ALT和AST测定方法
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一、实验目的1. 了解转氨酶在生物体内的重要作用及其在临床诊断中的意义。
2. 学习转氨酶活性测定的原理和方法。
3. 掌握分光光度法在测定转氨酶活性中的应用。
二、实验原理转氨酶是一类催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的酶,广泛存在于生物体内。
其中,谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是两种常见的转氨酶。
当肝细胞受损时,ALT和AST会释放到血液中,导致血液中这两种酶的活性升高。
因此,测定血液中ALT和AST的活性可以反映肝脏的功能状况。
本实验采用分光光度法测定血液中ALT的活性。
在实验中,ALT催化丙氨酸与α-酮戊二酸反应生成丙酮酸和谷氨酸,丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙,丙酮酸2,4-二硝基苯腙在碱性溶液中呈棕红色,通过测定其吸光度可以计算出ALT的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:新鲜动物肝脏、血清、丙氨酸、α-酮戊二酸、2,4-二硝基苯肼、磷酸盐缓冲液、NaOH、蒸馏水等。
2. 实验仪器:分光光度计、恒温水浴锅、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 准备工作:将新鲜动物肝脏和血清分别置于冰浴中,制备肝匀浆和血清样品。
2. 样品处理:将肝匀浆和血清样品按照一定比例加入反应体系中,加入丙氨酸、α-酮戊二酸和磷酸盐缓冲液,混匀后置于恒温水浴锅中反应。
3. 测定吸光度:在反应结束后,取出反应体系,加入2,4-二硝基苯肼和NaOH,混匀后立即在分光光度计上测定吸光度。
4. 标准曲线绘制:以丙酮酸浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
5. 计算ALT活性:根据样品的吸光度,从标准曲线上查出对应的丙酮酸浓度,再根据公式计算ALT活性。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制:绘制标准曲线后,发现线性关系良好,相关系数R²>0.99。
2. 样品处理:实验过程中,肝匀浆和血清样品均未出现明显的分层现象,说明样品处理得当。
3. 吸光度测定:实验过程中,分光光度计的吸光度读数稳定,说明仪器性能良好。
ALT和AST测定方法ALT(Alanine Aminotransferase)和AST(Aspartate Aminotransferase)是两种常用的生物化学指标,用于评估肝脏功能和肝细胞损伤程度。
本文将详细介绍ALT和AST的测定方法。
一、ALT的测定方法1.酶动力学法:该方法是最常用的ALT测定方法。
原理是将肝脏组织或血浆样品与丙酮酸转氨酶(LDH)反应,通过测定产生的谷草转氨酶(AST)的酶活力来反映样品中ALT的含量。
该方法准确可靠,具有较高的灵敏度和特异性。
2.免疫测定法:ALT测定的另一种常用方法是免疫测定法,包括免疫比浊法、免疫荧光法和免疫酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
这些方法利用ALT特异性抗原和抗体的结合反应来测定ALT的浓度,具有高灵敏度和高特异性。
二、AST的测定方法1.酶动力学法:AST的测定方法类似于ALT的测定方法,也是通过与丙酮酸转氨酶(LDH)反应来测定AST的酶活力。
该方法较为简单快速,适用于大量样本的测定,但其灵敏度和特异性相对较低。
2.免疫测定法:AST的免疫测定法与ALT的免疫测定法类似,包括免疫比浊法、免疫荧光法和免疫酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
这些方法通过AST特异性抗原和抗体的结合反应来测定AST的浓度,具有高灵敏度和高特异性。
三、ALT和AST测定的注意事项1.样本的采集:ALT和AST的测定常用的样本是血浆或血清。
在采集样本时,应避免血液污染或其他杂质的干扰,以保证测定结果的准确性。
