感受态细胞制作

感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞的制备是一项非常重要的实验技术，可应用于许多研究领域，如分子生物学、农药毒理学、农业植物保护等。

一般来说，将培养细胞转化为感受态细胞，可以有三种方法：
1、皮下注射引起的感受态细胞制备。

由于它是一种经典的制备方法，大多数细胞都可以使用。

其核心步骤是将小量液体注入传感源头(如病毒、菌株、多糖、细菌等)皮下。

这种技术可以帮助人们制备特定种类的感受态细胞，并且可以控制病毒的感染率。

2、利用细胞克隆引起的感受态细胞制备。

这种方法涉及到使用不同种类的细菌或病毒及其克隆进行感染。

一旦细胞受感染，感受态细胞就会形成。

此外，通过诱变基因表达等方式，也可以制备出不同感受源的感受态细胞。

3、利用小分子引起的感受态细胞制备。

小分子技术中的最新研究主要集中在核酸抑制剂、蛋白质结合蛋白、信号转导调节剂等。

这些小分子可以直接结合到感受细胞的特定分子，从而影响其功能，抑制或促进感受细胞的形成。

以上是三种感受态细胞制备的方法，它们均可用于解析某一特定基因或基因产物在细胞功能中的作用。

此外，这些技术还可用于识别及检测特定感受源，并评价其对细胞株功能的影响程度。

另外，它们还可用于发现新型抗病毒剂，以提高植物抗病能力。

因此，感受态细胞的制备实验在诸多方面都具有重要的意义，值得继续探索。

感受态细胞的制备的实验步骤CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。

以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。

感受态细胞的制备一、实验原理受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。

本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。

二、材料及准备工作一）材料准备二)试剂配制1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）蛋白胨 2.0g酵母提取物 1.0g氯化钠（NaCl） 2.0g2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）蛋白胨2×1.0g酵母提取物2×0.5g氯化钠（NaCl）2×1.0g琼脂粉2×1.5g温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。

4℃保存备用。

3、TSS液（100ml）（有效期2周）聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10%DMSO 5ml 终浓度5%MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/LLB 85ml 终浓度85%去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用注：聚乙二醇分子量可以为3000-80004、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用）KCl（2mol/L） 2.5mlCaCl2(1mol/L) 1.5mlMgCl2(1mol/L) 2.5ml水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒）5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml）取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃保存备用三）仪器设备1、低温大容量离心机2、恒温水浴锅3、超净台4、高压锅5、37℃孵育箱6、恒温摇床7、制冰机8、分光光度计9、微量移液枪10、低温冰箱三、步骤及注意事项一）感受态制备（TSS法）1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）；2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜；3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）；4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌；5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态；6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。

感受态细胞的制备—LB液体培养基：胰蛋白胨，1%（W/V）；酵母提取物，0.5%（W/V）；NaCl，1%（W/V），用固体NaOH调节pH为7.0~7.2，分装于三角瓶中，灭菌后存于室温。

摇动三角瓶，如果发现变浑浊，表明已染菌，应弃掉重新配制；—0.1 mol/L CaCl2：称取1.47 g CaCl2•2H20（Amresco分装）溶于100 mL去离子水中，灭菌后存于4℃；—离心管（50 mL或80 mL或100 mL），灭菌；—培养试管，灭菌；—1 mL枪头，灭菌；—1 mL加样枪；—滤纸，用牛皮纸包好后灭菌；—10 mL量筒，灭菌；—5 mL移液管，用棉花塞入管口，卷于报纸中灭菌；—冰，离心管架；—恒温摇床，可见分光光度计，玻璃比色杯。

1．接种空白大肠杆菌于3 mL LB培养基中，37℃剧烈震荡培养过夜；2．将已培养好的种子液转入100 mL LB培养基中扩大培养至OD650=0.3后，将培养好的细菌置于冰上冷却10 min；3．4℃，4 000 rpm离心10 min收集细菌，倒出上清，将离心管倒置于一干净滤纸上，将培养基控干；4．用40 mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌，用加样枪冲吸，使菌体尽可能分散。

冰上放置30 min；5．4℃，4 000 rpm离心10 min收集细菌，倒出上清，再用4 mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌，这些细菌可以立即使用，或者于4℃放置12~24 h以增加其敏感性后使用。

