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浅谈心肌细胞培养技术及其进展作者：陈阜绪宋洁来源：《医学信息》2016年第23期摘要：细胞培养技术是生物医学研究中最常用和最重要的技术之一，本文就心肌细胞的经典培养模型和新进展作一综述。
关键词：心肌细胞；细胞培养；三维培养Abstract：Cell culture is one of the most commonly used and the most important techniques in the biomedical research. In this paper， the classical cardiomyocyte culture methods and the latest progress in this field are reviewed.Key words：Cardiomyocyte；Cell culture；Three-dimensional cultivation细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是疾病发生和转归的基础。
因此，细胞是生物医学研究中最重要的环节。
在体细胞研究存在诸多局限性，如成本高、影响因素复杂、可重复性差等，为解决这些困难，离体细胞培养技术应运而生。
细胞培养（cell culture）是细胞在离体条件下的克隆性增殖过程，具有成本低、周期短、数量多、单克隆性、条件可控等诸多优势。
可以说，细胞培养技术是生物医学研究中最基础最重要的技术之一。
本文仅就心肌细胞培养技术及其进展作一浅述。
1经典心肌细胞培养模型鼠心肌细胞是心肌细胞培养最常用的材料，包括未成熟心肌细胞（immature cardiomyocyte，ICM）和成熟心肌细胞（adult cardiomyocyte，ACM）两种。
ICM培养技术是由Harary等在1960年建立的[1]，经过后人改进形成了经典的Simpson培养法[2]。
ICM主要来源于胚胎鼠和乳鼠，以出生3 d内的乳鼠心室肌细胞最常用。
４３０ 易东升，等：大鼠乳鼠成骨细胞建立及其生物学活性的研究基础医学 ｄｏｉ：１０．１１７２４／ｊｄｍｕ．２０１４．０５．０６大鼠乳鼠成骨细胞建立及其生物学活性的研究易东升１，林 琳１，高 峰２（１．大连市第二人民医院骨外科，辽宁大连１１６００１；２．大连医科大学，辽宁大连１１６０４４）［摘要］ 目的 建立一种简单、快速、成活率和纯度高的原代培养方法，以获得大量成骨细胞，并对成骨细胞生物学活性进行研究。
方法 无菌取５日龄ＳＤ大鼠的颅盖骨，采用改良的二次酶消化法分离成骨细胞，通过倒置相差显微镜观察，并用碱性磷酸酶和矿化结节染色鉴定，利用微量滴定（ＭＴＴ）法测定一个培养周期的成骨细胞活性分布；培养的成骨细胞单独应用ＢＭＰ－２和ＢＭＰ－７以及联合应用ＢＭＰ－２和ＢＭＰ－７作用４８ｈ后，用ＭＴＴ法检测成骨细胞增殖，同时测定成骨细胞裂解液中碱性磷酸酶（ＡＬＰ）活性和骨钙素（ＯＣＮ）含量。
结果 较为快速获得大量成骨细胞，成骨细胞培养至第１０天时活性最强。
单独应用ＢＭＰ－２和ＢＭＰ－７，联合应用ＢＭＰ－２和ＢＭＰ－７作用４８ｈ后，均能刺激大鼠乳鼠成骨细胞的增殖，增加成骨细胞ＡＬＰ活性和ＯＣＮ含量，但单独应用ＢＭＰ－２和ＢＭＰ－７组与对照组比较差异无显著性意义（P＞０．０５）。
联合应用ＢＭＰ－２和ＢＭＰ－７作用后，与对照组、单独应用ＢＭＰ－２和ＢＭＰ－７组比较，能明显增强成骨细胞生物学活性，差异具有显著性意义（P＜０．０５）。
结论 用改良的二次酶消化法能够在短时间内获得大量成骨细胞。
联合应用ＢＭＰ－２和ＢＭＰ－７能使成骨细胞生物学活性得到显著增强。
［关键词］ 成骨细胞；骨形态发生蛋白；碱性磷酸酶；细胞增值；骨钙素［中图分类号］ Ｒ３１８．１７ ［文献标志码］ Ａ 文章编号：１６７１－７２９５（２０１４）０５－０４３０－０５［引用本文］ 易东升，林琳，高峰．大鼠乳鼠成骨细胞建立及其生物学活性的研究［Ｊ］．大连医科大学学报，２０１４，３６（５）：４３０－４３４．Establish of neonat al rat osteoblasts and researchof osteoblasts biological activiesＹＩＤｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ１，ＬＩＮＬｉｎ１，ＧＡＯＦｅｎｇ２（１．Orthopedic Surgery，the Second Peopl e′s Hospital of Dalian，Dalian１１６００１，China；２．Dalian Medi－cal University，Dal ian１１６０４４，China）［Abstract］ObjectiveＴｏｃｕｌｔｕｒｅａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｐｕｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｗｉｔｈｈｉｇｈｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ，ｗｈｉｃｈｗｏｕｌｄｂｅａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆｂｏｎｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ｀ｓｂｉｏｌｏｇｙａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｗｉｔｈｕｓｉｎｇｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆＢＭＰ－２ａｎｄＢＭＰ－７．Methods５ｄａｙｓｏｌｄＳＤｒａｔｓｒｅｃｅｉｖｅｄａｎａｓｅｐｔｉｃｓｕｒｇｅｒｙｔｏｇｅｔｉｔｓｃａｌｖａｒｉａｂｏｎｅ．