2.技术操作:在进行ALT和AST的测定过程中,需要严格遵守相关实验操作规范,确保实验条件的一致性和稳定性。
包括标本处理、试剂配制、反应时间和温度的控制等。
3.器材和试剂的选择:选择合适的测定仪器和试剂是保证测定结果准确性和重复性的重要因素。
一般情况下,空白对照组和阳性对照组的选取是测定中的重点之一4.数据解读:在进行ALT和AST的测定后,需要对测定结果进行合理的解读和分析。
生化实验报告血清转氨酶实验背景转氨酶(transaminase)是一类存在于细胞中的酶,主要存在于肝脏、心脏、骨骼肌等组织中。
转氨酶在氨基酸代谢中起着重要的作用,能够催化氨基酸之间的氨基基团转移。
转氨酶主要包括天冬氨酸氨基转移酶(AST,aspartate aminotransferase)和丙氨酸氨基转移酶(ALT,alanine aminotransferase),它们的活性在体内存在着一定的平衡。
血清转氨酶的检测可以用于评估肝功能,尤其是肝细胞受损程度。
因此,本次实验旨在通过检测血清中AST和ALT的活性,了解肝功能的情况。
实验材料与方法材料- 血清样品(待检测)- Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)- 天冬氨酸(AST底物)- 丙氨酸(ALT底物)- NADH(辅酶)- α-酮戊二酸(酶促进剂)方法1. 取一支离心管,标明为“AST底物”,加入5ml Tris-HCl缓冲液(pH 7.4);2. 加入2ml 10mM天冬氨酸溶液,并充分混合均匀,形成AST底物溶液;3. 取一支离心管,标明为“ALT底物”,加入5ml Tris-HCl缓冲液(pH 7.4);4. 加入2ml 10mM丙氨酸溶液,并充分混合均匀,形成ALT底物溶液;5. 取出待检测的血清样品,用离心机离心5分钟,得到血清;6. 取两个比色管,标明为“AST样品”和“ALT样品”,分别加入待检测的血清样品;7. 在AST样品管中,加入0.1ml AST底物溶液,并充分混合;8. 在ALT样品管中,加入0.1ml ALT底物溶液,并充分混合;9. 将AST样品管和ALT样品管分别放入37C水浴中孵育30分钟;10. 在AST样品管中,加入0.1ml NADH溶液,并充分混合;11. 在ALT样品管中,加入0.1ml NADH溶液,并充分混合;12. 同时开始计时,并记录每分钟NADH吸光度的变化;13. 通过计算AST和ALT的活性,得到相应的结果。
图3AsT线性范围预实验图4ALT线性范围预实验从图3和图4可见,稀释点和测定值间的关系为抛物曲线,在第一个稀释点到第四稀释点之间,曲线近似上升的直线,第五点达到曲线的最高点,从第五点开始,曲线呈下降趋势。
可以推断AsT、ALT(37℃)s0P线性范围大致在O一300u几之问。
AsT、ALT(37℃)SOP线性确证实验分别使用第二组稀释样本,相应的测定原始结果分别见表18、表19。
按照NccLsEP一6中的数据处理方法”1,将每个标本(X1到x4)四次测定的结果排列在Y卜Y4,进行离群点检查。
AsT、ALT(37℃)s0P离群点检查结果分别见表20、表21。
AST、ALT(37℃)SOP线性确证理论稀释值一测定值图分别见图5、图6。
图5AST线性确证实验表20AST离群点检查结果41表19ALT线性确证实验原始数据样品号理论稀释值———————————————壅型堕』坐旦L——=—_—————.=i_(u/L)第一次第二次第三次第四次爿0751502253000.38O.190.190.00O.1976.2375.9875.5675.2075.74151.00150.96150.59150.23150.76225.36225.23224.28224.98224.96300.06299.85298.98298.68299.39图6ALT线性确证实验表21ALT离群点检查结果界限值P。
;=0.765,P。
=O.88943。
ALT,AST测定⽅法3.8.2.1⼩⿏肝、肾、⼼组织ALT含量测定1实验原理⾕丙转氨酶作⽤于由丙氨酸及α-酮戊⼆酸组成的基质,在⼀定的反应条件下,产⽣⼀定量的丙酮酸。
在酶反应到规定时间时,加⼊2,4-⼆硝基苯肼,在当量浓度的酸性条件下,终⽌了酶反应。
2,4-⼆硝基苯肼分别与反应产⽣的丙酮酸及剩余的基质α-酮戊⼆酸形成各⾃对应的2,4-⼆硝基苯腙。
