荧光显微镜的原理和使用方法 ppt课件
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荧光显微镜分析课件
染色体染色实验
总结词
通过荧光染色技术，观察染色体的结构和数目。
详细描述
采用荧光染料对染色体进行染色，在荧光显微镜下观察染色体的形态、数目和分布，可用于研究染色 体变异、基因定位和遗传疾病等。
荧光原位杂交实验
总结词
通过荧光原位杂交技术，检测特定基因 在染色体上的位置。
VS
详细描述
利用荧光标记的探针与染色体上的特定基 因进行杂交，在荧光显微镜下观察杂交信 号的位置和强度，可用于基因定位、染色 体变异分析和遗传疾病诊断等。
荧光显微镜分析课件
目录 CONTENTS
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的基本原理 • 荧光显微镜的操作方法 • 荧光显微镜的实验技术 • 荧光显微镜的实验案例
01
荧光显微镜简介
定义与特点
定义
荧光显微镜是一种利用特定波长 的光激发细胞内或组织内的荧光 物质，从而观察细胞或组织的结 构和功能的显微镜。
重要意义。
05
荧光显微镜的实验案例
细胞核染色实验
总结词
通过荧光染色技术，观察细胞核的结构和分布。
详细描述
采用荧光染料对细胞核进行染色，在荧光显微镜下观察细胞核的形态、大小、分 布以及染色质结构，可用于研究细胞分裂、基因表达和疾病诊断等。
线粒体染色实验
总结词
通过荧光染色技术，观察线粒体的结 构和功能。
荧光共定位技术
荧光共定位技术是一种利用两种或多种 荧光染料标记细胞内不同组分，通过观 察它们的空间位置关系来研究细胞结构
和功能的技术。
通过高分辨率的荧光显微镜观察，可以 清晰地看到不同组分在细胞内的具体位
置和相互关系。
荧光共定位技术广泛应用于生物学、医 学和化学等领域，对于研究细胞内分子 相互作用和细胞生物学特性等方面具有
荧光显微镜的原理和使用方法ppt(共25张PPT)
荧光显微镜是荧光显微术的基本装置，利用特定波长的光激发荧光物质发出可见荧光供检视。其结构主要包括光源、滤色镜系统和二向色镜等关键部件。光源采用高压汞灯，能发出强紫外光和蓝光，具有光亮度大、光度稳定的特点。滤色镜系统包括激发滤色镜和阻断滤色镜，分别用于提供最佳波段的激发光和阻断或吸收光路中的激发光或某些波长较短的光线。二向色镜则位于光路中，起到透射长波光线和反射短波光线的作用。根据照明方式的不同，荧光显微镜分为落射式和透射ห้องสมุดไป่ตู้两种，常用的是落射式荧光显微镜，其特点是光源通过物镜落射于样品，激发的荧光再通过物镜进入目镜供观察。整体而言，荧光显微镜的结构设计使其能够高效、准确地捕捉和分析荧光信号，为科学研究提供了有力工具。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 细胞内大部分物质经短光波照射后，可发出较弱 旳自发性荧光。有些细胞成份与能发出荧光旳有 机化合物——荧光染料结合。激发后呈现一定颜 色旳荧光，借以对组织进行细胞化学旳观察和研 究。
• 2.1 荧光显微镜旳基本装置及其光路
•
荧光显微镜因制造厂家、型号旳不同，构造
各异，但主要构件，基本相同。
• 2.1.1光源:采用高压汞灯。汞灯能以最小旳表面 发出最大数量旳紫外光和蓝光，且光亮度大，光
度稳定。汞灯旳构件，中间为一球形石英玻璃管， 有两个钨电极，内充汞滴和少许氩氖混合气体。 汞灯装在牢固旳灯室中，有调中、聚焦和集光装 置。使用中禁止频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，
不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭 后，不能立即点亮，经5～10min，汞灯冷却后再 通电点亮。
•
HBO200Ｗ汞灯旳发射光谱为200～600nm，
• 视场光阑旳调整使用：视场光阑位于孔径光阑 之后，亦由外露手杆操纵。视场光阑用于限定样 品表面旳照明区域，其开度一般应与孔径光阑旳 开孔相当。
• 辅助激发滤色镜滑动阀旳使用:滑动阀位于镜臂 专用槽中，可拉出或推入。有三个挡位供不同使 用。全拉出位：供常规使用；中间位：用于Ｂ激 发法，辅助滤色镜进入光路；全推入位：用作光 阀，阻断全光线．
• 某些物质经波长较短旳光线照射后，分子被激活， 吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或 用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长旳 光能形式辐射出来，这种波长长于激发光旳可见 光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后 可直接发出旳荧光，称为自发荧光（如叶绿体中 旳叶绿素分子受激发所发出旳火红色旳荧光）； 本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出旳荧 光称为次生荧光。常用旳荧光染料涉及丫啶橙、 荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。
• 2.1 荧光显微镜旳基本装置及其光路
•
荧光显微镜因制造厂家、型号旳不同，构造
各异，但主要构件，基本相同。
• 2.1.1光源:采用高压汞灯。汞灯能以最小旳表面 发出最大数量旳紫外光和蓝光，且光亮度大，光
度稳定。汞灯旳构件，中间为一球形石英玻璃管， 有两个钨电极，内充汞滴和少许氩氖混合气体。 汞灯装在牢固旳灯室中，有调中、聚焦和集光装 置。使用中禁止频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，
不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭 后，不能立即点亮，经5～10min，汞灯冷却后再 通电点亮。
•
HBO200Ｗ汞灯旳发射光谱为200～600nm，