Ａｎｉｍｐｒｏｖｅｄｓｅｃｏｎｄｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｓｅｐａｒａｔｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ．Ｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔａｃｔｉｖｉｔｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｔｈｅｉｎｖｅｒｔｅｄｐｈａｓｅｃｏｎ－ｔｒａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓｔａｉｎｉｎｇ，ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄｎｏｄｕｌｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｍｉｃｒｏ－ｔｉｔｒａｔｉｏｎ（ＭＴＴ）ｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｕｓｅｄａｆｔｅｒａｃｕｌｔｕｒｅｃｙｃｌｅ．ＣｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈＢＭＰ－２ａｎｄＢＭＰ－７ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｎｄｂｏｔｈｌｙ．Ａｆｔｅｒ４８ｈ，ＭＴＴｗａｓｕｓｅｄｔｏａｓｓａｙｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅＡＬＰａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＯＣＮｃｏｎｔｅｎｔｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｆｒｏｍｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ．Results ＭＴＴｍｅｔｈｏｄａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ１０ｄｗａｓｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｓｔａｃｔｉｖｉｔｙｔｉｍｅａｆｔｅｒｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄ．ＴｈｅｎｅｏｎａｔａｌｒａｔｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｕｓｉｎｇＢＭＰ－２ａｎｄＢＭＰ－７，ｓｏｗａｓｔｈｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆＢＭＰ－２ａｎｄＢＭＰ－７．ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔＡＬＰａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＯＣＮｃｏｎｔｅｎｔｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｕｓｉｎｇＢＭＰ－２ａｎｄＢＭＰ－７ｒｅ－ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｎｄｂｏｔｈｌｙ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｕｓｉｎｇＢＭＰ－２ａｎｄＢＭＰ－７ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｒｅｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．ＴｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＢＭＰ－２ａｎｄＢＭＰ－７ＨＡｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｓｉｇｎｉｆｃａｎｔｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｗｈｅｎｃｏｍｐａｒｅｄｔｏＢＭＰ－２ａｎｄＢＭＰ－７ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｔｒｅａｔｍｅｎｔｅｄｇｒｏｕｐ（P＜０．０５）．ConclusionＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｔｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎｃａｎｂｅａｂｌｅｔｏａｃｃｅｓｓａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｉｎａｓｈｏｒｔｔｉｍｅ．Ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅｎｈａｎｃｅｄｗｉｔｈｉｎｃｏｒｐｏｒａ－ｔｉｏｎｏｆＢＭＰ－２ａｎｄＢＭＰ－７．［Key words］ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ；ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ；ａｌｋａｌｉｎｉｔｙｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ｃｅｌｌｉｎｃｒｅｍｅｎｔ；ｂｏｎｅｃａｌｃｉｕｍｅｌｅｍｅｎｔ作者简介：易东升（１９７８－），男，辽宁营口人，主治医师。