在碱性条件下,虽然⼆种苯腙分别显出红棕⾊,但由于丙酮酸⽣成的颜⾊较深,以同等克分⼦计算,在480-530nm波长范围内其浓度约为α-酮戊⼆酸⽣成的颜⾊的3倍,利⽤这⼀差别可以反映出丙酮酸的⽣成量。
本实验设⾕草转氨酶活⼒为:样品液与ALT 基质液在37℃下反应60min时每⽣成1µmol丙酮酸所需的酶量为1个活⼒单位(U)。
2试剂配制(1)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)称取NaH2PO4.2H2O 2.96495g,Na2HPO4.12H2O 29.0142g,溶解于蒸馏⽔中,定容到1000mL。
(2)20µmol/L丙酮酸钠标准溶液称取22mg丙酮酸钠,溶解于0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)100mL中。
现配现⽤。
(3)ALT基质液称取α-酮戊⼆酸29.2mg,DL-丙氨酸1.78mg(L-丙氨酸0.85mg)溶解于30mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)中,溶解后校正pH⾄7.4,再⽤pH7.4的磷酸缓冲液定容⾄100mL,置冰箱中保存备⽤(可保存⼀周)。
可加⼊氯仿数滴防腐。
(4)0.02% 2,4—⼆硝基苯肼溶液称取20mg2,4—⼆硝基苯肼先溶解于10 mL纯盐酸中,电炉加热助溶,待2,4—⼆硝基苯肼全部溶解后,⽤蒸馏⽔稀释⾄100mL,过滤后盛于棕⾊中,置冰箱中保存备⽤。
(5)1mol/L NaOH溶液:称取4g NaOH溶解于蒸馏⽔后,定容到100mL。
(6)0.4 mol/L NaOH溶液称取16 g NaOH溶解于蒸馏⽔后,定容到1000mL。
双项目同测法测定ALT和AST
钟方财;蒋维国;李顺康
【期刊名称】《川北医学院学报》
【年(卷),期】2003(018)004
【摘要】目的探讨双项目同测法与单项目测定法测定ALT和AST结果的差异.方法分别使用双项目同测法和单项目测定法测定定值血清和30例样本ALT和AST 含量,并将定值质控血清分别做日内、日间精密度测定.结果两方法测定结果相关性良好,γ=0.999,检测结果差异无显著性(P>0.05),ALT和AST日内变异分别为
2.63%、2.47%,日间变异分别为
3.84%、3.77%.结论双项目同测法可以节约仪器通道,提高工作效率,节约资源,有一定推广应用价值.
【总页数】3页(P94-96)
【作者】钟方财;蒋维国;李顺康
【作者单位】内江市第一人民医院检验科,四川,内江,641000;内江市第一人民医院检验科,四川,内江,641000;内江市第一人民医院检验科,四川,内江,641000
【正文语种】中文
【中图分类】R446.1
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ALTAST测定方法ALT(Alanine Aminotransferase)和AST(Aspartate Aminotransferase)是评估肝功能的常用酶学指标。
它们通常通过血液样本进行检测。
在本文中,我们将介绍ALT和AST的测定方法、应用以及血液样本的预处理。
首先,ALT和AST的测定方法主要是基于酶促反应原理。
当ALT和AST存在于细胞内时,它们通常以较低的浓度存在。
在细胞损伤或炎症发生时,细胞膜破裂,导致ALT和AST释放到血液中,使其浓度升高。
因此,通过测定血液中ALT和AST的浓度,可以评估肝脏的炎症程度和损伤程度。
目前,常用的ALT和AST测定方法主要有两种:荧光法和颜色反应法。
荧光法是利用荧光探针,例如NADH(尼克酸腺嘌呤二核苷酸还原型)或NADPH(尼克酸腺嘌呤二磷酸盐还原型),与ALT和AST进行反应,生成发射荧光信号。
该方法的优势是灵敏度高、特异性好,可以测定低浓度的ALT和AST。
颜色反应法是利用一些物质与ALT和AST进行反应后,形成可见光吸收的化合物。
这些化合物的光密度和ALT和AST的浓度成正比,可以通过比色法或分光光度法来测定。
在血液样本测定ALT和AST之前,还需要进行一些预处理步骤。
首先,采集血液样本时要注意避免氧化和污染。
其次,血液样本需要离心分离血清或血浆。