• 视场光阑旳调整使用：视场光阑位于孔径光阑 之后，亦由外露手杆操纵。视场光阑用于限定样 品表面旳照明区域，其开度一般应与孔径光阑旳 开孔相当。
• 辅助激发滤色镜滑动阀旳使用:滑动阀位于镜臂 专用槽中，可拉出或推入。有三个挡位供不同使 用。全拉出位：供常规使用；中间位：用于Ｂ激 发法，辅助滤色镜进入光路；全推入位：用作光 阀，阻断全光线．
• 某些物质经波长较短旳光线照射后，分子被激活， 吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或 用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长旳 光能形式辐射出来，这种波长长于激发光旳可见 光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后 可直接发出旳荧光，称为自发荧光（如叶绿体中 旳叶绿素分子受激发所发出旳火红色旳荧光）； 本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出旳荧 光称为次生荧光。常用旳荧光染料涉及丫啶橙、 荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。
荧光显微镜的原理和使用方法
详细描述
激光共聚焦扫描显微镜采用激光作为激发光源，具有高分辨率和高灵敏度，能够观察细胞内细微结构 和动态过程。它通过逐点扫描样品，获得高清晰度的图像，特别适合观察细胞骨架、线粒体和内质网 等结构。
多光子荧光显微镜
总结词
一种非线性光学成像技术，适用于观察活体动物和组织。
详细描述
多光子荧光显微镜采用多光子激发技术，能够在不损伤样品的情况下获得高分辨率和高对比度的图像。它通过使 用脉冲激光和光子计数检测器，能够观察活体动物和组织中的荧光标记物，特别适合用于神经科学和生物学等领 域的研究。
Hale Waihona Puke 谢谢观看光源提供特定波长的激 发光，通常为紫外 光或蓝光。
样品
放置待观察的荧光 样品。
目镜或摄像系统
观察或记录荧光图 像。
荧光物质和激发光
荧光物质
某些物质在吸收激发光后，会发出特定波长的荧光。
激发光
用于激发荧光物质的特定波长光线。
荧光产生的原理
01
当荧光物质吸收激发光时，电子 从基态跃迁至激发态。
02
激发态的电子不稳定，会释放能 量并返回到基态，同时发出荧光 。
03
荧光显微镜的使用方法
荧光显微镜的安装和调试
安装
荧光显微镜应放置在平稳的工作台上 ，确保电源和光源的连接稳定。
调试
调整显微镜的焦距和光源亮度，确保 图像清晰可见。
荧光样品的制备
荧光染料选择
根据观察目标选择合适的荧光染料， 如FITC、TRITC等。
样品处理
将荧光染料与样品混合，进行染色处 理，然后洗涤和干燥。
，进行相应的调整。
使用注意事项
01 使用前先了解操作规程，遵循操作步骤， 避免因误操作导致仪器损坏。
激光共聚焦扫描显微镜采用激光作为激发光源，具有高分辨率和高灵敏度，能够观察细胞内细微结构 和动态过程。它通过逐点扫描样品，获得高清晰度的图像，特别适合观察细胞骨架、线粒体和内质网 等结构。
多光子荧光显微镜
总结词
一种非线性光学成像技术，适用于观察活体动物和组织。
详细描述
多光子荧光显微镜采用多光子激发技术，能够在不损伤样品的情况下获得高分辨率和高对比度的图像。它通过使 用脉冲激光和光子计数检测器，能够观察活体动物和组织中的荧光标记物，特别适合用于神经科学和生物学等领 域的研究。
Hale Waihona Puke 谢谢观看光源提供特定波长的激 发光，通常为紫外 光或蓝光。
样品
放置待观察的荧光 样品。
目镜或摄像系统
观察或记录荧光图 像。
荧光物质和激发光
荧光物质
某些物质在吸收激发光后，会发出特定波长的荧光。
激发光
用于激发荧光物质的特定波长光线。
荧光产生的原理
01
当荧光物质吸收激发光时，电子 从基态跃迁至激发态。
02
激发态的电子不稳定，会释放能 量并返回到基态，同时发出荧光 。
03
荧光显微镜的使用方法
荧光显微镜的安装和调试
安装
荧光显微镜应放置在平稳的工作台上 ，确保电源和光源的连接稳定。
调试
调整显微镜的焦距和光源亮度，确保 图像清晰可见。
荧光样品的制备
荧光染料选择
根据观察目标选择合适的荧光染料， 如FITC、TRITC等。
样品处理
将荧光染料与样品混合，进行染色处 理，然后洗涤和干燥。
，进行相应的调整。
使用注意事项
01 使用前先了解操作规程，遵循操作步骤， 避免因误操作导致仪器损坏。
荧光显微镜的原理和使用方法文稿演示
荧光显微镜的原理和使用方法文稿演示
• 某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活， 吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或 用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长的 光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见 光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后 可直接发出的荧光，称为自发荧光（如叶绿体中 的叶绿素分子受激发所发出的火红色的荧光）； 本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出的荧 光称为次生荧光。常用的荧光染料包括丫啶橙、 荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。
• 激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜（dichotic mirror）之间，物镜之前。滤镜的型号不同，数量 较多，可按不同需要选用。
