高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训

某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出
所需流动相体积,一般情况下常以ml为单位。细内 径柱和毛细管柱,由于所需流动相流量很小, FC的 单位用μ1/min表示,此时VR可采用为μ1单位。
不保留物质流出时间以tM表示,又称死时间。 而tM・FC即为保留物质死体积,简称死体积(VM)。 死体积不仅与柱结构有关,而且与进样系统、检测 系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时, tM ・FC才表示柱内流动相所占的体积。以VM表示。 任何色谱过程的基本保留方程式为VR=VM+KVS式 中,K为平衡分配系数, VS为固定相体积,Vm为柱内 流动相所占体积(当柱外体积不容忽略时,Vm表示 柱内空隙及柱外体积之总和)。
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
基本参数
（一）保留值 保留值是用来描述样品组分在色谱柱
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
少固定相粒径，可以提高柱效，相应的柱压增高，可进行快
速分离。第三，提高容量因子（k’）方法提高分离度，可通 过以下方法实现：（1）调节流动相极性、pH值、离子强度 等；（2）梯度洗脱。另外，如果k’值过大，会造成分离时间 过长，并且谱带扩散严重，因此，比较适宜的k’值范围为 1≤k’≤10。
拖尾因子T
高效液相色谱法基本 知识培训-化验员入门
培训
第一节 高效液相色谱 的定义及基本参数
定义
高效液相色谱法系采用高压输液泵将 规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱， 对供试品进行分离测定的色谱方法。注入 的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组 分在色谱柱内被分离，并依次进入检测器， 由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
2.分离度（R）
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离
物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能 的关键指标。可以通过测定待测物质与已 知杂质的分离度,也可以通过测定待测组分 与某一添加的指标性成分(内标物质或其他 难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品 用适当的方法降解,通过测定待测组分与某 一降解产物的分离度,对色谱系统进行评价 与控制。
调整保留时间和调整保留体积
扣除死时间或死体积的保留值,定义为调整保 留时间(t’R)和调整保留体积(V’R),如下式所示。
t’R =tR-tM V’R =VR-VM 保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱 操作条件一定时,不同物质的有其特定的保留值。 这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中,由 于流动相参与了溶质分配过程,因此,样品组分的保 留值不仅与固定相的性质有关,而且受流动相性质 变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成 对保留值的影响,是分离条件最佳化的基础。
用于评价色谱峰的对 称性。为保证分离效 果和测量精度,应检查 待测峰的拖尾因子是 否符合各品种项下的 规定。
重复性
用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重 复性能。采用外标法时,通常取各品种项下 的对照品溶液,连续进样5次,除另有规定外, 其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 2.0%；采用内标法时,通常配制相当于80%、 100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内 标溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别至少 进样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏 差应不大于2.0%。
无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标 峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外, 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。
计算公式为：
首先，可以通过增加分离因子（α）值的方法提高分离度，可 通过以下方法实现：（1）改变流动相的组成；（2）改变流 动相的pH值；（3）改变固定相的种类；（4）改变分离温度。 其次，提高理论板数（N）可以提高分离度：（1）柱长增加1 倍，柱效也增加1倍，但相应的分离时间也增加1倍；（2）减
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
容量因子(k’)
容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数, 它是样品组分的质量在两相中分配的比值,定义为
k’=固定相中溶质的质量(ms) = k・Vs
流动相中溶质的质量(mm)
Vm
VR=Vm+k’(Vm/Vs)·Vs= Vm+k’Vms = Vms·(1+k’)
式两边除以冲洗剂流速Fc则得
tR = tM(1+k’)
溶质的色谱保留行为主要是由该溶质 在固定相和流动相中的平衡分配系数K所决 定的,而K是溶质在两相间达到平衡分配时 性质上的度量。其定义为,溶质在两相间达 到平衡时在固定相和流动相中的浓度比。
K= 溶质在固定相中的浓度(ms/Vs) = ms ・Vm 溶质在流动相中的浓度(mm/Vm) mm Vs
式中,ms、mm分别为溶质在固定相和流 动相中的质量。
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。