双光子荧光

荧光材料的双光子效应
荧光材料的双光子效应是指当一束激光通过荧光材料时，两个光子同时被吸收并导致荧光发射的现象。

这种效应在近年来得到了越来越多的关注，因为它具有许多优点，例如更高的空间分辨率和深度穿透能力。

荧光材料是一种特殊的材料，它可以吸收一定波长范围内的电磁辐射并发出可见光。

这种现象被称为荧光效应。

在双光子效应中，两个激光光子被吸收后，电子从基态跃迁到激发态，并在退激发过程中发出荧光信号。

与传统单光子激发相比，双光子激发具有更高的局部化和深度穿透能力。

这是因为双光子效应只会在聚焦点处发生，而且其穿透深度比单光子更大。

这使得双光子显微镜成为生物医学领域中重要的成像技术之一。

除了生物医学领域外，双光子效应还可以应用于光电转换、光学存储和激光打印等领域。

此外，由于双光子效应的独特性质，它还可以用于制备具有高分子量的荧光材料。

总之，荧光材料的双光子效应是一种非常有前途的技术，在各个领域
都有广泛的应用前景。

随着技术的不断发展和完善，相信这种技术将会在更多领域得到应用。

双光子荧光显微成像由于兼具诸如近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等特点而显著地优于单光子荧光显微成像,为生命科学研究提供了更为锐利的工具.用于研究离子的含量及其对生理的影响、离子参与的生理活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其相互作用等方面的双光子荧光探针,是实现成像的关键.双光子荧光探针的研究旨在促进双光子荧光显微镜应用的发展,促进生命科学、医学科学的快速发展,同时也带动双光子荧光探针所隶属的化学这一学科的发展。

新型光学成像技术——双光子荧光显微镜光学成像技术一直以来都是生物学研究的重要手段。

传统的荧光显微镜通过荧光标记物的发光来研究生物分子和细胞的功能，但由于深度限制和荧光标记对细胞和生物体的影响，限制了研究深度和准确程度。

然而双光子荧光显微镜的出现改变了这个现状，具备高分辨率、深度成像和非侵入性标记等特点。

一、双光子荧光显微镜的原理双光子荧光显微镜的成像原理是利用非线性荧光效应——双光子激发荧光效应，当两个光子的能量合成能够与荧光分子的跃迁能量匹配时，荧光分子受到激发，发生荧光发射。

与传统的单光子激发荧光不同，双光子激发荧光只在聚焦点产生明显的荧光信号。

这是因为在双光子激发荧光中，荧光产生需要两个光子的同步作用。

这种非线性过程不利于在样品各个层次产生荧光信号。

因此，在使用双光子荧光显微镜进行样品成像时，只在聚焦点周围的小范围内进行信号的检测，从而能够获得更高的分辨率和更深的成像深度。

二、双光子荧光显微镜的特点1. 非侵入性成像传统的荧光显微镜需要生物体或细胞中荧光标记物的标记才能进行成像。

而双光子荧光显微镜不需要使用任何外部标记物，可以直接在生物体中进行成像。

这种非侵入式成像能力使得双光子荧光显微镜在活体成像和组织工程等应用方面有着广阔的应用前景。

2. 高分辨率成像由于双光子荧光显微镜的成像原理，只在聚焦点周围的小范围内进行信号的检测，能够获得更高的分辨率。

深度成像时，同样具备更高的分辨率，在成像深度达到300μm时，其分辨率保持在数百奈米量级。

3. 深度成像双光子荧光显微镜能够获得更深的成像深度。

传统的荧光显微镜在成像深度达到几十微米之后，即使在同样的条件下，荧光信号的强度会急剧减弱，因此限制了深度成像的应用范围。

而双光子荧光显微镜能够在成像深度达到1mm时，仍然能够获得较高的荧光信号强度和分辨率。

三、双光子荧光显微镜的应用1. 细胞成像双光子荧光显微镜能够对单个细胞进行成像，展示细胞内分子的构成和运动过程，以及细胞能量代谢和信号传递的机制等。

次氯酸双光子荧光探针的合成及其在生物成像中的应用中文摘要双光子吸收技术自问世以来一直受到了广泛的关注。

与单光子吸收材料相比，双光子吸收材料在分辨率、穿透深度具有显著的优势，可以用于显微成像、微纺织技术、三维数据存储、光限幅、上转换发光、光动力学治疗以及药物靶向释放等诸多领域。

特别是双光子显微技术，以近红外的激光为光源对生物样品进行成像，具有穿透性强，空间分辨率高，背景荧光干扰小，以及对生物样品的光损伤较小等优点，在生物医学领域具有广阔的应用前景。