• 阻断滤色镜（barrier filter）:阻断滤色镜 位于物镜之上，二向色镜和目镜之间，用 以阻断或吸收光路中的激发光或某些波长 较短的光线，以防伤害眼睛，使荧光透过。 选用的原则，以能完全阻断或吸收波长短 于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧 光。所以，阻断滤色镜的选用，应视荧光 染料的荧光光谱而定，以能最大限度地透 过荧光和阻断短波光。
• 2.2.3荧光显微镜的光路
• 荧光显微镜的光学原理图根据照明方式的 不同，荧光显微镜分为落射式荧光显微镜和透 射式荧光显微镜两种。目前常用的是落射式荧 光显微镜，特点是光源通过物镜落射于样品， 激发产生的荧光再通过物镜进入目镜。
• 透射荧光显微术光路:透射荧光显微术是激 发光束通过聚光器自下而上的透射样品，诱发 的荧光从物镜前方进入物镜。汞灯发出的强光 经集光透镜、吸热滤色镜、镜臂反光镜、激发 滤色镜、光路转换反光镜后光线转射向上，进 入视场光阑，暗视场聚光器，进入样品，激发 出的荧光射入物镜经阻断滤色镜进入目镜。
透射式荧光显 2．落射式荧光显微镜 ：这是近代发展起来的新 式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下 落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器 和收集荧光的物镜(图2―6)。光路中需加上一个 双色束分离器，它与光铀呈45°角，激发光被反 射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧 光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发 光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发 光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。 如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤 片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。 此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清 晰，放大倍数愈大荧光愈强
• 某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活， 吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或 用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长的 光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见 光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后 可直接发出的荧光，称为自发荧光（如叶绿体中 的叶绿素分子受激发所发出的火红色的荧光）； 本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出的荧 光称为次生荧光。常用的荧光染料包括丫啶橙、 荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。
• 激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜（dichotic mirror）之间，物镜之前。滤镜的型号不同，数量 较多，可按不同需要选用。
• 阻断滤色镜（barrier filter）:阻断滤色镜 位于物镜之上，二向色镜和目镜之间，用 以阻断或吸收光路中的激发光或某些波长 较短的光线，以防伤害眼睛，使荧光透过。 选用的原则，以能完全阻断或吸收波长短 于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧 光。所以，阻断滤色镜的选用，应视荧光 染料的荧光光谱而定，以能最大限度地透 过荧光和阻断短波光。
• 2.2.3荧光显微镜的光路
• 荧光显微镜的光学原理图根据照明方式的 不同，荧光显微镜分为落射式荧光显微镜和透 射式荧光显微镜两种。目前常用的是落射式荧 光显微镜，特点是光源通过物镜落射于样品， 激发产生的荧光再通过物镜进入目镜。
• 透射荧光显微术光路:透射荧光显微术是激 发光束通过聚光器自下而上的透射样品，诱发 的荧光从物镜前方进入物镜。汞灯发出的强光 经集光透镜、吸热滤色镜、镜臂反光镜、激发 滤色镜、光路转换反光镜后光线转射向上，进 入视场光阑，暗视场聚光器，进入样品，激发 出的荧光射入物镜经阻断滤色镜进入目镜。
透射式荧光显 2．落射式荧光显微镜 ：这是近代发展起来的新 式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下 落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器 和收集荧光的物镜(图2―6)。光路中需加上一个 双色束分离器，它与光铀呈45°角，激发光被反 射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧 光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发 光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发 光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。 如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤 片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。 此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清 晰，放大倍数愈大荧光愈强
