Acr30.0克,Bis0.8克,加重蒸馏水使其溶解定容至100mL.以上两种溶液需用棕色试剂瓶盛放,4℃储存,一般可放置一个月左右.(3)分析纯过硫酸铵(AP)(AR)0.14g加重蒸水100mL,棕色瓶,4℃储存仅能用一周,最好当天配置.上述三种试剂用于制备分离胶.(4)浓缩胶缓冲液:称取1mol/LHCL48mL,Tris5.98g,TEMED 0.46mL,加重蒸水至80mL,调pH6.7,用重蒸水定容至100mL,棕色瓶4℃储存.(5)浓缩胶贮液:称取Acr10g，Bis2.5g，加重蒸水溶解定容100mL，过滤后至棕色瓶4℃贮存。

实验八、聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳

02
根据电泳槽的容积，配制适量的 电极缓冲液，用于维持电泳过程 中的稳定电场。
安装凝胶板和电极
将凝胶溶液倒入电泳槽中，用吸水纸吸干凝胶板的多余水分。 将凝胶板放入电泳槽中，确保凝胶板与电极接触良好。
加样和电泳
用移液管将样品加入样品槽中，注意 不要产生气泡。
连接电源，开始电泳，根据实验需求 调整电流和电压。
缓冲液
选择合适的缓冲液对于 保持电泳过程中的pH 稳定至关重要，从而确
保分离效果。
温度
温度对电泳的影响较小 ，但过高的温度可能导 致凝胶变形，影响分离
效果。
03
实验步骤
准备实验材料和器具
1 2
聚丙烯酰胺凝胶粉
用于制备凝胶溶液，根据实验需求选择合适的规 格和浓度。
电泳槽
用于电泳的容器，需选择合适的尺寸和规格。
染色与脱色
电泳结束后，将凝胶取出，进 行染色和脱色处理，使蛋白质
条带显现。
了解聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的应用
蛋白质分离
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳常用 于蛋白质的分离和纯化，可分离 出不同分子量和电荷的蛋白质。
疾病诊断
通过聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技 术对生物样品中的蛋白质进行分析， 有助于疾病的早期诊断和监测。
电泳分离效果的评价
分辨率评价
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的分辨率取决于凝胶的孔径和浓度，以及电泳条件。评价电泳分离效果时 ，应关注分辨率的高低。
重复性评价
为了确保实验结果的可靠性，需要评价电泳的重复性。可以通过多次重复实验，观察电泳谱带的重现 性来评价。
实验数据的处理和结果分析
数据整理
将电泳谱带的位置、宽度、亮度等信息进行整理，以便进一步分析。
结果分析

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告实验目的：本实验旨在通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，研究不同样品中蛋白质的分子量和相对含量，并通过电泳图谱的分析，探究蛋白质的结构和功能。

实验原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分析和分离方法。

在该方法中，SDS（十二烷基硫酸钠）与蛋白质结合，使其带有负电荷，并且使蛋白质的形状变为线性。

通过加热样品，使蛋白质变性，并且加入还原剂β-巯基乙醇，使蛋白质的二硫键断裂。

在电泳过程中，样品在电场作用下，按照分子量大小在凝胶中移动。

通过比较样品和分子量标尺的迁移距离，可以确定样品中蛋白质的分子量。

实验步骤：1. 准备样品：将待测样品进行加热变性处理，并加入β-巯基乙醇进行还原处理。

2. 制备凝胶：根据实验需要选择合适的凝胶浓度，将凝胶溶液制备并倒入凝胶板中，插入电泳槽中。

3. 加载样品：将待测样品加入样品孔中，同时加入相应的分子量标尺。

4. 电泳：根据实验要求设置电泳条件，如电压、电流和电泳时间等。

5. 显色：电泳结束后，将凝胶取出，进行染色或银染处理。

6. 分析：通过观察和测量凝胶上的蛋白质迁移距离，结合分子量标尺，计算样品中蛋白质的相对分子量。

实验结果：根据实验操作，得到了一张完整的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

通过观察电泳图谱，可以看到不同样品中的蛋白质在凝胶中有不同的迁移距离。

通过与分子量标尺的对照，可以估算出样品中蛋白质的相对分子量。

同时，还可以观察到样品中蛋白质的相对含量。

实验讨论：根据电泳图谱的结果，可以对样品中的蛋白质进行分析和比较。

通过比较不同样品中蛋白质的迁移距离和相对分子量，可以得出样品中蛋白质的分子量分布情况。

同时，还可以观察到不同样品中蛋白质的相对含量。

通过对比分析，可以进一步研究蛋白质的结构和功能。

实验结论：通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，我们可以对不同样品中蛋白质的分子量和相对含量进行研究。

垂直板SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法

垂直板SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量原理若将两个电极插在电解质溶液中，通上直流电，正离子则向负极移动，而负离子向正极移动，这种现象就是我们熟悉的电泳现象，也称“电泳”（electrophoresis ，EP ）。