一般来说,血清是指凝结后,离心除去凝块,得到的液体部分;而血浆是指在血液凝结前,通过添加抗凝剂,离心除去细胞和凝块,得到的液体部分。
这是因为ALT和AST主要存在于细胞内,测定它们的浓度需要去除细胞成分的干扰。
因此,选择适当的分离方法非常重要。
最后,ALT和AST的应用非常广泛。
它们不仅用于评估肝脏疾病,还用于监测药物治疗的副作用,例如肝毒性。
此外,一些非肝脏疾病,如心肌梗死、肌肉炎等,也会导致ALT和AST的升高。
因此,ALT和AST的测定可以提供有关这些疾病的重要信息。
总结起来,ALT和AST的测定方法主要是基于酶促反应原理。
ALTAST测定方法ALT和AST是两种常用的肝功能指标,用于评估肝脏疾病和损伤程度。
本文将介绍ALT和AST的测定方法。
一、ALT(丙氨酸氨基转移酶)的测定方法:ALT是一种肝细胞特异性酶,主要存在于肝细胞的胞浆中。
当肝细胞受损或破坏时,ALT会释放入血液中,因此血液中ALT水平的升高通常与肝脏疾病相关。
ALT的测定方法一般采用酶动力学法或颜色反应法。
1.酶动力学法:这种方法是通过衡量ALT催化丙酮酸和谷氨酸互相转化的速率来测定ALT的活性。
这种方法的原理是ALT催化丙酮酸和谷氨酸生成谷草转氨酶和谷氧化酶,同时反应中NADH的消耗会导致光学密度的变化。
通过测量这种变化可以确定ALT的活性水平。
2.颜色反应法:颜色反应法是用于测定ALT浓度的常用方法,它基于谷氨酸和丙酮酸在特定条件下与ALT催化生成谷草转氨酶和谷氧化酶的反应。
这种方法通常使用的试剂盒包含了特定的底物和酶,当ALT存在时,底物与其催化生成产物,产物的浓度可以通过光度计测量。
二、AST(天冬氨酸氨基转移酶)的测定方法:AST也是一种肝脏酶,但它不仅存在于肝细胞中,还存在于心肌、肌肉、肾脏和红细胞等组织中。
因此AST的升高并不一定代表肝脏疾病,也可能与其他组织的损伤有关。
AST的测定方法与ALT类似,也有酶动力学法和颜色反应法两种常见方法。
1.酶动力学法:该方法是通过测量AST催化天冬氨酸和α-酮戊二酸互相转化的速率来测定AST的活性。
反应中,NADH或NADPH的消耗导致光学密度的变化,可以用于测量AST的活性水平。
2.颜色反应法:AST的颜色反应法原理与ALT的相似,使用特定的底物和酶,当AST存在时,底物与其催化生成产物,产物的浓度可以通过光度计测量。
这些方法虽然有一定的差异,但一般都基于底物与酶的反应原理,通过测量底物与产物的光学密度变化或者测量酶活性来确定血液中ALT和AST的水平。
综上所述,ALT和AST的测定方法主要有酶动力学法和颜色反应法两种。
丙氨酸氨基转移酶检测方法丙氨酸氨基转移酶(ALT)是一种重要的肝脏酶,也是一种常见的生化指标。
检测方法通常用于判断肝脏功能的健康程度和疾病的演变趋势。
下面,我们将对丙氨酸氨基转移酶检测方法进行详细的阐述。
一、常规检测方法常规检测方法是指采用血清学方法检测ALT水平。
具体步骤如下:1.患者空腹4~8小时。
2.采集3~5ml静脉血标本,禁止吸烟和饮酒。
3.将血样放于离心管中,进行离心处理,得到血清样本。
4.通过检测仪器检测血清ALT酶的含量。
二、生物传感器检测方法生物传感器检测方法可以检测非常低的ALT水平,可以提供更加精确的测试结果。
具体步骤如下:1.准备含有具有高选择性的生物传感器的电极。
2.采集患者的静脉血标本。
3.将血样与生物传感器电极接触并依据特定的工艺条件进行分析。
4.通过仪器获得ALT的浓度明确的结果。
三、免疫学方法免疫学方法采用免疫学技术分析ALT特定抗体的含量。
具体步骤如下:1.准备特定的抗ALT抗体试剂。
2.采集患者的静脉血标本。
3.加入抗ALT抗体图谱,进行特异性反应,每个抗原对应一个抗体。
4.使用适当的试剂盒,对空白对照样品和样品进行ELISA测定。
5.通过光学振荡仪读取ALT特定抗体的含量并获得浓度明确的结果。
综上所述,以上列出的三种方法都是常用的丙氨酸氨基转移酶检测方法。
针对不同的病情和检测需求选择不同的检测方法非常重要。
总之,如果您的ALT测试结果不正常,医生会建议您进一步进行了解。
您可以向医生咨询,了解其他可能涉及的测试方法和预防方法。
谷丙转氨酶测定方法一、赖式比色法赖氏法并没有自己的酶活为单位定义。
作者以当时卡门氏的速率法为准,测得多份不同ALT活力血清的ALT卡门氏单位。
