实验报告(20200622234258)

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实验报告
一.实验目的
质粒提取即将质粒与细菌基因组DNA 分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。

本次实验的目的主要是获得相对纯净的植物表达载体质粒E1-PUC18
二.实验内容
1. 理解质粒提取的基本原理
2. 熟悉质粒提取的基本操作步骤
3. 获得相对纯净的目的质粒三.实验原理
1. Buffer P1(重悬菌体,提供缓冲环境)主要成分是50 mmol/L 葡萄糖,25 mM/L Tris-HCl ,10 mM/L EDTA,pH8.0
主要作用:悬浮菌体葡萄糖增稠,使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到离心管的底
部;EDTA抑制DNase的活性,
2. Buffer P2(氢氧化钠和SDS裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔,释放细胞内的质粒)
主要成分是0.2mol/L 的NaOH ,1% SDS 主要作用是破坏细胞壁和细胞膜,使细胞的内容物释放其中NaOH 主要是为了溶解细胞,释放DNA ,因为在强碱性的情况下,细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。

SDS与NaOH联用,其目的是为了增强NaOH 的强碱性,同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。

注意事项:第一,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因
组DNA片断也会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组
DNA会断裂。

破细胞的主要是碱,而不是SDS,所以称为碱法抽提。

3. Buffer P3 (中和氢氧化钠、SDS中的钠被钾替换,吸附菌体产生沉淀)
主要成分是3mol/L的醋酸钾,2mol/L醋酸,75%酒精
主要作用是沉淀蛋白和中和反应
其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS,
因为十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate,SDS)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 (potassium dodecylsulfate, PDS),而
PDS是不溶水的,同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。

2 mol/L的醋酸是为了中和NaOH。

基因组DNA 一旦发生断裂,只要是50〜100 kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了,所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条较亮的总DNA条带。

75%酒精主要是为了清洗盐分和抑制
DNase;同时Buffer P3的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上
3. Buffer DW1
主要成分为去蛋白液,可以进一步降低蛋白残留量
4. Wash Solution
主要成分为80%的乙醇
主要是起到洗涤的作用,使质粒DNA纯化和沉淀
5. Eluti on Buffer
主要成分是pH=8.0的TE缓冲液
主要作用是最后把DNA从柱子上洗脱下来
四.实验器材
San Prep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒:生工生物工程(上海)
股份有限公司
小型高速离心机,1.5ml离心管,无水乙醇等
五.实验步骤
菌体收集—裂解—上柱—洗涤—洗脱
1. 准备工作
检查Buffer P1中是否已加入RNase A (储存于2-8 C,有效期为6个月)
检查Wash Solution 中是否已经加入乙醇(乙醇终浓度为80%,
室温密封保存)
检查Buffer P2和P3中是否出现沉淀(如有沉淀,于37C溶解沉淀,待冷却至室温后使用)
2•取4ml过夜培养(37 C摇床振荡培养14h)的E1-PUC18菌液(分装于4个1.5ml的EP管中)12000%离心10分钟收集菌体,弃尽培养基
3•在沉淀中加入250卩Buffer P1,彻底悬浮菌体
4加入250卩Buffer P2 ,立即温和颠倒离心管10次(两手来回颠倒),然后室温静置 4 分钟(开盖后有拉丝的现象,说明效果较好)
5加入350卩Buffer P3,立即温和颠倒离心管5次混匀(将离心管在试管架上翻转过来左右摇晃5 次)
6.12000 %离心10分钟,将上清液移入吸附柱(只能装750 口,1应多次离心),9000%离心30秒,倒掉收集管中液体
7. (选做)加入500卩Buffer DW1,9000 孕离心30秒,倒掉收集管中液体
8. 加入500卩IWash Solution , 9000为离心30秒,倒掉收集管中液体
9. 重复步骤8 一次
10. 空吸附柱于9000沟离心1分钟
11. 将吸附柱放入一个干净的1.5ml 离心管中,在吸附膜中央加入65卩l ElutionBuffer (60C预热),室温静置一分钟后,离心1分
钟,保存管中DNA溶液(-20C)
六.结果分析与讨论
琼脂糖凝胶电泳结果显示质粒浓度偏小,未有明显条带。

原因可能有
1•菌液浓度太低
2. 质粒提取操作某些细节可能存在问题。