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猪轮状病毒油乳剂灭活疫苗的制备及免疫原性试验史月明;葛俊伟;乔薪瑗;刘力威;张冠群;李一经【摘要】@@ 猪轮状病毒(porcine rotavirus)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)、轮状病毒属(Rotavirus),是引起仔猪发生急性胃肠道传染病的重要病原,自1975年Woode和Bridge首次从猪体分离出猪轮状病毒以后,世界各国均有不同程度的猪轮状病毒感染报道.在我国猪轮状病毒感染亦十分普遍,李国平等在调查中发现仔猪1～10日龄阳性率42.4%～66%,10日龄到断奶阳性率83.2%～91.7%,断奶后阳性率为63.2%～72%[1].临床症状主要表现为恶心、呕吐、腹泻,成年猪一般呈隐性感染.鉴于猪轮状病毒感染普遍,危害大,对猪进行疫苗接种预防猪轮状病毒感染具有重要意义.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2010(046)008【总页数】3页(P27-29)【作者】史月明;葛俊伟;乔薪瑗;刘力威;张冠群;李一经【作者单位】东北农业大学动物医学学院,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学动物医学学院,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学动物医学学院,黑龙江,哈尔滨,150030;黑龙江省兽医研究所,黑龙江,齐齐哈尔,161006;东北农业大学动物医学学院,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学动物医学学院,黑龙江,哈尔滨,150030【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.4猪轮状病毒(porcine rotavirus)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)、轮状病毒属(Rotavirus),是引起仔猪发生急性胃肠道传染病的重要病原,自1975年Woode和Bridge首次从猪体分离出猪轮状病毒以后,世界各国均有不同程度的猪轮状病毒感染报道。
在我国猪轮状病毒感染亦十分普遍,李国平等在调查中发现仔猪1～10日龄阳性率42.4%～66%,10日龄到断奶阳性率83.2%～91.7%,断奶后阳性率为63.2%～72%[1]。
副猪嗜血杆菌的分离鉴定与自家苗的制备董永军;王丽荣;王宪文;王同燕;曲书哲;杭柏林;姚四新【摘要】@@ 随着世界养猪业的发展,副猪嗜血杆菌病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病.该病可以影响从2周龄～4月龄的猪,主要在断奶后和保育阶段发病.通常见于5～8周龄的小猪,发病率一般在10%～15%,严重时死亡率可达50%.主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱.主要剖检病变表现为纤维性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、关节炎和脑膜炎等.此外,副猪嗜血杆菌还可引起败血症,并且在急性感染后可能留下后遗症,即母猪流产、公猪慢性跛行.【期刊名称】《中国畜牧业》【年(卷),期】2010(000)006【总页数】3页(P37-39)【作者】董永军;王丽荣;王宪文;王同燕;曲书哲;杭柏林;姚四新【作者单位】河南科技学院;河南科技学院;河南科技学院;河南科技学院;河南科技学院;河南科技学院;河南科技学院【正文语种】中文随着世界养猪业的发展，副猪嗜血杆菌病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。
