口腔微生物实验讲义

口腔临床标本的微生物学检查，大多数与厌氧菌有关，在标本采集后，要求立即用厌氧方式运送到培养箱中孵育。脓液或唾液标本可直接用注射器针筒运送，大多数标本均应加入具厌氧条件的还原转送液运送到实验室。减少氧敏感细菌在运送过程中死亡，保证厌氧菌的检出。
（二）几种常见标本的采集方法
1.唾液：
最佳采集时间为晨间起床后，刷牙洗漱前或两餐之间。（10：00 am或4：00pm）。在采集标本前令受检者用温开水清漱口中的食物残渣，然后自然排出唾液于无菌容器中，至少采集0.5—1ml。然后塞好管口，立即送检。
复染：沙黄染液，1-2滴，1分钟，水洗，吸水纸吸干。
三、变链球菌的分离和鉴定
目的要求
1.初步掌握变链球菌分离、鉴定的主要程序和方法。
2.掌握变链球菌的菌落特点、菌细胞形态及革兰染色特征。
材料
1.菌种：变链球菌斜面培养物
2.培养基：（1）分离培养用培养基：MS琼脂平板或血琼脂平板
（2）生化反应用培养基：4.5%NaCl、甘露醇、乳糖、七叶苷
2.牙菌斑：
按菌斑的位置可分为龈上菌斑和龈下菌斑两大类。龈上菌斑指牙颈部龈缘以上牙面的牙菌斑，龈下菌斑指牙龈缘内侧被牙龈所覆盖牙面上的菌斑。
（1）龈上菌斑的采集：
适用于牙龈炎和早期牙周炎的细菌分离。受检者用温开水漱口后，用菌斑指示剂显示出龈上菌斑，然后在无菌纱球局部隔湿的情况下，用无菌匙形器采集，转至有还原转移液的无菌试管中送检。
目的要求：观察口腔微生物的基本形态和一些微生物的动力。
1.不染色检查方法：标本不染色，直接在显微镜下观察。
（1）压滴法
材料
①菌种：变形杆菌，葡萄球菌12小时肉汤培养物。
②其他：载玻片，盖玻片等。
方法
①用接种环取变形杆菌菌液2-3环，置于洁净载玻片中央。
②将盖玻片轻轻盖住菌液，防止产生气泡。
③高倍镜或油镜下观察。
正常龈沟深度小于3mm，在牙周炎时，由于牙龈肿胀或增生，龈沟可加深，超过3mm。此时结合的上皮向牙根方向增殖，其冠方部位与牙面分离，而形成牙周袋。
龈沟液是来自牙龈组织的渗出液，其成分来源于血清和牙龈局部结缔组织。正常时，龈沟液极少，但有炎症时，不但液量增加，而且成分也会发生变化。检查龈沟液可辅助诊断牙周病。
标本/变链球菌→（接种）MS琼脂平板→孵育（最适条件：37℃，5%CO2+95%N2，培养18-24小时/48小时）→菌落观察→革兰染色：细菌形态学观察
（接种）生化反应培养基→37℃，18-24小时→确定菌种
4.甘露醇、乳糖或菊糖培养基：
配方：蛋白胨1g
牛肉膏0.Байду номын сангаасg
NaCl 0.5g
琼脂2g
酚红0.0018g
蒸馏水100ml
甘露醇（乳糖或菊糖）1g
制备：将以上物质混合后，分装试管，115℃,20分钟，灭菌，取出摆斜面，凝固后，冷藏备用。
接种：挑取细菌培养物接种后，置37℃培养18—24小时，观察。
结果：置培养基中指示剂（酚红）呈酸性反应者为阳性（黄色）。
5.七叶苷培养基
配方：蛋白胨0.5g
磷酸二氢钾0.1g
2.用无菌滴管吸取唾液标本分别滴于MS平板和血平板各1-2滴，分离划线，接种后置37℃培养18-24小时，观察菌落形态。