然而，传统的双光子材料常常具有大共轭结构，水溶性差、细胞穿透能力差、生物毒性也较大，并不适用于生物成像。

因此，设计合成具有较高双光子吸收截面的有机小分子用于生物体内细胞、血管、组织成像，具有重要的研究价值。

本文设计合成了两种具有双光子吸收特性的荧光小分子，对其发光性能进行了系统的研究，探索它们在生物成像中的应用。

具体的研究内容包括：1、设计合成了一类以寡聚苯乙烯为骨架的双光子次氯酸荧光探针OPV-HOCl，并将其应用于活细胞及组织内的双光子成像。

在寡聚苯乙烯骨架上引入次氯酸识别基团——氧硫杂环戊烷，通过1H-NMR、13C-NMR、HRMS 对其结构进行了表征，并通过紫外光谱、荧光光谱等进一步研究了该探针对次氯酸的响应性能，测定了其双光子吸收截面。

加入次氯酸以后，探针分子末端的氧硫杂环戊烷基团被氧化，并生成醛基。

由于分子内强烈的电荷转移导致产物的双光子吸收截面提高了近15倍（从78.9GM提高到1131.5GM），因此OPV-HOCl可以作为一个双光子“turn-on”型次氯酸荧光探针。

此外，该探针还具有反应速度快、选择性好、pH适用范围宽等优点。

MTT实验表明该探针具有较小的细胞毒性。

由于该探针优异的次氯酸响应性能和较小的生物毒性，我们成功地将其用于小鼠胶质瘤细胞BV-2中次氯酸的检测，研究表明该探针可以透过细胞膜，并对细胞中外源性次氯酸和脂多糖诱导产生的内源性次氯酸具有高选择性的快速响应。

双光子荧光原理
《双光子荧光原理》
嘿，大家知道吗？今天我来给你们讲讲双光子荧光原理，这可真是个神奇的玩意儿啊！
就说有一次我去实验室，看到那些科学家们在捣鼓一些奇怪的仪器。

我凑过去一看，嘿，他们正在研究双光子荧光呢！我就好奇地问：“这到底是咋回事呀？”科学家笑着跟我说：“别急，听我慢慢道来。

”
然后他就开始给我解释啦，说这个双光子荧光啊，就像是一场特别的灯光秀。

你可以想象一下，在一个黑黑的地方，有一些小小的分子，它们就像一个个小演员。

当有特定的光照射过去的时候，这些小演员就开始活跃起来啦！它们会吸收两个光子，然后发出特别亮特别神奇的荧光。

就好像这些小演员突然被点亮了，开始闪闪发光。

我当时就觉得，哇塞，这也太有意思了吧！就好像是在黑暗中突然出现了很多美丽的小星星。

然后科学家还说，这个原理在很多领域都有重要的应用呢，比如医学啦、生物学啦等等。

我听了之后真的是大开眼界啊，原来这么一个看似深奥的原理，其实也可以这么有趣地去理解呀！这就像是生活中的很多事情，当你深入去了解的时候，总会发现一些意想不到的惊喜和乐趣。

哎呀，这双光子荧光原理，真的是让我又长了不少见识呢！我想我以后看到那些闪闪发光的东西，都会想起这个神奇的原理啦！哈哈！
怎么样，我讲得够通俗易懂吧，希望你们也能像我一样对双光子荧光原理感兴趣哟！。

浙江大学』Ⅲ！｛ｊ学位论文第二章双光ｆ成像理论吒。

ｍ＝叫２吨。

篙ｅｘｐｆ（２Ｂ．４）山§２２的分析可以知道，这里口；为一比例系数，与单光子探测系统有关；口，现对单光子荧光强度和双光子荧光强度在径向作一比较，令公式（２．３．３）和（２．３．４）中的ｚ＝Ｏ，可以得到荧光光强的径向分布方程分别为：Ｌ。

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通过前期的实验，分析和总结得到的实验数据，经理论计算后，对取光子系统的性能做了一个测试，为双光子荧光成像实验，以及双光子、ＯＣＴ相结合实现结构功能成像等后期科研的展开打下基础。

本章首先介绍了双光子荧光成像系统的流程，然后对其主要部分：光学成像设计、光电转换、机械扫描做了一个简要的介绍，研制了新型的扫描探头。

§３．１双光子荧光成像实验系统流程双光予实验系统的总体构架如图３一ｌ所示图３，ｌ双光子荧光显微镜实验系统图对于一个完整的双光子荧光成像系统，一般应包括：光学成像、光电转换、机械扫描、计算机控制、数据采集、数据处理和显示等几个部分。

其系统流程如第二章职光予实验系统简介在探测器前面放置了荧光滤光片，来选择适当的荧光范围，过滤背景光，提高系统的信噪比。

图３—３中虚线框内表示的是ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜丰体，其详细结构如图３－４所示：图３．４ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜光路图箭头的方向表示光束入射的方向。

由图可以知道，Ｎ１ＫＯＮ５０１显微镜本身结构中就包含了落射式和透射式两种激发荧光的方式，可以根据需要来选择。

由第章ｌ｝，的介绍，可以知道，对本次实验来说，为最大程度的探测荧光，用落射式采集荧光的效率高，所以只利用显微镜上半部分的光路。

双光子显微镜/view/1428311.htm?fr=ala0_1双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。

双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。

双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。

这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100 飞秒，而其周期可以达到80 至100 兆赫。

在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。

所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。

激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题：一是标记染料的光漂白现象。

因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。

光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。

在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。