氨基转化作用
一、实验目的
1. 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用；
2. 学习应用纸层析法鉴定氨基转换反应；
二、实验原理
1. 体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转换酶的作用下，转换至α-酮酸的过程，称为氨基转换作用。
2. 本实验将谷氨酸和丙酮酸在肌肉糜中谷氨酸-丙氨酸氨基转换酶的作用下进行氨基转化反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。反应为L-谷氨酸+丙酮酸=α-酮戊二酸+L-丙氨酸，由于谷氨酸、丙氨酸在肌肉糜中可循其他代谢途径分解转化，因此在反应体系中添加溴乙酸抑制其他代谢过程。
三、实验仪器和试剂
１.试剂
1%谷氨酸溶液、1%丙酮酸钠溶液、0.1%KHCO3溶液、0.025%溴乙酸溶液、2%Hac溶液、0.1%标准谷氨酸溶液、0.1%标准丙氨酸溶液、1%KOH溶液、酚饱和溶液、0.1%茚三酮正丁醇溶液。
２.器材
兔子肉、研钵、毛细管、圆形滤纸、喉头喷雾剂
四、实验步骤
实验操作 实验现象
制备肌肉糜提取液：取1g兔肉于研钵，加入0.9%的NaCl溶液3mL，在低温下研磨成细浆，离心2min（8000rad/min），弃去沉淀，取上清液。 兔肉大量溶解，少量形成乳白色悬浊液；离心后上层为取色透明清液，下层为肉色沉淀。
取3支试管编号，1、2号试管各加入0.5mL1%谷氨酸溶液，0.5mL1%丙酮酸钠溶液，0.5mL0.1%KHCO3溶液，0.025mL0.025%溴乙酸溶液，混匀。然后分别加入肌肉糜提取液0.5mL，混匀。2号试管立即放入沸水中加热2-3min。3号试管先加入肌肉糜提取液0.5mL，放入沸水中加热2-3min，然后在按照1、2试管的配比加入各试剂。 1号试管透明澄清，2号试管上层漂浮着乳白色不溶物，下层为无色透明清液，3号试管有乳白色絮状沉淀。
用塞子塞住试管放入45℃恒温水浴中加热30min。 无明显现象。
保温完毕，取出试管，向每支试管中各加入4滴2%Hac溶液，再离心前，三支试管内容物与恒温水浴前无异；离心后，得无色透放入沸水浴中加热2min，使蛋白质完全沉淀，离心1min（12000rad/min），弃去沉淀，取上清液。 明上清液，下层有少量肉色沉淀。
生化实验报告
单位：
学号：
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实验1.多酚氧化酶（PPO）的分离提取
一、实验原理与目的
植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。
本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。
二、实验材料与试剂
1.材料：马铃薯（大约每小组100-200g）
2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH6.（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）配制时配×10倍的浓缩液1000ml； 固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）配制时配×10倍浓缩液100ml；0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）配制时配×10倍浓缩液1000ml； NaCl； 聚乙二醇： DEAE－纤维素 DE52； 葡聚糖凝胶Sephadex G-200:
三、 实验步骤
（1）粗酶提取： 马铃薯丁按1:1（W/V）比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。
（2）盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液再加入固体硫酸铵达到70％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀；沉淀用0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）溶解，装入透析袋中用0.02M KCl溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。
1. 氨基酸的分离鉴定——纸层析法
一、实验目的
✓ 了解层析技术的一般原理
✓ 掌握纸层析的方法和原理，学会分析未知样品的氨基酸成分
二、实验原理
➢ 层析法亦称色谱法，是利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到分离的目的
➢ 固定相：是由层析基质组成的，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用
➢ 流动相：是在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体。柱层析中一般称为洗脱液，薄层层析时称为展层剂
➢ 分配系数：是指在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比例，常用K来表示，它是层析中分离纯化物质的重要依据
➢ 迁移率：是指在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用Rf来表示
分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件，差异越大，分离效果越理想
➢ 层析根据不同的标准可以分为多种类型：如按固定相基质的形式不同可分为纸层析、薄层层析和柱层析；按流动相的形式不同可分为液相层析、气相层析和超临界层析；按分离的原理不同可分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等
➢ 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：
在一定条件下，某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关
动物医学 生化实验《实验四 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS–PAGE)》课件
一实验目的
1. 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的基本原理和操作方法。 2学习蛋白质分离纯化和鉴定方法。
2. 了解SDS-PAGE技术在动物医学研究中的应用。
二、实验原理
SD-PAGE是蛋白质分离纯化和鉴定的一种常用方法，它利用蛋白质分子量大小的不同，在电场作用下，通过聚丙烯酰胺凝胶进行分离。
1. SDS的作用
SDS是一阴离子表面活性剂，可以与蛋白质结合，使蛋白质分子解折叠并带负电荷。由于SDS与蛋白质的结合比例与蛋白质分子量成正比，因此SDS可以使不同蛋白质分子带相同的电密度，从而消除蛋白质分子本身电荷差异对电泳的影响。
2. 聚丙烯酰胺凝胶的作用
聚丙烯酰胺凝胶是一种多孔性物质，其孔径大小可以根据丙烯酰胺和交联剂的浓度进行调节。蛋白质分在电场作用下通过凝胶，根据其分子量大小不同，在凝胶中迁移速度也不同，从而实现蛋白质的分离。
3. 电泳原理
在电场作用下，带负电荷的蛋白质分子在凝胶中向正极迁移，分子小的蛋白质迁移速度快，分子量大的蛋白质迁移速度慢，最终在凝胶中形成不同的蛋白质条带。
三、实验材料
1. 试剂：
o SDS（十二烷基硫酸钠）
o Tris（三羟甲基氨基甲烷）
o 甘氨酸
o 丙烯酰胺
o 交联剂（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺）
o TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）
o 过硫酸铵（APS） o 考马斯亮蓝R-250
o 乙醇
o 醋酸
o 水
o 蛋白质样品
2. 仪器：
o 电泳槽
o 电源
o 微量移液器
o 烧杯
o 量筒
o 试管
o 培养皿
o 电泳仪
o 凝胶成像仪
o 其他实验室常用仪器
四、实验步骤
1. 凝胶的制备
(1)制备分离胶* 根据需要分离的蛋白质分子量范围，选择合适的丙烯酰胺浓度。
o 将丙烯酰胺、交联剂、Tris缓冲液、SDS、TEMED和APS混合，充分搅拌均匀。