3.每块平板任选5个较典型的不同菌落，标记，并记录其特征。
结果记录
菌落
1
2
3
4
5
形态描述
4.细菌形态特征观察：在载玻片上各滴5滴生理盐水，分别挑取上述5个菌落（部分）于生理盐水中制成涂片。革兰染色后，光镜下观察菌细胞形态和染色性，并记录结果。
采集方法多采用灭菌滤纸法。漱口后，去除局部的龈上菌斑，软垢及牙石，将灭菌纸尖或滤纸条插入龈沟，停留5—10秒后取出，厌氧条件下转运。
4.感染的牙髓及根尖周围组织：
牙髓及根尖采样全过程应尽量在厌氧条件下进行，采集操作应严格无菌，厌氧条件下尽快转运。一般为钻开髓腔后引入N2，CO2或H2保持厌氧条件，然后将预还原的转送培养液注入根管，置入灭菌纸尖，取出后立即放入转送培养液送检。
⑥同法制备葡萄球菌悬滴片，观察。
2.染色检查方法
活的细菌为无色半透明状，在普通光学显微镜下不易观察清晰。若用染色方法可使菌体表面及内部结构着色，与背景形成鲜明对比，可在显微镜下清晰地观察菌细胞形态。
（1）革兰染色法
材料
①牙垢
②无菌生理盐水，无菌牙签，载玻片
③染液：结晶紫染液，卢戈碘液，95%酒精，沙黄染液。
5.颌面间隙感染：
由细菌感染造成的炎症，局部可表现为炎症症状，出现脓肿，有的伴有全身症状。引起颌面间隙感染的细菌种类较多，可有兼性厌氧菌和厌氧菌。
①兼性厌氧菌：从病灶取分泌物或脓液进行分离培养。
②厌氧菌：局部取材后，用无菌密闭的装有还原转送液小管运送。
二、口腔微生物的直接涂片检查法
直接涂片的显微镜下检查技术在口腔微生物研究中应用广泛，主要用于检查口腔细菌、螺旋体、真菌和原虫，直接涂片检查可快速提示这些微生物的存在。在口腔微生物涂片检查中常用方法包括不染色法和染色法两类，不染色标本可以在显微镜下观察微生物的动力；染色法常用革兰染色法和刚果红负染色法等。直接涂片检查法具有简便、快速、可直接计数、便于观察活菌的形态和可动性的优点。
方法
1用接种环取无菌生理盐水1环，置于洁净载玻片中央。
2同学间或自己用无菌牙签，挑取恒磨牙牙垢，加到载玻片的盐水中，混匀，制成涂片。
3干燥，固定，革兰染色，油镜观察。
（2）刚果红负染色法
材料
①牙垢
②无菌生理盐水，无菌牙签，载玻片
③染液：2%刚果红水溶液，浓盐酸。
方法
1同革兰染色法取牙垢，但置于载玻片一端制备成悬液。
口腔微生物学实验指导
（2005年）
前言
口腔微生物学实验课是本课程学习过程中的重要环节。其目的在于加深和巩固对理论知识的理解和体会；掌握和熟悉口腔微生物学研究技术和方法，培养学生对口腔医学基础研究的兴趣，为今后工作打下良好基础。
一、标本的采集与运送
口腔是人体与外界相通的器官，存在多种微生物群。从口腔中可分离培养到各种需氧、微需氧或厌氧、兼性厌氧的细菌。口腔微生物的分离培养是确定各种细菌最常用的方法。
配方：蛋白胨1g
牛肉膏0.3g
氯化钠4.5g
琼脂2g
蒸馏水100ml
制备：将上述成分称量混合，溶解,校正pH至7.4，分装试管121℃灭菌15分钟，取出摆斜面，凝固后冷藏备用。
四、口腔链球菌的分离与鉴定
目的要求
1.掌握口腔链球菌分离、鉴定的主要程序。
2.熟悉常见口腔链球菌的菌落特点，菌细胞形态和革兰染色特性。