该病可以影响从2周龄～4月龄的猪，主要在断奶后和保育阶段发病。
通常见于5～8周龄的小猪，发病率一般在10%～15%，严重时死亡率可达50%。
主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱。
主要剖检病变表现为纤维性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、关节炎和脑膜炎等。
此外，副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。
因此，分离副猪嗜血杆菌地方菌株，研制地方流行血清型的自家苗，对该病的预防、控制有重大意义。
笔者实习所在的预防兽医实验室从新乡5个患严重疑似多发性浆膜炎和关节炎病的猪场中，分离鉴定出副猪嗜血杆菌。
选取分离鉴定出的10株副猪嗜血杆菌研究自家苗的制备方法。
通过与患有该病的猪场合作，将所研制的疫苗对新引进的健康猪进行常规的免疫。
通过疫苗对这些猪场新引进的健康猪保护力观察来验证该疫苗。
副猪嗜血杆菌菌影(Ghost)的制备及其免疫效力评价的开题
报告
1.研究背景和目的
副猪嗜血杆菌是一种严重危害畜牧业的病原微生物，可导致猪、牛、羊等动物出现严重感染并导致死亡。
目前，预防和控制副猪嗜血杆菌感染的主要方法是疫苗接种。
而制备高效、安全、持久的疫苗是保障动物健康的关键。
本研究的目的是制备副猪嗜血杆菌的菌影(Ghost)，并评价其作为一种新型疫苗
的免疫效力，为动物防疫提供新技术和新思路。
2.研究方法
2.1 副猪嗜血杆菌培养、取菌及杀菌条件的优化
首先，需要筛选出适宜的副猪嗜血杆菌菌株，并通过优化其培养和取菌条件，获得高品质的副猪嗜血杆菌菌影(Ghost)。
同时，需要优化杀菌条件，确保菌影内的细胞结构完整。
2.2 菌影的制备和检测
通过使用不同的孔径过滤器和不同的锁核溶解液对副猪嗜血杆菌进行处理，制备其菌影。
然后，对菌影进行检测，包括菌影的结构、稳定性、毒性等方面的评价。
2.3 菌影的免疫效力评价
如何评价副猪嗜血杆菌菌影作为疫苗的效力是本研究的重点。
该部分可以从多个角度对其免疫效力进行评价，包括动物实验、免疫反应监测和降低感染率等指标的测
试等。
3.预期结果
制备出高效、安全、稳定的副猪嗜血杆菌菌影(Ghost)，并通过免疫效力的评估，确定其作为一种新型疫苗的潜在应用价值。
为动物防疫提供新思路和技术，具有重要
的理论和应用价值。
副猪嗜血杆菌分离鉴定及其灭活苗的研制的开题报告
题目：
副猪嗜血杆菌分离鉴定及其灭活苗的研制
问题描述：
副猪嗜血杆菌是一种引起猪弧菌病的病原菌，严重威胁了猪的健康和猪肉的质量安全。
本研究旨在通过分离鉴定副猪嗜血杆菌，研发一种环保、高效的灭活苗，为猪
病防治提供有力保障。
研究内容：
1.采样和副猪嗜血杆菌的分离鉴定。
收集不同地区和不同猪场的猪血样本，利用大肠杆菌染色和生化实验，筛选并鉴定出副猪嗜血杆菌。
2.副猪嗜血杆菌的灭活方法研究。
研究不同灭活方法对副猪嗜血杆菌的杀伤效果，包括热灭活、化学灭活和辐射灭活等。
3.副猪嗜血杆菌灭活苗的制备。
研究灭活苗的适宜配比、接种剂量和免疫程序，并进行动物实验，评价其保护效果和安全性。
4.副猪嗜血杆菌灭活苗的应用实践。
将研制出的灭活苗应用于猪场，观察其在猪群中的控制效果和经济效益。
研究意义：
本研究旨在解决副猪嗜血杆菌病防治问题，为猪肉质量安全和养猪业健康发展提供有力支持。
同时，本研究将探索一种新的灭活苗制备方法，为病原菌灭活苗的研究
提供参考。
