致病基因的定位与克隆(上)

基因工程试题及答案1.标记（探针）（已知一个克隆在质粒载体上的500bpDNA 外源片段，请设计并用3种标记方法方案来对这个外源片段进行标记。

带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。

使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。

1）切口平移标记: 控制DNaseI的浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3-OH 末端（这条链即成为引物）。

DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nick translation)2）随机引物标记: 能与任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。

DNA聚合酶klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。

3) PCR标记: 针对目的片段，设计好引物，以标记号的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针4）末端核苷酸转移法:P32和多核苷酸激酶在5’端标记DNA或RNA。

先用碱性磷酸酶处理去除DNA 5’的磷酸基团，多核苷酸激酶用于对缺乏5'-磷酸的DNA 或合成接头进行磷酸化,同时可对末端进行标记。

补充：1）常用的标记物包括：P32的同位素标记；荧光探针标记的dNTP；生物素；地高辛2）应用：定性（是否转入该基因）；定量（含量的高低）；定位；成分（配对的程度、是否同源）2.PCR技术（试述PCR技术的基本原理，如果想通过PCR技术从一个生物基因组中扩增一个约500bp的基因片段，再和载体连接克隆，然后转入大肠杆菌中，请描述其克隆过程（包括检测）。

）（1）PCR的概念：又称为聚合酶链反应,能在体外特异快速扩增DNA片段。

组成：DNA单链模板、引物和DNA聚合酶（包括缓冲液）（2）PCR技术的原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

1、转录（Transcription）：以某一DNA链为模板，按照碱基互补原则形成一条新的RNA链的过程，是基因表达的第一步。

2、编码链：与mRNA 有相同序列的DNA 链3、下游：沿着表达方向的序列。

例如，编码区是在起始区的下游。

4、上游：转录起点之前的序列，例如，细菌启动子在转录单位的上游，起始密码在编码区上游。

5、启动子：结合RNA 聚合酶并起始转录的DNA 区域。

6、RNA聚合酶：使用DNA作为模板合成RNA的酶(正式应为DNA-依赖性RNA 聚合酶)7、终止子：是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。

DNA分子中终止转录的核苷酸序列。

8、转录单位：指RNA聚合酶起始位点和终止位点间的距离，可能包括不止一个基因。

9、初级转录本：与一个转录单位相对应的未修饰的RNA 产物。

10、组成型表达constitutive expression：个体发育的任一阶段，在所有细胞中都持续进行的表达。

一般是生命过程必需的基因。

11、负调控：在没有任何调节蛋白或其失活的情况下，基因表达；存在repressor的时候基因表达受阻。

12、正调控：在没有任何调节蛋白或其失活的情况下，基因关闭；存在activator的时候基因表达开启。

一般原核生物偏向负调控，原核生物的DNA裸露无保护，很容易启动转录，并翻译。

因此其细胞内的基因可以说是基本全部默认开启，因此在正常情况下原核细胞内存在大量不同的reressor阻遏着大量基因的转录。

细胞必须根据不同的条件，对一些被阻遏的基因进行去阻遏的调控，或对一些基因的表达进行阻止。

13、顺式作用元件cis-acting element DNA分子上的一些与基因转录调控相关的特定序列。

14、反式作用因子trans-acting factor一些与基因表达调控有关的蛋白因子。

15、顺式调控cis-acting regulation 一段非编码DNA序列对基因转录的调控作用，顺式正调控（启动子、增强子）；顺式负调控（沉默子）16、反式调控trans-acting regulation 转录因子作用于顺式作用元件对基因转录的调控。