ＳＤ乳鼠原代心脏成纤维细胞培养及鉴定杨艳１ ，欧阳伟炜１，２ ，苏胜发１，２，马筑１，２，李青松１，２，耿一超１，２，卢冰１，２（１．贵州医科大学附院肿瘤科，贵州省肿瘤医院肿瘤科，贵州贵阳 ５５０００４；２．贵州医科大学肿瘤学教研室，贵州贵阳 ５５０００４）［摘 要］目的：建立一种乳鼠心脏成纤维细胞分离、培养及鉴定的方法。
方法：选取新出生的ＳＤ乳鼠，用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化组织，差速贴壁法分离纯化心脏成纤维细胞；倒置显微镜观察细胞形态特征及生长情况，并进行Ｖｉｍｅｎｔｉｎ免疫组化对培养的原代细胞进行鉴定，观察原代细胞生长中出现污染情况。
结果：差速贴壁６０～９０ｍｉｎ后镜下可见圆形细胞贴壁，２ｄ后可见细胞呈梭形、扁平形、三角形或多角形，且细胞数量增多、核分裂相增多；第３～４天时细胞生长约９０％，免疫组化见细胞染色达９０％以上，在原代细胞培养４８ｈ时出现细菌污染。
结论：成功建立一种稳定、有效的心脏成纤维细胞培养方法。
［关键词］心脏；成纤维细胞；形态发生；免疫组织化学；原代培养；鉴定［中图分类号］Ｒ３２９．２；Ｑ９５４．６ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１０００ ２７０７（２０２０）０４ ０４２７ ０５ＤＯＩ：１０．１９３６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１０００ ２７０７．２０２０．０４．０１０ＣｕｌｔｕｒｅａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｒｉｍａｒｙＣａｒｄｉａｃＦｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｉｎＳＤＮｅｏｎａｔａｌＭｉｃｅＹＡＮＧＹａｎ１，ＯＵＹＡＮＧＷｅｉｗｅｉ１，２，ＳＵＳｈｅｎｇｆａ１，２，ＭＡＺｈｕ１，２，ＬＩＱｉｎｇｓｏｎｇ１，２，ＧＥＮＧＹｉｃｈａｏ１，２，ＬＵＢｉｎｇ１，２（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，ＧｕｉｚｈｏｕＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，ＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｉｎＳＤｎｅｏｎａｔａｌｍｉｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅＳＤｎｅｗｂｏｒｎｍｉｃｅｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｎｄｔｈｅｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈｔｒｙｐｓｉｎａｎｄｔｙｐｅＩＩｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，ａｎｄｔｈｅｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｒａｐｉｄａｄｈｅｒｅｎｃｅ．Ｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓａｎｄｍｙｏｃａｒｄｉａｌｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓａｎｄｇｒｏｗｓｏｆｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ＴｈｅｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌｓａｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＶｉｍｅｎｔｉｎｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｔｈｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｆｔｅｒ６０～９０ｍｉｎｕｔｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌａｄｈｅｓｉｏｎ，ａｄｈｅｒｅｎｔｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｆｏｒｍｅｄｓｐｈｅｒｉｃａｌｃｅｌｌｍａｓｓａｎｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｐｉｎｄｌｅ ｓｈａｐｅｄａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄｒａｐｉｄｌｙａｆｔｅｒ２ｄａｙｓ．Ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｏｎｆｌｕｅｎｔａｆｔｅｒ３～４ｄａｙｓａｎｄｎｕｃｌｅａｒｆｉｓｓｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｄ．ＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆＶｉｍｅｎｔｉｎｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｔａｉｎｉｎｇｗｅｒｅｎｅａｒｌｙｕｐｔｏ９０％．