生物制品技术实验指导生物工程系目录实验规则⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 2 实验一、猪瘟、口蹄疫抗体间接血凝实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 3 实验二、鸡新城疫灭活疫苗的制备—照蛋及接毒⋯⋯⋯⋯ 4实验三、鸡新城疫灭活疫苗的制备—鸡胚收毒及测效价⋯⋯ 5 实验四、鸡新城疫灭活疫苗的制备—油乳苗的制备⋯⋯⋯⋯ 6实验五、氢氧化铝和蜂胶的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 实验六、法氏囊炎病高免卵黄抗体的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8 实验七、法氏囊炎病高免卵黄抗体效价的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯9 实验八、兔瘟灭活苗的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10 实验九、大肠杆菌自家灭活疫苗的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11 实验十、动物实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12 实验十一、鸡白痢平板抗原的制备及使用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15 实验十二、免疫血清的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16 实验十二、细菌冷冻真空干燥实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18实验规则实验中所用材料，多具有传染性（如病原微生物、含病原微生物的血、尿、便、痰、脓汁及感染动物等），在实验过程中，必须严肃认真地进行无菌操作，以保证结果准确，防止实验室感染，防止病原微生物污染环境。
必须遵守以下各项。
1、实验前必须预习实验指导书。
若经提问发现没有预习者，须在教师指定的时间内预习完毕，方得参加实验。
、进实验室不得将书包、衣物等放在实验1台上，不必需的物品勿携入室内。
2、实验室内严禁饮食、吸烟及用嘴舔湿铅笔及瓶签，、如发生感染或污染等意外时，应立即报告指导老师，进行紧急处理。
5、保持实验室安静，不得谈笑喧哗，不许搞其他动作，以免影响他人实验。
实验进行时不准随意进出。
实验室中物品未经许可不准带出室外。
6、清洗仪器、用具、材料时，须将固形物倒入指定容器内，不得直接倒入水槽，以免造成水管堵塞。
7、实验过程中，须按操作规程仔细操作，注意观察试验结果，应及时记录。
不得抄写他人的实验实习记录，否则，须重做。
副猪嗜血杆菌的分离鉴定及菌体灭活苗的研制副猪嗜血杆菌的分离鉴定及菌体灭活苗的研制引言：副猪嗜血杆菌（Actinobacillus suis），属于革兰阴性菌，是猪猩红热的病原菌，可引起猪的败血症、关节炎等严重疾病，对养殖业造成了严重威胁。
因此，对副猪嗜血杆菌进行准确分离鉴定，并研制出有效的疫苗，对于疾病的控制和预防起着重要作用。
一、副猪嗜血杆菌的分离鉴定方法1. 采集样品：从病猪关节、心脏等部位采集组织样品，并迅速送至实验室进行处理。
2. 消毒处理：将采集到的样品进行外部消毒处理，避免其他细菌的污染。
3. 细菌分离：将样品切成小块，接种于选择性培养基（专门用于分离培养副猪嗜血杆菌的培养基），并在适宜条件下培养。
4. 菌体特征观察：观察分离培养物的菌落形态、颜色等特征，以初步判断其为副猪嗜血杆菌。
5. 生化试验：通过一系列碳源利用试验、酶活性测试等进行进一步鉴定，以确认其为副猪嗜血杆菌。
6. 分子生物学鉴定：采用PCR技术，利用特异性引物扩增副猪嗜血杆菌的特异基因片段，通过比对序列与已知菌株的基因序列进行比对，确认其为副猪嗜血杆菌。
二、副猪嗜血杆菌菌体灭活苗的研制1. 菌体培养：在含有适宜营养成分的培养基中培养副猪嗜血杆菌，并控制培养条件，使细菌倍增到一定浓度。
2. 菌体灭活：通过加热、紫外线照射、化学消毒等方法对菌体进行灭活，同时保持菌体表面抗原的完整性。
3. 佐剂的选择：选择合适的佐剂，如低聚糖、脂质体等，以增强疫苗的免疫效果。