然后在赖氏比色法条件下,测得各份血清反应显色的吸光收值。
将每份血清的卡门氏单位和对应比色法吸光值在坐标纸上作图。
经过大量实验,对所有实验点以最佳曲线拟合,形成了比色法在某指定比色计上的标准曲线。
坐标横轴为卡门氏单位,纵轴为吸光值,比色法结果和卡门氏速率法结果一致。
继后作者以底物溶液及丙酮酸标准溶液,按照酶反应实际情况配制成不同浓度的丙酮酸标准溶液系列与2.4二硝基苯肼显色,并与速率法的结果比较。
经多年反复实验,最后作者正式报告可通用于各种比色计的结果为ALT28卡门单位的鼍清在比色法条件下产生相当于0.1μmol丙酮酸,ALT57卡门单位的血清产生相当于0.2μmol丙酮酸,ALT97卡门单位? 的血清产生相当于0.3μmol丙酮酸。
这样就使赖氏法标准曲,线上丙酮酸量和对应卡门单位确定下来。
1970年将曲线延伸至150卡门单位。
赖氏法报告的结果与速率法结果一致。
没有条件采用速率法的实验室可以采用此法。
(一)赖氏比色法测定血清ALT1、试剂(1)Imol/L磷酸氢二钠:称取磷酸氢二钠(含两个结晶水)17.6g溶解于水中,并加水至1000ml,冰箱内保存。
(2)0.1mol/L磷酸二氢钾溶液:称取磷酸二氢钾13.6g溶解于水中,加水至1000ml,冰箱内保存。
(3) 0.1mol/l磷酸缓冲液(pH7.4):将420ml 0.1ml/L磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol/L磷酸二氢钾溶液混匀,置冰箱内保存。
(4)底物缓冲液(DL—丙氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2m—mol/L):精确称取1.79g DL-丙氨酸和29.2mgα-酮戊二酸,先溶于约50ml 0.1mol/L磷酸缓冲液中,用lmol/L氢氧化钠(约0.5m1)调到pH7.4,再加磷酸缓冲液至100ml,置冰箱保存,可稳定两周。
alt ast指标ALT和AST指标是人体体内的两种生化成分,它们被称为肝酶,通常被用于检测人体肝功能的健康状况。
ALT和AST指标被广泛用于诊断和监控疾病,包括肝脏炎症、肝炎、动脉粥样硬化、心肌梗死等,本文将围绕这两种指标进行详细阐述。
【Part 1】理解ALT和AST指标ALT和AST均为肝酶,ALT通常被称作丙氨酸氨基转移酶,而AST 则被称作天门冬氨酸转移酶。
这两种酶对人体健康有着重要的作用,它们能够帮助肝脏处理和代谢蛋白质、脂肪和碳水化合物等,同时也能帮助肝脏消化和代谢一些药物。
【Part 2】原因及其影响肝脏健康不良会导致ALT和AST水平升高,这通常表明肝脏细胞受到了破坏。
肝细胞的损伤能够引起ALT和AST水平升高的原因很多,例如肝炎、肝硬化、过度饮酒、药物过量、心脏病等。
当ALT和AST水平升高时,通常会给医生一个信号,告诉医生勘测病因是否与肝脏有关。
肝脏损伤可以被非常轻松地发现,由于肝脏是一种重要的生化工厂,这也就意味着它是病毒和毒素的一个目标。
【Part 3】如何进行检测?检测血清ALT和AST的方法非常简单,它们是病发胆囊疾病或肝脏疾病的有效手段。
通过检测血液中的ALT和AST水平,就能够发现肝脏是否受到了损伤或疾病的侵袭。
在进行检查之前,需要先停止服用任何药物,否则这些药物也会影响检查结果。
处理步骤如下:1.医生会要求病人到医院或美妙诊所给外周静脉或手指等部位进行采血;2.在病人手臂上用乙醇清洁正确位置以避免细菌感染,这样做的目的是增加采血的准确性;3.医生在采血前会讲解流程,态度亲和,以便病人能够放松心情;4.采血完成后,将血样送到实验室进行检查;5.实验室通常会在24小时内提供结果,医生会根据病人的具体情况,判断是否肝脏疾病,从而诊断及治疗。
【Part 4】如何降低ALT和AST值?一旦检测出ALT和AST值已经升高,医生会通过诱导治疗和减少药物剂量来治疗病症。
此外,饮食也非常重要,病人应该避免摄入过多的脂肪和糖类食物,同时多吃富含维生素、蛋白质的食物如鱼类、鸡肉等,这样有利于身体恢复健康并降低ALT和AST值。
ast测定方法范文AST(Aspartate Aminotransferase)是一种在体内广泛存在的酶,主要存在于肝脏、心肌、肌肉和肾脏中等处。
AST测定是临床上常用的一种检测方法,可以帮助诊断并监测许多疾病和损伤,特别是涉及到肝脏和心肌的疾病。