图位基因克隆在生命科学的广袤领域中，图位基因克隆技术宛如一颗璀璨的明星，为我们揭示基因的奥秘、理解生命的密码提供了强大的工具。

它是一项复杂而精妙的技术，涉及众多学科的知识和技术手段，让我们一同走进这个神奇的世界，探寻图位基因克隆的奥秘。

要理解图位基因克隆，首先得明白基因在染色体上的位置并非随机分布，而是有着特定的规律和秩序。

而图位基因克隆就是基于这种位置信息来定位和分离目标基因的方法。

想象一下，染色体就像是一条长长的道路，基因则是这条道路上的一个个站点。

我们要找到特定的那个“站点”——目标基因，就需要有一张详细准确的“地图”。

这张“地图”就是遗传图谱和物理图谱。

遗传图谱是通过分析不同基因之间的遗传连锁关系构建而成，它就像是给我们指明了各个“站点”之间的相对距离和大致方向。

物理图谱则更加精确，它能告诉我们基因在染色体上的具体位置和实际距离。

有了这两张“地图”，我们就可以开始寻找目标基因的征程了。

首先，我们需要找到与目标基因紧密连锁的分子标记。

这些分子标记就像是道路上的路标，能帮助我们逐渐靠近目标基因。

通过对大量的个体进行基因分析和遗传标记检测，我们可以确定这些标记与目标基因之间的距离和位置关系。

接下来，就是通过染色体步移或者染色体跳跃等技术，逐步缩小目标基因所在的区域。

这就好比我们沿着道路一步步前进，不断接近我们的目的地。

在这个过程中，需要进行大量的实验和数据分析，每一步都需要严谨细致，容不得半点马虎。

当目标基因所在的区域被缩小到一定程度后，就可以利用基因文库筛选或者 DNA 测序等技术来确定目标基因的具体序列。

基因文库就像是一个装满了基因片段的宝库，我们要在其中找到我们所需要的那一片“拼图”。

而 DNA 测序则能让我们直接读取基因的“密码”，最终确定目标基因的身份。

图位基因克隆技术在农业、医学等领域都有着广泛的应用。

在农业方面，它可以帮助我们培育出更加优良的作物品种。

比如，通过克隆与抗病虫害相关的基因，我们可以让农作物拥有更强的抵御病虫害的能力，从而减少农药的使用，提高农产品的产量和质量。

染色质（chromatin）是由DNA、RNA、蛋白质等组成的复合物，是核基因的载体，在真核细胞间期呈伸展状态。

染色体（chromosome ）细胞在有丝分裂或减数分裂过程中，由染色质凝缩而成的棒状结构。

常染色质(euchromatin)：细胞间期核内纤维折叠盘曲程度小，分散度大，染色较浅且具有转录活性的染色质。

异染色质(heterochromatin)：细胞间期核内纤维折叠盘曲紧密，呈凝集状态，染色较深且很少有转录活性的染色质。

由于雌性细胞中的两条X染色体中的一条发生异固缩，失去转录活性，这保证了雌雄两性细胞中都只有一条X染色体保持转录活性，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上，这种效应称为X染色体的剂量补偿(dosage compensation)。

基因(Gene）：遗传的基本单位，含有编码一种RNA，大多数情况是编码一种多肽的信息单位；负载特定遗传信息的DNA片段，其结构包括由DNA编码序列、非编码调节序列和内含子组成的DNA区域。

微卫星DNA（Microsatellite）、STR（Short Tandem Repeat）、DNA指纹是由2—6bp重复单位构成核心序列，也称短串联重复序列(STR)，是一种广泛分布在人类基因组中的DNA片段，主要由核心序列拷贝数目的变化产生长度多态性，其在人群中存在个体间的高度变化，是DNA指纹的形成基础。

指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性,在群体中的发生频率不小于1 %，就称为单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）。

外显子（exon）内含子（intron）突变(mutation)：遗传物质所发生的可被检测和可遗传的改变；通常对机体有害。

广义：包括染色体和DNA的改变；狭义：指基因组DNA分子的碱基组成或其顺序的改变。

转换（transition）颠换（transversion）错义突变（missense mutation）同义突变（same sense mutation）无义突变（nonsense mutation）动态突变（Dynamic Mutation）人类基因组中的短串联重复序列，尤其是基因编码区或侧翼序列的三核苷酸重复，在一代代传递过程中重复次数发生明显增加，从而导致基因功能改变而产生疾病。

植物基因定位和基因功能分析的方法研究随着现代生物学和遗传学的发展，人们对植物基因定位和基因功能分析的方法进行了深入研究，这不仅可以帮助人们更好地理解植物发育和生长的机理，还能为植物育种和生产提供有用的信息和工具。