4. 疫苗制备：将菌体灭活液与佐剂充分混合，并进行过滤、冷冻保存等步骤，得到最终的菌体灭活苗。
5. 动物实验证实：选择一定数量的健康猪作为实验对象，将灭活苗进行注射，观察其免疫效果、安全性等指标，并与对照组进行对比分析。
6. 疫苗生产：在动物实验证实通过后，将菌体灭活苗进行大规模生产，以满足养殖业的需求。
三、疫苗的应用与前景展望副猪嗜血杆菌菌体灭活苗的研制成功，为猪猩红热的防控提供了重要工具。
三价副猪嗜血杆菌油乳剂灭活疫苗的制备及检验
副猪嗜血杆菌是猪格拉泽氏病(Glasser’s disease)的病原菌，属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，是一种多形态、非溶血性、不运动、NAD 依赖型、革兰氏阴性细小杆菌。
对营养要求比较苛刻，培养时必须供给含有V 因子（NAD）或（NADP)的新鲜血液才能生长。
此菌有多种血清型，其中强毒力的有1、5、10、12、13、14型，常可致死动物；中等毒力的有2、4、8、15型，多表现为多发性浆膜炎，不致死；低毒力的有3、6、7、9、11型，常无临床表现和病变。
在中国，4型和5型是主要分离株，而澳大利亚和丹麦的主要血清型为5型和13型。
在研究2、4、5、12、13和14型间的交叉保护性时发现，除了血清12型制备的单菌和血清2、12型制备的二价苗外，其他型都能对同源菌株产生保护；用血清4型制备的菌苗，可以保护血清5型的攻击；用血清4、5型制备的二价菌苗，可以抵抗血清13、14型的攻击（仔猪病变的严重性和病死率明显降低）。
三价灭活疫苗主要用于预防猪副嗜血杆菌病。
该苗针对性强，安全可靠，能有效降低发病率和死亡率。
一、实验目的
1 了解副猪嗜血杆菌油乳剂灭活苗制作的流程。
2 掌握副猪嗜血杆菌油乳剂灭活苗制作的操作技术。
二、乳化的原理
乳化剂能降低分散物的表面张力，在微滴（粒）表面形成薄膜或双片层，以阻止微滴（粒）的相互凝结。
三、材料，试剂，培养基
（1）器材：不锈钢锅（或瓷锅）、电炉、乳化器、量筒、玻璃棒、离心机、吸管等。
（2）试剂：、甲醛（灭活剂）、白油（抗原油相）、Span-80（油相乳化剂）、Tween-80（抗原水相乳化剂）、硬脂酸铝（稳定剂）、4、5、13型分离菌株（抗原）。
（3）培养基的制备：
1、配制0.2%的V因子
准确称0.2g的NAD（辅酶I）加入100mlddH2O，用0.22um的细菌过滤器过滤除菌，4°C保存备用。
2、制备TSA培养基
称16gTSA加入348ml双蒸水， 121°C高压灭菌20min，当温度到50°C左右时（放入50°C 水浴锅）加入0.2%的V因子，使V因子浓度达100ug/ml，然后加入32ml的灭活新生牛血清100ml----4g TSA-----5ml V因子-------8ml血清
3、TSB培养基
称3gTSB于87 ml双蒸水中溶解。
121°C高压灭菌15min，冷却至50°C左右，加入已配制的0.2%的V因子5ml，再加入灭活的新生小牛血清8ml，使血清浓度达0.8%
100ml-------3g TSB----5ml V因子----8ml血清
四、实验内容
（1）菌株菌液制备及培养繁殖
将副猪嗜血杆菌三株菌种按分别划线接种于TSA固体培养基平板上，37°C恒温培养18-24h，挑取单个菌落接种于TSB液体培养基中，37°C振荡培养12-16 h后，再将此菌液按l%的比例加入新配制的TSB液体培养基，37℃振荡培养12-16h后，按平板菌落计数法计数。
培养24h后，收集菌液，用分光光度计法测定细菌总菌含量。
经检验合格者作为制苗抗原。
（2）制苗抗原的浓缩和细菌的灭活
将纯检合格的制苗抗原培养物以超滤器浓缩，作为制苗用浓缩抗原。
然后按TSB液体培养基总体积加入终浓度为0.2%的甲醛（先10倍稀释），充分摇匀后，37°C温箱中灭活14h或分别在4、8、12、16、20h和24h取灭活菌液于TSA固体培养基划线培养，置普通恒温箱中37℃培养48h，观察细菌灭活效果。