3.细菌的形态学观察：取37℃18-24小时培养后琼脂平板上的单个菌落，涂片，行革兰染色，镜检。
4.按下表所列内容观察并记录结果。
（1）变链球菌革兰染色
结果记录
染色特性
基本形态
排列方式
（2）变链球菌的主要培养特性
结果记录
不同培养基中生长情况
MS平板
血平板
4.5%NaCl
（3）变链球菌的重要生化反应
结果记录
④同法制备葡萄球菌压片，观察。
（2）悬滴法
材料
①菌种：变形杆菌，葡萄球菌12小时肉汤培养物。
②其他：凹玻片，盖玻片，凡士林等。
方法
①取凹玻片，凹窝周围涂少许凡士林。
②用接种环取适量变形杆菌菌液于盖玻片中央。
③凹玻片凹面向下，凹窝对准盖玻片菌液处盖于其上。
④反转凹玻片，菌液悬滴于盖玻片下，压紧。
⑤高倍镜观察。
（3）5个菌落的菊糖培养物斜面做触酶试验。记录结果。
五个不同菌落细菌的耐盐特性及重要的生化反应特性：
2于载玻片的另一端滴一滴2%刚果红水溶液。
3用接种环将待检标本与刚果红溶液混匀后制成薄膜，自然干燥。
4置于浓盐酸蒸气上熏至蓝色。
5油镜观察。
注：革兰染色程序
初染：结晶紫染液1-2滴，1分钟，水洗，轻甩干。
媒染：卢戈碘液1-2滴，1分钟，水洗，轻甩干。
脱色：95%酒精数滴，频摇脱色，约0.5分钟，水洗，轻甩干。
（一）口腔标本取材与运送原则
口腔微生物培养检查的临床标本主要有唾液、龈沟液、龈上菌斑、龈下菌斑，感染根管组织，牙槽脓肿的脓液，颌面间隙感染的脓液或分泌物等。
以上标本的采集应根据其培养目的来确定采集方法及注意事项。需氧菌采用棉拭子法，厌氧菌采用厌氧采集技术，尽量减少标本与空气的接触及培养物的放置时间，以提高厌氧菌的检出率。在采取标本中必须无菌操作。
甘露醇发酵
乳糖发酵
七叶苷水解
说明：变链球菌群（Mutans streptococcus）是一群表形近似而遗传型各异的链球菌，在含葡萄糖的培养基中菌体变长而得名，又称变形链球菌、变异链球菌。常居于牙菌斑和唾液中。根据菌体DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶含量不同分7个菌种，人类口腔中常见变链球菌(S.mutans)和远缘链球菌（S.sobrinus）两个种，其他种存在于啮齿类动物或猴口腔中。
（3）生化反应：分解多种糖类，如葡萄糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖、甘露醇等，水解七叶苷，触酶试验阴性。
2.致病性
变链球菌的胞壁表面物质在使细菌黏附、集聚和对牙表面的定植中起重要作用；其产生的酶在糖代谢中作用重要；而其产酸能力和耐酸性使之在菌斑酸化和釉质脱矿中起作用，因此，变链球菌是主要致龋菌。
3.变链球菌群细菌的分离和表型鉴定程序
（2）龈下菌斑的采集：
1取菌器采集：有带充气导管的采集器（见图1）及Moore 00取菌器。受检者经温开水漱口后，用取菌器采集，放入有还原转送液的无菌试管中送检。
2灭菌纸尖采集法：温开水漱口，刮除龈上菌斑，采集部位用纱球隔湿，用无菌镊子将灭菌滤纸尖直接插入龈沟或牙周袋内（见图2），放置数秒后取出放入还原转送液，加盖后尽快送检。该法较简便，但易被唾液污染。