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荧光显微镜的原理和使用方法
• 2.2.3荧光显微镜的光路
• 荧光显微镜的光学原理图根据照明方式的 不同，荧光显微镜分为落射式荧光显微镜和透 射式荧光显微镜两种。目前常用的是落射式荧 光显微镜，特点是光源通过物镜落射于样品， 激发产生的荧光再通过物镜进入目镜。
• 透射荧光显微术光路:透射荧光显微术是激 发光束通过聚光器自下而上的透射样品，诱发 的荧光从物镜前方进入物镜。汞灯发出的强光 经集光透镜、吸热滤色镜、镜臂反光镜、激发 滤色镜、光路转换反光镜后光线转射向上，进 入视场光阑，暗视场聚光器，进入样品，激发 出的荧光射入物镜经阻断滤色镜进入目镜。
• 荧光显微镜的光学原理见图3-3： 荧光显微镜的原理和使用方法
图3-1落射荧光显微镜光路图
荧光显微镜的原理和使用方法
图3-2落射荧光显微镜光路图 荧光显微镜的原理和使用方法
图3-3荧光显微镜的光学原理
荧光显微镜的原理和使用方法
荧光的种类
二次荧光
自发荧光（固有荧光）
荧光显微镜的原理和使用方法
荧光显微镜的类型
1、透射式荧光显微镜：激发光源是通过聚光 镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视 野集光器，也可用普通集光器，调节反光 镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比 较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时 荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光 减弱．所以对观察较大的标本材料较好。
荧光显微镜的原理和使用方法
透射式荧光显微镜效果图
荧光显微镜的原理和使用方法
透射式荧光显微镜光路图
荧光显微镜的原理和使用方法
• 2．落射式荧光显微镜 ：这是近代发展起来的新 式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下 落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器 和收集荧光的物镜(图2―6)。光路中需加上一个 双色束分离器，它与光铀呈45°角，激发光被反 射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧 光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发 光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发 光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。 如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤 片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。 此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清 晰，放大倍数愈大荧光荧显微光镜的愈原理强和使用方法
特殊显微镜的使用（3） 荧光显微镜的原理及其应用
• 一、实验目的： • 掌握荧光显微镜的原理和使用方法 • 二、实验原理 • 荧光显微镜(fluorescence microscope) 是荧光显微
术的基本装置。荧光显微术是利用一定波长的光 （通常是波长短的紫外光和蓝紫光）照射被检样 品，激发荧光物质发出可见的荧光。通过物镜和 目镜的成像、放大，以供检视和拍摄。荧光显微 镜具特殊光源，提供足够强度和波长的激发光， 诱发荧光物质发出荧光。视场中所见的像，主要 是样品的荧光映像。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活， 吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或 用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长的 光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见 光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后 可直接发出的荧光，称为自发荧光（如叶绿体中 的叶绿素分子受激发所发出的火红色的荧光）； 本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出的荧 光称为次生荧光。常用的荧光染料包括丫啶橙、 荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。
• 2.1.1光源:采用高压汞灯。Байду номын сангаас灯能以最小的表面 发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光
度稳定。汞灯的构件，中间为一球形石英玻璃管， 有两个钨电极，内充汞滴和少量氩氖混合气体。 汞灯装在牢固的灯室中，有调中、聚焦和集光装 置。使用中严禁频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，
不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭 后，不能立刻点亮，经5～10min，汞灯冷却后再 通电点亮。
• 细胞内大部分物质经短光波照射后，可发出较弱 的自发性荧光。有些细胞成分与能发出荧光的有 机化合物——荧光染料结合。激发后呈现一定颜 色的荧光，借以对组织进行细胞化学的观察和研 究。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 2.1 荧光显微镜的基本装置及其光路
•