6．如果证明所制备的感受态细胞可用，可以在冰上分装为100 μL每管，再加入100 μL甘油（注意：甘油非常黏稠，吸取时应该多一点。

），于液氮或-70℃冰箱中存放。

存于低温下的感受态细胞，一定不能融解。

如果已经融解，应丢弃，而不能再冻结保存而继续使用。

注意事项：1．本实验室所用空白大肠杆菌菌株为JM109。

空白菌可以于平板上划线后，用Parafilm包好后存于4℃，也可将液体培养物存于4℃。

感受态细胞制备实验报告摘要本实验旨在探究感受态细胞的制备方法。

通过一系列步骤，我们成功地制备出感受态细胞，并通过染色实验证实了细胞的感受态转变。

实验结果表明，我们所采用的制备方法具有较高的可行性和有效性。

介绍感受态细胞是一种具有感受外界刺激并做出相应反应的细胞。

在生物学研究中，制备感受态细胞是一项重要的实验工作。

本文将详细介绍感受态细胞的制备方法，并通过实验证实其有效性。

实验材料和方法材料•细胞培养基•细胞培养器具（培养皿、离心管等）•细胞培养箱•细胞染色剂方法1.细胞培养基的制备：–将适量的细胞培养基粉末加入无菌蒸馏水中，并充分搅拌溶解。

–调整pH值至合适范围。

–通过过滤器过滤，获得无菌的细胞培养基。

2.细胞的预处理：–选择适宜的细胞系，如人类上皮细胞系。

–将细胞培养在培养皿中，以适宜的温度和湿度进行培养。

–在细胞生长到合适密度时，进行下一步操作。

3.细胞的感受态诱导：–将培养皿中的细胞用无菌PBS缓冲液洗涤一次，以去除培养基中的成分。

–加入含有感受态诱导剂的培养基。

–将培养皿置于细胞培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间。

4.细胞的染色实验：–取出培养皿中的细胞，用PBS缓冲液洗涤去除培养基。

–按照染色剂使用说明，加入合适浓度的染色剂。

–在暗处孵育一定时间，使细胞充分染色。

–用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除多余的染色剂。

–观察细胞染色情况，使用显微镜拍摄图像。

结果与讨论经过以上步骤，我们成功地制备了感受态细胞，并通过染色实验证实了细胞的感受态转变。

观察到染色后的细胞明显显示出感受态特征，与对照组相比，表现出明显的区别。

这说明我们所采用的制备方法具有较高的可行性和有效性。

通过本实验，我们对感受态细胞的制备方法有了更深入的了解。

然而，还需要进一步的研究来探究感受态细胞的特性以及其在生物学研究中的应用。

此外，我们也可以尝试其他方法来制备感受态细胞，以寻求更高效的制备方法。

结论本实验通过一系列步骤成功地制备出了感受态细胞，并通过染色实验证实了细胞的感受态转变。

TSS方法（又称一步法）制备感受态细菌傻瓜程序一、准备工作1、配置1M 氯化镁或硫酸镁氯化镁（一般含6个水分子）或硫酸镁（二者效果一样）母液，不用灭菌，用时根据需2、配制1×TSS溶液（20ml）tryptone(1%) 0.2gYeast extract(0.5%) 0.1gNaCl(1%) 0.2gPEG(MW= 3350-8000) (10%) 2gDMSO（5%）1mlMgCl2(20-50mM) 1M MgCl2 400ul-1ml，或0.081~0.203 g六水氯化镁加14ml水（最好是超纯水）溶于三角瓶或烧杯中，搅拌使溶解，用量筒定容至20ml，用稀盐酸或氢氧化钠调ph至6.5(6.4-6.8均可)，过滤除菌（0.22或0.45um滤膜），4℃保存备用（可保存6月左右）。

注：如配制2×TSS溶液，试剂加倍即可，其它操作不变。

3、准备器具注射器，过滤器及滤膜——自来水洗净，去离子水冲洗数次，最后用超纯水浸泡并洗数次，保证器具不含干扰物质，然后装至一干净烧杯（去离子水冲洗过）中高温高压灭菌，注射器可不灭试剂瓶，1个，自来水洗净，去离子水冲洗数次，最后用超纯水浸泡并洗数次，灭菌，用于过滤除菌时接收过滤液50ml管子（管底注意圆或尖，4℃离心时与配备的冷冻离心机转头相配）2个（可多准备几个），自来水洗净，去离子水冲洗数次，用超纯水涮洗一次，然后装2/3管超纯水高温高压灭菌，用时把水倒掉1.5ml离心管（新开包装的，保证干净），200个（用来分装感受态），用干净的铝盒装好，铝盒外用报纸包住，橡皮条扎紧，灭菌，用前20小时整个置于-20℃冰箱预冷。

镊子1个，灭菌干净，锡箔纸包好灭菌，用来夹取1.5ml离心管。

液氮或预冷到-70℃的工业酒精（提前20h用500ml玻璃瓶装好置于-70℃冰箱中预冷），用于后面速冻分装好的感受态细胞不含抗生素的平板数个，含抗生素的平板数个250ml三角瓶（棉塞或锡箔纸封住）3-4个，全部自来水洗净，去离子水冲洗数次，一个装10-30mlLB，另一个装50ml，灭菌，用来培养细菌灭菌一次性吸头，全部新鲜灭菌，且用前未开过吸头盒盖4℃离心机（最好能装50ml离心管），超净工作台，酒精灯等二、制作感受态1、划线平板取-20℃或-70℃保存甘油菌划线于无抗生素平板，不要用4℃或常温保存菌，过夜培养（12-18h）2、扩大培养和培养指数初期细胞挑单菌落至10-30 m lLB（三角瓶或50ml管）中过夜培养（12-16h）。