本文将对AST测定方法进行详细介绍。
AST测定方法主要分为以下几步骤:1.血液样本采集:AST测定通常需要采集静脉血液样本。
在采集样本前,需要准备好采集器具,如采血针、血管通路装置、试管等。
为了确保准确性,采集过程需要遵循无菌操作规范。
2.血清制备:采集的血液样本通常需要离心分离,分离出血清。
离心时间和速度可以根据具体实验要求进行调整。
制备的血清样本可以在一定的温度下保存,但最好在24小时内进行分析。
3.酶促反应测定:AST测定可以采用多种不同的方法,常用的包括光度法、电化学法和酶动力学法。
-光度法:光度法是通过测定反应物质与AST产生的光吸收变化,间接反映出AST浓度的一种方法。
常见的测定方法包括比色法和荧光法。
这些方法需要使用特定的试剂盒和仪器,并且遵循相应的试剂使用和操作指南。
-电化学法:电化学法需要使用电化学方法,通过测定电流和电势的变化,直接或间接测定AST的浓度。
常见的测定方法包括电化学阻抗法、电化学导纳法和电化学免疫传感器法等。
-酶动力学法:酶动力学法基于酶的底物与产物之间的化学反应速率与底物浓度的关系,通过测定酶底物和产物之间的化学反应速率,间接测定AST的浓度。
这种方法需要使用一定的底物和产物,并且需要在一定的温度和pH条件下进行反应。
4.数据分析与解释:AST测定完成后,可以得到一组数据,需要根据标准曲线或参考值范围进行数据分析与解释。
一般来说,AST的浓度与相应的疾病和损伤程度有一定的关联,如肝炎、肝硬化、心肌梗死等。
总结起来,AST测定是一种简单、快速、可靠的检测方法,可以帮助医生进行相关疾病的诊断和监测。
然而,需要注意的是,AST作为一种非特异性指标,测定结果可能受到其他因素的干扰,如肌肉损伤、药物使用等。
肝脏功能的测定方法和指标肝脏是人体最大的脏器之一,承担着许多重要的生理功能。
肝脏的血液循环、免疫排毒、代谢调节等功能对人体正常生理和病理平衡的维持至关重要。
不过,许多疾病、饮食和生活方式等因素都会影响肝脏功能的正常运作,因此在日常生活中,定期测定肝脏功能成为了预防和治疗一系列肝脏疾病的必要手段。
肝脏功能测定的指标常见有血清谷草转氨酶(AST)、血清谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)等。
血液中这些指标的变化可以反映肝脏功能的产生异常,有助于医生对肝脏病情的判断与治疗。
首先,血清谷草转氨酶(AST)和血清谷丙转氨酶(ALT)是肝功能常见指标。
它们两者都是常见的血清酶类蛋白,一般被称作转氨酶,其主要功能是参与氨基酸代谢。
肝脏受到损伤或疾病的时候,这些酶类蛋白会释放到血液中,从而血液内测得的AST、ALT值将出现不同程度的升高。
正常情况下,AST值为10-40IU/L,ALT为5-45IU/L。
当AST、ALT值大幅度升高时,会暗示着肝细胞受到严重损害,常见的如肝炎病毒、脂肪肝、酒精肝等疾病。
尤其是ALT,一旦出现增高,很大程度上与肝炎病毒感染有关。
因此在医学检查中,AST、ALT值的变化被视为判断肝脏健康的重要标准,有利于帮助医生确定病情并选择治疗方案。
其次,总胆红素(TBIL)和直接胆红素(DBIL)也是常见的肝功能指标。
胆红素在正常情况下是被肝脏排出体外的代谢产物。
当肝脏受到损害时,可能会出现无法正常排出胆红素的情况,从而胆红素水平就会升高。
TBIL是反映机体总体胆红素水平变化的信息,通常其水平不应超过21μmoI/L。
如果超标,很可能导致黄疸的出现,严重时还会使胆色素沉积在皮肤、眼睛等部位,形成显著的黄疸表现。
而DBIL则是胆红素当中能够直接与血浆蛋白结合的一部分,通常其水平不应超过7μmol/L。
正常情况下,DBIL的含量应该占总胆红素的20%。
在胆红素水平的测定方面,酶促法和直接法是两种常用的测定方法。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测(赖氏法)规程原理本法系依据丙氨酸氨基转移酶(Alaurine Transaminase 缩写为ALT)与由丙氨酸及α-酮戊二酸组成的底物缓冲液产生丙酮酸及谷氨酸。
丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙,在碱性溶液中显红棕色。