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｏｃｃｕｒｒｅｄｄｕｒｉｎｇｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｔ４８ｈ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｉｓｅｃｏｎｏｍｉｃａｌａｎｄｓｔａｂｌｅｔｏｉｓｏｌａｔｅｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｗｉｔｈｈｉｇｈａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｈｉｇｈｐｕｒｉｔｙｆｒｏｍａｄｕｌｔｍｉｃｅ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｈｅａｒｔ；ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ；ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ７２４第４５卷 第４期２０２０年４月 贵州医科大学学报ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＧＵＩＺＨＯＵＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｖｏｌ．４５ Ｎｏ．４２０２０．４［基金项目］贵州省科技厅课题［黔科合ＬＨ字（２０１４）７１３５］；贵州省教育厅创新群体重大研究项目［黔教合ＫＹ字（２０１６）０３２］；国家自然科学基金地区科学基金项目（８１６６０５０７）贵州医科大学２０１５级硕士研究生 通信作者Ｅ ｍａｉｌ：ｏｕｙａｎｇｗｗ１０３１７３＠１６３．ｃｏｍ；ｌｂｇｙ－ｍａａａａ＠１６３．ｃｏｍ 成纤维细胞是疏松结缔组织中最主要的细胞，可分泌多种生长因子调节细胞增殖及分化。
原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞）目录 3 原代分离——SD 大鼠心肌细胞的分离4 原代分离——SD 大鼠心肌成纤维细胞的分离SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维的分离目的与意义（心肌细胞）心肌细胞体外培养可以为心肌细胞生理、药理及心血管相关研究提供有效、稳定的实验模型，在医学领域有着广泛的应用前景。
体外培养的心肌细胞可保存其形态结构和功能上的某些特点，同时去除了体内外各种限制因素的影响 , 具有精确和重复性好等优点, 可广泛用于心肌结构、病理生理、电生理、药理及毒理、受体及作用机制、心室肌细胞损伤模型及药物保护等的研究。
其次，大鼠动物模型广泛用于心血管系统疾病的基础研究。
目的与意义（心肌成纤维细胞）心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。
非心肌细胞占细胞总数的 70%，其中 90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。
近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，与风湿性心脏病、心肌炎、心肌肥厚、慢性心肌缺血、心肌梗死、炎症等病理状态均密切相关，因此 ,对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。
心脏 大鼠的心脏位于胸腔内，两侧隔心包与左、右肺紧邻，背侧有气管、支气管和食管。
腹侧借较宽的胸心包韧带和胸骨相连，腹前方与胸腺相贴，后面靠近膈。
C腹侧面B A心肌细胞根据组织学特点、电生理特性分为两类：工作细胞：普通心肌细胞：如心房肌细胞、心室肌细胞，无自律性，主要执行收缩功能；自律细胞：特殊分化的心肌细胞，组成心脏特殊传导系统，如窦房结细胞，收缩功能基本丧失；DESD Rat心脏HE染色F7心肌成纤维细胞 1、 心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CFS)遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接心肌细 胞间质。
CFS 参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏发育、结构、细胞信号系统、物质代 谢等密切相关；它还可与心肌细胞、其它CFS 甚至内皮细胞之间相互接触，影响电机械功 能、细胞因子分泌和血管生成。
乳鼠肌源干细胞的培养及其成肌分化的实验研究任振敏;马东礼;黄锦桃;李朝红;谢富康【摘要】目的体外培养乳鼠肌源干细胞,探讨其成肌分化的能力. 方法采用混合酶消化法制备乳鼠肌源干细胞,反复差速贴壁法纯化,利用银环蛇毒素鉴定肌管表面的乙酰胆碱受体,并对相应的与肌分化相关的蛋白进行免疫荧光分析. 结果体外培养的肌源干细胞分化成肌管,表达乙酰胆碱受体,且表达骨骼肌和心肌特异性蛋白. 结论采用混合酶消化法消化,反复差速贴壁法纯化可以得到多数量高纯度的肌源干细胞.【期刊名称】《中国生育健康杂志》【年(卷),期】2017(028)005【总页数】5页(P485-488,封4)【关键词】肌源干细胞;肌管;反复差速贴壁法;乙酰胆碱受体【作者】任振敏;马东礼;黄锦桃;李朝红;谢富康【作者单位】518000深圳,深圳市儿童医院检验科;518000深圳,深圳市儿童医院检验科;中山大学医学实验教学中心;中山大学中山医学院组织学与胚胎学教研室;中山大学中山医学院组织学与胚胎学教研室【正文语种】中文肌源干细胞(muscle-derived stem cells，MDSCs)存在于肌纤维的肌膜与基板之间，多处于静息期，在肌肉组织损伤并需要修复时大量增殖，它维持着肌肉组织的自我更新[1]。
经研究发现，MDSCs在一定条件下可分化为骨骼肌细胞、平滑肌细胞[2]、甚至神经细胞[3]。
MDSCs作为种子细胞，已用于压力性尿失禁[4]、杜氏肌营养不良[5]、心肌疾病[6]等较多疾病的治疗研究。
本研究的目的就是体外培养MDSCs并初步探讨其成肌特性，为以后的基因治疗和组织工程奠定基础。