荧光显微镜因制造厂家、型号的不同，结构
各异，但主要构件，基本相同。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 二向色镜（chromatic beam splitter）:荧光 显微镜中，除上述两类滤色镜外，尚有一 重要的分色镜系统——二向色镜位于汞灯 汞激发滤色镜构成的水平光轴与目镜和物 镜构成的竖直光轴的两轴垂直相交处，斜 向安装于光路之中。由镀膜的光学玻璃制 成，其镜面方位与上述两光轴交角均呈 45°，兼有透射长波光线和反射短波光线 的功能。在荧光显微术中承当色光的“分 流”作用。
•
HBO200Ｗ汞灯的发射光谱为200～600nm，
其中在365nm和435nm处有两个高峰。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 2.2.2滤色镜系统:荧光显微术的滤色镜，按用途 或功能，主要分为下列两类：
• 激发滤色镜（exciter filter）:激发滤色镜的作 用，在于为被检样品的荧光染料提供最佳波段的 激发光。荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰 值），利用滤色镜对光线选择吸收的能力，选用 其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激 发高峰）的激发滤色镜，以便从汞灯发出的广谱 光波中，选择透过最宜波段的光线供用。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 反射荧光显微术的光路:反射荧光又称落射 荧光，因激发光由物镜后部进入物镜，向 下落射样品，激发出荧光，荧光反射向上 再进入物镜。其光路如图3-1和3-2所示。
• 汞灯发出高强的激发光，经集光透镜， 吸热玻璃，孔径光阑，激发滤色镜，视场 光阑，通过二向色镜，在此处一定波长以 上的长波光线透过二向色镜，脱离光路， 一定波长以下的短波光线反射向下进入物 镜，透过物镜射向样品，激发荧光物质发 出可见的荧光，荧光反射向上再次进入物 镜，复经二向色镜其中波长较短的光线反 射至光源方向，荧光和长波光线透射向上 经阻断滤色镜进入目镜。
• 激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜（dichotic mirror）之间，物镜之前。滤镜的型号不同，数量 较多，可按不同需要选用。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 阻断滤色镜（barrier filter）:阻断滤色镜 位于物镜之上，二向色镜和目镜之间，用 以阻断或吸收光路中的激发光或某些波长 较短的光线，以防伤害眼睛，使荧光透过。 选用的原则，以能完全阻断或吸收波长短 于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧 光。所以，阻断滤色镜的选用，应视荧光 染料的荧光光谱而定，以能最大限度地透 过荧光和阻断短波光。
• 2.2.3荧光显微镜的光路
• 荧光显微镜的光学原理图根据照明方式的 不同，荧光显微镜分为落射式荧光显微镜和透 射式荧光显微镜两种。目前常用的是落射式荧 光显微镜，特点是光源通过物镜落射于样品， 激发产生的荧光再通过物镜进入目镜。
• 透射荧光显微术光路:透射荧光显微术是激 发光束通过聚光器自下而上的透射样品，诱发 的荧光从物镜前方进入物镜。汞灯发出的强光 经集光透镜、吸热滤色镜、镜臂反光镜、激发 滤色镜、光路转换反光镜后光线转射向上，进 入视场光阑，暗视场聚光器，进入样品，激发 出的荧光射入物镜经阻断滤色镜进入目镜。
• 荧光显微镜的光学原理见图3-3： 荧光显微镜的原理和使用方法
图3-1落射荧光显微镜光路图
荧光显微镜的原理和使用方法
图3-2落射荧光显微镜光路图 荧光显微镜的原理和使用方法
图3-3荧光显微镜的光学原理
荧光显微镜的原理和使用方法
荧光的种类
二次荧光
自发荧光（固有荧光）
荧光显微镜的原理和使用方法
荧光显微镜的类型
1、透射式荧光显微镜：激发光源是通过聚光 镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视 野集光器，也可用普通集光器，调节反光 镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比 较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时 荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光 减弱．所以对观察较大的标本材料较好。
荧光显微镜的原理和使用方法
透射式荧光显微镜效果图
荧光显微镜的原理和使用方法
透射式荧光显微镜光路图
荧光显微镜的原理和使用方法
• 2．落射式荧光显微镜 ：这是近代发展起来的新 式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下 落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器 和收集荧光的物镜(图2―6)。光路中需加上一个 双色束分离器，它与光铀呈45°角，激发光被反 射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧 光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发 光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发 光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。 如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤 片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。 此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清 晰，放大倍数愈大荧光荧显微光镜的愈原理强和使用方法