通过比色测定可以了解血浆中丙氨酸氨基转移酶的活力。
试剂(1)0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)准确称取磷酸氢二钠二水合物15.04g、磷酸二氢钾1.09g溶于实验用水中,补加实验用水至500ml。
然后用1mol/L HCl溶液或1mol/L NaOH溶液调整pH至7.4,密封保存。
(2)底物缓冲液(200mmol/L DL-丙氨酸;2mmol/Lα-酮戊二酸)精确称取DL-丙氨酸1.79g 和α-酮戊二酸29.2mg,用0.1mol/L磷酸盐缓冲液溶解并稀释至100ml,用1mol/L氢氧化钠(约0.5ml)调节pH值至7.4,密封保存。
(3)1mmol/L2,4-二硝基苯肼溶液称取2,4-二硝基苯肼19.8mg,用1mol/L浓度的盐酸溶液溶解,并稀释至100ml。
(4)0.4mol/L氢氧化钠溶液称取氢氧化钠16.0g,用实验用水溶解至1000ml。
(5)2mol/L氢氧化钠溶液称取氢氧化钠80g,用实验用水溶解至1000ml。
(6)2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠22.0mg,置于100ml称量瓶中,加0.05mol/L 的硫酸溶液溶解,然后移入100ml容量瓶中,再用0.05mol/L的硫酸溶液洗涤称量瓶三次,将洗涤液并入容量瓶中,补加0.05mol/L的硫酸溶液至容量瓶刻度,摇匀。
(7)1mmol/L丙酮酸标准液取2mmol/L丙酮酸标准液用0.05mol/L的硫酸溶液作1:1稀释测定法(1)试管法(单点定量)样品酶活力按下式计算样品酶活力(单位)=样品管吸光度值÷标准管吸光度值×标准的单位(2)试管法(标准曲线)试验前将除氢氧化钠外检测试剂预热至37℃后使用。
ALT检测操作规程ALT(丙氨酸氨基转移酶)是一种存在于细胞质中的酶,广泛分布于人体包括肝脏、心脏、肾脏等组织中。
ALT是肝脏功能的重要指标之一,通过测量血液中ALT的活性,可以评估肝脏功能的健康程度。
本文将介绍ALT(丙氨酸氨基转移酶)检测操作规程(速率法)。
一、实验器材和试剂准备1.乙醚:用于准备昏迷鼠模型;2.丙酮:用于制备丙酮胺溶液;3.氯化二乙酸:用于制备氯化二乙酰胺试剂;4.丙酮胺:用于制备丙酮胺溶液;5.磷酸氢二钾溶液:用于制备缓冲液;6.氧化丙酮胺:用于制备氧化丙酮胺试剂;7.pH7.0缓冲液:用于制备反应体系;8.4-氨基硫代洪美酸:用于停止反应;9.甲醛:用于制备甲醛溶液;10.维生素C溶液:用于制备维生素C溶液;11.肝组织磷酸化酰胺:用于制备肝组织提取液;12.酶提取液:用于提取ALT酶。
二、实验步骤1.制备ALT酶提取物:(1)取新鲜动物(小鼠)肝脏组织15g,加入磷酸缓冲液5倍的体积;(2)放入冷冻机中,-20℃下保存12h;(3)取出,加入万能匀浆器中,对肝脏组织进行研磨;(4)将研磨后的肝脏组织加入毛细管离心管中,进行离心,1800r/min 离心10 min;(5)将提取液转入新的毛细管离心管中,再次离心,3000r/min 离心10 min;(6)将上清液收集至离心管中,取出备用。
2.制备标准曲线:(1)取6个试管,分别标记为A、B、C、D、E、F,一个空白试管用作对照;(2)分别加入0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml的ALT 酶提取液;(3)加入pH 7.0缓冲液,使总体积为2.0ml;(4)每个试管中加入0.2ml的氧化丙酮胺试剂;(5)按顺序加入2ml、0.2ml、2ml的维生素C溶液、氧化丙酮胺试剂和ALT提取液;(6)加入4-氨基硫代洪美酸停止反应,并立即搅拌均匀;(7)用甲醛溶液处理样品;(8)分别在0.1、0.2、0.3、0.4及0.5的浓度范围内,测定样品的吸光度。
3.8.2.1小鼠肝、肾、心组织ALT含量测定
1实验原理
谷丙转氨酶作用于由丙氨酸及α-酮戊二酸组成的基质,在一定的反应条件下,产生一定量的丙酮酸。
在酶反应到规定时间时,加入2,4-二硝基苯肼,在当量浓度的酸性条件下,终止了酶反应。
2,4-二硝基苯肼分别与反应产生的丙酮酸及剩余的基质α-酮戊二酸形成各自对应的2,4-二硝基苯腙。