对象与方法1.对象：新生3～5 d的SD乳鼠(中山大学动物实验中心提供)，DMEM/F12培养基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(天津TBD公司)，Dispase酶(Roche公司)，Cardiac troponin T抗体(Santa Cruz公司)，胰蛋白酶、明胶、胶原酶I、DAPI、乙酰胆碱、α-银环蛇毒素试剂购于Sigma公司，PBS平衡液、结蛋白(desmin)单克隆抗体、骨骼肌肌球蛋白(skeletal myosin)抗体购于博士德公司。
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养㈠、概述整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。
小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。
㈡、[试剂]1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。
3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L㈢、[实验步骤]1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min 振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。
（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中（37℃5%CO2）培养。
乳鼠心肌细胞的培养方法摘要细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出,模拟动物体内的生理条件,在体外进行培养.使其不断地生长、繁殖,人们借以观察细胞的生长、繁殖;细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
对乳鼠心肌细胞的培养进行理论和实验探讨。
关键词乳鼠心肌细胞;细胞培养;方法1材料所需液体:Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。
试剂:Trypsin,SDS,DMEM均购于SigmaChemicalCo.小牛血清购于杭州四季青生物制品有限公司,其余均为国产分析纯。
取鼠:标准SD大鼠,鼠盆用棉铺好,取鼠。
物品:白大衣、饭盒;小剪子、小镊子(4套)(一套剪皮肤、一套开胸取心,一套剔除心缘纤维组织,一套剪碎心脏);瓶皿(2套);250ml烧杯3个;500ml烧杯1个,用作废液缸;50ml烧杯3个(剪碎心肌组织,最后配液);三角烧杯(50ml)小转子(小转子,酒精擦,双蒸水冲后,再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压);离心管及帽(12-14个),两个试管;吸管(5-8个)大镊子(两把,持物,例夹棉球等);台面:磁力搅拌器、纱布(事先用于托盘装0.1%新洁尔灭浸泡)、试管架、泡沫塑料板、五个针头(不用消毒)75%酒精棉球及碘酒(消毒棉球,泡酒精、碘酒)大镊子两把(一把夹棉球,一把取鼠)、3个250ml烧瓶(一个装一蒸水,一个装新洁尔灭,另一为空的备用)1个500ml烧瓶(废液缸)、温度计、PH试纸(事先调PH值)、酒精灯、打火机/火柴、载玻片(5-10个)、注射器5ml6个(胰酶、DMEM、小牛血清)1ml2个(双抗液)20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml。
以上物品均用紫外线照30分钟。
另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。
事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。
检查酒精灯是否有酒精,碘酒和酒精棉球是否够用。
乳鼠心肌细胞原代培养综述乳鼠心肌细胞原代培养综述【摘要】：目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但是心肌细胞成活率、搏动率，纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。
本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。
【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养1．新生大鼠鼠龄的选择乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。
2．消化酶的选择使用分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。
消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。
其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。
所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。
另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。
且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。
61 g·L-1，我们使用的为0。
8 g·L-1。
胶原酶最好现用现配。
3．污染防治虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。