概括而言，电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。

例如蛋白质具有两性电离性质，当溶液pH 值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，反之则带正电荷，向负极移动。

当蛋白质溶液pH 值与蛋白质的等电点相等，静电荷为零时则不移动。

早在1808 年俄国物理学家Pehce 就发现了电泳现象。

1907年有人曾用琼脂糖电泳研究白喉毒素。

作为一种方法使用，是在1937年瑞典科学家Tiselius 建立了“移界电泳法（moving boundary EP ）”，成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1-、α2-、β-、和γ-球蛋白5个主要成分，这对当时蛋白质的研究起了很大作用。

由于他的突出贡献，他于1948年荣获诺贝尔奖。

上世纪50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。

自此以后，电泳技术引起人们的重视并迅速发展起来。

60年代，Davis 等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。

这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。

目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中必不可少的手段。

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE （Polyacrylamide gel electrophoresis ），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质所进行的电泳。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（CH 2=CHCONH 2 Acrylamide ）和甲叉双丙烯酰胺（CH 2(NHCOHC=CH 2)2 N,N ’-methylene bisacrylamide ）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。

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五、 操作方法 1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 (2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中， 注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 (3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃 板应面对上贮槽。 (4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双 手以对角线的方式旋紧螺丝帽。 (5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝 隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙， 凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。
2 配胶
试剂名称 表 SDS–不连续体系凝胶的制备 配制20 mL不同浓度的分离胶 配制10 mL浓缩 所需试剂用量/mL 所需试剂用量/mL 7.5% 10% 15% 3% 5.00 6.66 10.0 1.00 2.50 — 0.10 0.20 12.10 2.50 — 0.10 0.20 10.44 2.50 — 0.10 0.20 7.10 — 1.25 0.05 0.10 7.55
凝胶贮液 分离胶缓冲液 (pH8.9 Tris-HCl) 浓缩胶缓冲液 (pH6.7 Tris-HCl) 10%TEMED 10％SDS 重蒸水
10%过硫酸铵
混匀后，置真空干燥器中，抽气10 min 0.10 0.05
3. 制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至 长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳 齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻 璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4 mm)，用于隔绝 空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合， 则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。 将上、下贮槽的蒸馏水倒去 ，将混合均匀后的 浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的 窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处， 轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水， 但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，10 min左 右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，加入电极 缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出 样品槽模板，即可加样。
（c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应 (3)电荷效应
图4 电泳过程示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的 区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
图5 不连续系统浓缩效应示意图
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ： 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁 移率取决于它所带净电荷以及分子的大小 和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统 中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate, 简 称 SDS) ， 则 蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的 分子量，而与所带电荷和形状无关。因此 可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
7. 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质 样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相 对迁移率mR: 蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 相对迁移率mR= 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)
六、注意事项
（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避 免缓冲液渗漏。 （2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳 时影响电流的通过。 （3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防 止样品因对流而被稀释。 （4）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能 有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。
七、思考题
(1)为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的 蔗糖溶液？蔗糖及溴酚兰的作用分别是什么？
三、试剂与器材 试剂：10%SDS、 凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis)、 分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris－HCl 缓 冲液）、 浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris－HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 1%琼 脂糖溶液、0.05％考马斯亮兰R250 、7%醋酸 器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪 、脱色摇 床
（1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；
在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclαcl>mpαp>mGαG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根) 有效迁移率=mα，m为迁移率，α为解离度) 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率 超过蛋白质；
凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围 蛋 <104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 >5×105 核酸(RNA) <104 104–105 105-2×106 15–20 5-10 2-2.6 白 质 20-30 15-20 10-15 5-10 2-5 适用的凝胶浓度/(%)
实验八 SDS－聚丙烯酰胺凝胶 SDS－ 垂直板电泳分离蛋白质
一、目的要求 1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电 泳分离蛋白质技术
二、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide， 简 称 Acr) 和 交 联 剂 N,N- 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 (N ， N— methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N， N′，N′—四甲基乙二胺(N，N，N′，N′—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵 (ammonium persulfate (NH4)2S2O8 ，简称AP)或核黄 素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚 合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物 的 电 泳 称 为 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
4. 样品的处理及加样 将样品按0.5–1 mg/mL加样品溶解液，溶解后， 将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子(不 要塞紧，以免加热时迸出)，在100℃沸水浴中加热 3min，取出冷却后加样。 用微量进样器取25 l上述混合液，通过缓冲液， 小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。
5 .电泳 将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接 通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待 样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝 染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。 6 .染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢 药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加 样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为 前沿标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色， 直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。
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不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液 为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的 小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲 液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2 种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、 pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩 的主要因素。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两 大类。 目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面) (1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3
图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中 不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致， 则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度， 通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和 电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等 有更高的分辨率。