37°C灭活14h可达到较好的效果。
（3）制苗用水相的制备
根据培养24h后的分光光度计法或麦氏比浊管测定的总菌数结果，参照培养12-16h的平板菌落计数法计数结果。
取灭活的三种血清型按照一定的比例（等量）混合抗原液96份，然后过滤, 除去沉渣及杂物, 加入4份即终浓度为4%灭菌的Tween-80(96∶4) 充分混匀, 边加边搅拌，使其充分融化（可加热助溶，温度低于37℃）, 作为制苗用水相，水相要摇匀，让吐温-80充分溶解。
（4）制苗用油相的制备
取10号白油93份（先加一部分，后补足）置于不锈钢锅中缓慢加热后，加入硬脂酸铝1份，边加边搅拌，直到透明为止，再缓慢加入6份Span-80(司本-80)，充分混匀， 121℃高压蒸汽灭菌3Omin，冷却至室温备用。
或者按比例将工业白油94份置于不锈钢锅（或瓷锅）中加热后，缓慢加入6份 Span-80，混合后按总量加入2%硬脂酸铝，溶化后，继续升温至160℃，维持10min，待冷却后即可制苗。
切勿用少量的白油与硬脂酸铝混合后边煮边搅拌，那样很容易烧焦冒烟。
（5）疫苗的制备（乳化工艺）
按油相与水相2：1（v/v）混合乳化。
即1份水相配2份油相在高速搅拌器中搅拌。
先将处理好的油相2份置于高速搅拌器中，低速搅动油相，同时缓慢加入水相l份(油∶水= 2∶1)，乳化时胶体磨转速由慢变快，最后以8，000一10，OO0r/mln高速乳化2一5min，使水油充分乳化。
乳剂混匀，分装于灭菌疫苗瓶中。
在乳化过程中亦可根据乳剂黏稠度适当调整油、水相比。
制成乳白色的W/O型油乳佐剂疫苗。
（6）油乳剂检验：油乳剂检验项目包括乳剂类型检查、黏度测定、稳定性测定、粒度大小及分布检测等，生产实际中以黏度测定与稳定性测定为主。
在每批苗分装过程的前、中、后各抽样2瓶供物理性状检验及安全检验。
1 无菌检验：将制备好的灭活油乳苗分别接种于普通肉汤培养基和血琼脂培养基中 , 于37 ℃温箱中培养10 d, 观察有无细菌生长。
均应无菌生长方合格。
2 物理性状检验 : 观察疫苗颜色：眼观应为均匀一致的乳白色黏稠乳剂。
3 稳定性检测：1）离心加速法，将疫苗置于 10m l 离心管内, 3 000 r/min离心15min水油不分层，可保存1年以上不破乳。
2）加速老化法，疫苗于37℃储存10-30d不破乳，说明其稳定性良好。
4 黏度检验：最简易的方法是在室温条件下用吸管吸取1ml乳剂, 然后垂直放出, 记录放出0.
4ml所需时间。
垂直放出0.4ml所需要的时间作为黏度单位，以0.4ml 2-6s为合格，说明黏度适中, 适合于注射应用，不得多余10-15s。
5剂型检测：将疫苗数滴滴于冷水表面, 观察油滴扩散情况，即观察疫苗滴于水中是否呈油滴状且不分散。
滴于水中油滴呈规则的圆形, 未见扩散现象, 说明疫苗为油包水剂型。
6安全检验：对最小使用日龄靶动物一次单剂量接种的安全性灭活疫苗接种途径只有一种，就是肌肉注射。
每批三价灭活苗随机取样3瓶,等量混合后接种兔2只,每只肌肉注射2mL；接种14日龄哺乳仔猪，每组5头，每头猪接种2ml，另设5头猪作为阴性对照，于耳后肌肉注射5-10 mL, 观察仔猪的临床表现，并每日测定体温，持续2周。
五、小结
（1）副猪嗜血杆菌对营养要求比较苛刻，培养时必须供给含有V 因子（NAD）或（NADP)的新鲜血液才能生长。
且具有非常多的血清型，纯化非常困难。
故对菌的纯化及灭活和疫苗的安全性试验是生产灭活苗的关键环节。
由于副猪嗜血杆菌，在菌液制备的过程中容易生长杂菌，我们纯化了很多次菌，液体仍然很浑浊，使得实验进展延后。
（2）注意事项：
1 细菌灭活过程中，甲醛浓度越高，碱性溶液中的抗原性损失就越大。
故甲醛要注意适量
2 制备油相时，要使Span-80和硬脂酸铝充分溶解。
3 制备水相时，抗原与Tween-80充分混匀。
4 乳化时，油相必须冷却后方可与水相混和乳化，以防油温过高使抗原性降低。
5 注意先加入油相后再加入水相，充分搅拌。
6 疫苗在4℃、暗处保存，切勿冰冻。
7 一定要做好安全检验。