本文将重点介绍当前主要的植物基因定位和基因功能分析方法。

一、植物基因定位方法1.遗传连锁图谱遗传连锁图谱是一种利用遗传标记来分析不同基因之间遗传联系的方法。

通过对多个遗传标记在植物基因组中的位置进行测定和分析，可以建立起一张遗传图谱，用于揭示不同基因之间的距离和相对位置。

这种方法通常使用分子标记进行，如限制性片段长度多态性（RFLP）、简单重复序列（SSR）、随机扩增多态性（RAPD）等等。

2.基因组关联分析基因组关联分析是一种利用大规模基因组数据来解析复杂性状遗传基础的方法。

这种方法可以在典型生境群体中寻找有影响的变异位点，并确定它们与复杂性状之间的关系。

这种方法使用的主要技术是基因芯片和全基因组二代测序等高通量技术。

3.定位克隆定位克隆是一种在表型、遗传连锁图谱和基因组关联分析的基础上，利用分子遗传学的技术从候选区域中精确定位基因的方法。

这种方法最初是通过描述多态性突变体的表型特征并与别的单基因遗传性神经病的解决方案进行议会比较，通过遗传性状继承模式的推断、基因组DNA库筛选和分子标记标示等技术逐渐细化到定位至遗传连锁图谱中的一个小区域或物理图谱上的一小段碎片。

目前随着技术不断升级，整个过程已经极度自动化，能够对基因进行深准碎片定位和氨基酸序列注释，进一步明确植物基因的功能和作用机制。

二、基因功能分析方法1.反相留出反向遗传（反相留出）是一种采用RNA干扰技术降低或抑制嘌呤和非嘌呤物种基因表达的途径。

这种技术利用RNAi的调控机制，特异性破坏mRNA分子，并通过RNA的剪切或配对等方式，实现对靶基因的抑制。

这种技术能够有效地研究基因在发育、生长、代谢等过程中的功能，并探究不同基因之间的互相作用。

1先天性代谢缺陷( inborn errors of metabolism) 也称遗传性酶病，指由于遗传上的原因(通常是基因突变)而造成的酶蛋白质分子结构或数量的异常所引起的疾病。

根据酶缺陷对机体代谢的影响不同，将先天性代谢缺陷分为糖代谢缺陷、氨基酸代谢缺陷、脂类代谢缺陷、核酸代谢缺陷、内分泌代谢缺陷、溶酶体沉积病、药物代谢缺陷和维生素代谢缺陷等。

2遗传异质性( genetic heterogeneity)-种遗传性状可以由多个不同的基因控制//某一种遗传疾病或表型可以由不同的等位基因或者基因座突变所引起的现象。

与之相对反的是基因多效性，是由某一个基因突变引显的神疾有或表型。

速传异质性分为等位基因异质性和基因座异质性。

基因座异质性病是由不同基因座的基因突变引起的；等位基因异质性是指某一遗传病是由同一基因座上的不同突变引起的.遗传印记( genetic imprinting)一基因组印记(genomicimprinting)是一种DNA甲基化介导的表观遗传调节形式，是指两个亲本等位基因的差异性甲基化造成了一个亲本等位基因的沉默,另一个亲本等位基因保持单等位基因活性( monoallelice activity)。

是生殖细胞系的一种表观遗传修饰，与DNA甲基化调节作用有关。

这种修饰有一整套分布于染色体不同部位的印记中心来协调。

基因组特定区域有成簇排列的富含CpG岛的基因表达调控元件动态突变( dynamic mutation)：串联重复的三核苷酸的重复次数可随着世代交替的传递而呈现逐代递增的累加突变效应，称为动态突变。

（1）延迟显性(delayeddomi-nance )：一些带有显性致病基因的杂合子(Aa)在生命的早期，因致病基因并不表达或表达不足没有引起明显的临床表现，只有达到一定的年龄后才表现出相应的疾病临床症状，称为延迟显性（2）外显率( penetrance)是在一定环境条件下，群体中某一基因型个体表现出相应表型的百分率，外显率等于100%时称为完全外显，低于100%时则为不完全外显或外显不全。

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。

与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。

从最初第一代以San ger测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005年，以lllumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing NGS)的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。

其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。

2009年3月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Scienee〉杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。

同年，《Nature》发表了采用NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3致病基因突变和《Nat Gene》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。

此后，通过NGS技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS技术已成为里程碑式的进步。

2010年，《Scienee》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。

近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。

同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。

目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。

本文介绍了几种DNA水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。