特殊显微镜的使用（3） 荧光显微镜的原理及其应用
• 一、实验目的： • 掌握荧光显微镜的原理和使用方法 • 二、实验原理 • 荧光显微镜(fluorescence microscope) 是荧光显微
术的基本装置。荧光显微术是利用一定波长的光 （通常是波长短的紫外光和蓝紫光）照射被检样 品，激发荧光物质发出可见的荧光。通过物镜和 目镜的成像、放大，以供检视和拍摄。荧光显微 镜具特殊光源，提供足够强度和波长的激发光， 诱发荧光物质发出荧光。视场中所见的像，主要 是样品的荧光映像。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活， 吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或 用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长的 光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见 光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后 可直接发出的荧光，称为自发荧光（如叶绿体中 的叶绿素分子受激发所发出的火红色的荧光）； 本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出的荧 光称为次生荧光。常用的荧光染料包括丫啶橙、 荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。
• 2.1.1光源:采用高压汞灯。Байду номын сангаас灯能以最小的表面 发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光
度稳定。汞灯的构件，中间为一球形石英玻璃管， 有两个钨电极，内充汞滴和少量氩氖混合气体。 汞灯装在牢固的灯室中，有调中、聚焦和集光装 置。使用中严禁频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，
不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭 后，不能立刻点亮，经5～10min，汞灯冷却后再 通电点亮。
• 细胞内大部分物质经短光波照射后，可发出较弱 的自发性荧光。有些细胞成分与能发出荧光的有 机化合物——荧光染料结合。激发后呈现一定颜 色的荧光，借以对组织进行细胞化学的观察和研 究。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 2.1 荧光显微镜的基本装置及其光路
•
荧光显微镜因制造厂家、型号的不同，结构
各异，但主要构件，基本相同。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 二向色镜（chromatic beam splitter）:荧光 显微镜中，除上述两类滤色镜外，尚有一 重要的分色镜系统——二向色镜位于汞灯 汞激发滤色镜构成的水平光轴与目镜和物 镜构成的竖直光轴的两轴垂直相交处，斜 向安装于光路之中。由镀膜的光学玻璃制 成，其镜面方位与上述两光轴交角均呈 45°，兼有透射长波光线和反射短波光线 的功能。在荧光显微术中承当色光的“分 流”作用。
•
HBO200Ｗ汞灯的发射光谱为200～600nm，
其中在365nm和435nm处有两个高峰。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 2.2.2滤色镜系统:荧光显微术的滤色镜，按用途 或功能，主要分为下列两类：
• 激发滤色镜（exciter filter）:激发滤色镜的作 用，在于为被检样品的荧光染料提供最佳波段的 激发光。荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰 值），利用滤色镜对光线选择吸收的能力，选用 其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激 发高峰）的激发滤色镜，以便从汞灯发出的广谱 光波中，选择透过最宜波段的光线供用。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 反射荧光显微术的光路:反射荧光又称落射 荧光，因激发光由物镜后部进入物镜，向 下落射样品，激发出荧光，荧光反射向上 再进入物镜。其光路如图3-1和3-2所示。
• 汞灯发出高强的激发光，经集光透镜， 吸热玻璃，孔径光阑，激发滤色镜，视场 光阑，通过二向色镜，在此处一定波长以 上的长波光线透过二向色镜，脱离光路， 一定波长以下的短波光线反射向下进入物 镜，透过物镜射向样品，激发荧光物质发 出可见的荧光，荧光反射向上再次进入物 镜，复经二向色镜其中波长较短的光线反 射至光源方向，荧光和长波光线透射向上 经阻断滤色镜进入目镜。
• 激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜（dichotic mirror）之间，物镜之前。滤镜的型号不同，数量 较多，可按不同需要选用。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 阻断滤色镜（barrier filter）:阻断滤色镜 位于物镜之上，二向色镜和目镜之间，用 以阻断或吸收光路中的激发光或某些波长 较短的光线，以防伤害眼睛，使荧光透过。 选用的原则，以能完全阻断或吸收波长短 于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧 光。所以，阻断滤色镜的选用，应视荧光 染料的荧光光谱而定，以能最大限度地透 过荧光和阻断短波光。