感受态细胞制备的方法
感受态细胞的制备方法有多种，其中一种常用的方法是通过转染的方式将特定的基因（例如感受器基因）导入目标细胞中，从而使得这些细胞能够表达特定的感受器或相关蛋白。

这种方法可以使用病毒载体、质粒转染等多种技术实现。

感受态细胞的制备主要有以下步骤：
1. 获取目标细胞：从人体组织或动物模型中获取需要制备感受态细胞的细胞。

2. 选择合适的载体：根据研究需要选择适合的载体，如病毒载体或质粒。

3. 构建转染载体：将目标基因插入到载体中，构建转染载体。

4. 转染目标细胞：将转染载体导入目标细胞中，使其表达特定的感受器或相关蛋白。

5. 筛选稳定表达细胞：通过特定的筛选方法，筛选出稳定表达目标基因的细胞。

6. 验证感受态细胞的功能：通过功能实验等方法验证感受态细胞的功能。

感受态细胞制备的方法可以提供研究人员一个有效的工具，用于研究特定感受器或相关蛋白在生物体内的功能和调控机制。

这些细胞可以用于药物筛选、疾病研究和基因治疗等领域，有助于深入了解感受机制，并为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和途径。

感受态细胞制备流程感受态细胞制备流程，这是一个非常复杂和精确的过程，涉及到许多实验室技术和设备。

感受态细胞是指在特定的刺激下，可以触发细胞产生反应的细胞状态。

感受态细胞的制备可以用于研究许多生物学过程，如细胞信号传导、疾病机制等。

下面是一个常见的感受态细胞制备的流程：1.细胞培养首先，需要准备细胞培养基和细胞培养器皿。

细胞培养基是提供营养物质和条件来维持细胞生长和增殖的液体。

培养器皿选择取决于所使用的细胞类型和实验的要求。

然后，将细胞接种到培养器皿中，并在恒定的温度和湿度下进行培养。

2.细胞处理一旦细胞生长到足够数量，可以开始进行细胞处理。

这可以包括刺激细胞，例如添加化学物质、压力或温度变化。

刺激过程需要精确控制，以确保得到一致的结果。

3.细胞取样在细胞处理后，需要进行细胞取样。

这可以通过用吸管或毛细管吸取细胞悬浮液来实现。

取样过程需要快速和准确，以确保细胞状态的准确性。

4.细胞固定取样后，细胞需要固定以保持其形态和结构。

常用的细胞固定方法包括用甲醛或乙醛等化合物进行固定。

细胞固定可以帮助保留细胞结构和细胞内分子，以便后续的染色或分析。

5.染色和标记对固定的细胞进行染色或标记是感受态细胞制备的关键步骤。

染色和标记可以使用各种荧光染料或抗体来实现。

这可以通过将染料或抗体直接添加到细胞上，或使用转染技术将其引入细胞内。

6.显微镜观察完成染色和标记后，可以使用显微镜来观察细胞。

显微镜观察可以提供关于细胞形态和结构的信息，并且可以检测到染色或标记物的荧光。

这可以帮助研究人员获得有关感受态细胞的更多信息。

7.数据分析和解读最后，需要对得到的数据进行分析和解读。

这可能涉及到图像处理、统计学方法和生物学解释等。

数据分析和解读的目的是从实验结果中提取有意义的信息，并为后续的研究和应用做出贡献。

感受态细胞制备的流程是一个需要仔细和精确操作的过程。

任何一个步骤的错误或偏差都可能导致不准确的结果。

因此，研究人员需要具备高度的实验技能和实验室安全意识。

实验五感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。

二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。

通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。

细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。

将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。

通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。

三、试剂与仪器（一）试剂1．0.1mol/L CaCl2称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。

2．LB液体培养基（见实验一）3．LB固体培养基（见实验一）4．氨苄青霉素（100mg/ml）（二）仪器1．冷冻离心机2．平衡天平3．无菌操作台4．微量移液器5．高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。

2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。

3．取1ml菌液（接种）到50 ml LB中(37℃，预热), 扩大培养。

应准备两个培养物。

4．约2小时开始，用一个培养测OD600值（此培养只做测量OD600值用，OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。

OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。

所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。

5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。

6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。

7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。

感受态细胞的制备（DH5α）一、准备工作所有试剂、容器均需提前预冷。

1、实验器械4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。

2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧）① LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。

② SOB培养基（Super Optimal Broth）③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl20.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。

然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。

（装在50ml离心管，封口4度保存）④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl20.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。

然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。

配制量 1 L配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。

（50ml离心管分装）在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。

2.配制2 M MgCl2溶液。

（50ml离心管分装）在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。

5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。