在碱性条件下,虽然二种苯腙分别显出红棕色,但由于丙酮酸生成的颜色较深,以同等克分子计算,在480-530nm波长范围内其浓度约为α-酮戊二酸生成的颜色的3倍,利用这一差别可以反映出丙酮酸的生成量。
本实验设谷草转氨酶活力为:样品液与ALT 基质液在37℃下反应60min时每生成1μmol丙酮酸所需的酶量为1个活力单位(U)。
2试剂配制
(1)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)
称取NaH2PO4.2H2O 2.96495g,Na2HPO4.12H2O 29.0142g,溶解于蒸馏水中,定容到1000mL。
(2)20μmol/L丙酮酸钠标准溶液
称取22mg丙酮酸钠,溶解于0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)100mL中。
现配现用。
(3)ALT基质液
称取α-酮戊二酸29.2mg,DL-丙氨酸1.78mg(L-丙氨酸0.85mg)溶解于30mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)中,溶解后校正pH至7.4,再用pH7.4的磷酸缓冲液定容至100mL,置冰箱中保存备用(可保存一周)。
可加入氯仿数滴防腐。
(4)0.02% 2,4—二硝基苯肼溶液
称取20mg2,4—二硝基苯肼先溶解于10 mL纯盐酸中,电炉加热助溶,待2,4—二硝基苯肼全部溶解后,用蒸馏水稀释至100mL,过滤后盛于棕色中,置冰箱中保存备用。
(5)1mol/L NaOH溶液:
称取4g NaOH溶解于蒸馏水后,定容到100mL。
(6)0.4 mol/L NaOH溶液
称取16 g NaOH溶解于蒸馏水后,定容到1000mL。
3实验方法
(1)样品的处理按 3.5方法进行。
(2)ALT标准曲线的制作
○1将测定所用试剂除氢氧化钠溶液外全部置于水浴箱内,预温37℃至然后使用.取6支试管,按表4进行配制
表4 ALT标准曲线的配制
20μmol/L丙酮酸
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
钠标准溶液
ALT基质液0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25
0.1mol/L磷酸缓
0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
冲液(pH7.4)
混匀,将各管置于37℃水浴中保温60min
2,4-二硝基苯肼0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
混匀,将各管置于37℃水浴中保温20min
0.4 mol/L NaOH
5 5 5 5 5 5
溶液
混匀,将各管置于37℃水浴中保温10min
○2冷却后以0为对照用分光光度计比色测定吸光值OD520nm。
○3以丙酮酸含量为纵坐标,吸光值OD520nm为横坐标绘制标准曲线(见图3)。
图3
ALT标准曲线见图3,建立回归方程为:
y =1.4149x (线性相关系数:R=0.9965)
其中:x-吸光度;
y-丙酮酸含量(μmol/L)
(3) 小鼠肝、肾、心组织ALT含量测定
○1将测定所用试剂除氢氧化钠溶液外全部置于水浴箱内,预温至然后使用.取2支试管,按表5进行配制
表5 ALT含量测定
样品0.10 0.10 ALT基质液- 0.50
混匀,将各管置于37℃水浴中保温60min
ALT基质液0.50 - 2,4—二硝基苯肼0.5 0.5
混匀,将各管置于37℃水浴中保温20min
0.4 mol/L NaOH溶液 5 5
混匀,将各管置于37℃水浴中保温10min
○2冷却后以0为对照用分光光度计比色测定吸光值OD520nm。
○3在标准曲线中读出样品丙酮酸的生成量(见图3) 。
3.8.2.2小鼠肝、肾、心组织谷草转氨酶(AST)含量测定
1实验原理
AST作用于门冬氨酸和α-酮戊二酸组成的基质,在一定的反应条件下,产生一定量的草酰乙酸,草酰乙酸在反应过程中又自行脱羧成为丙酮酸。
在酶反应到规定时间时,加入2,4-二硝基苯肼,在当量浓度的酸性条件下,终止了酶反应。
2,4-二硝基苯肼分别与反应产生的丙酮酸及剩余的基质α-酮戊二酸形成各自对应的2,4-二硝基苯腙。
在碱性条件下,虽然二种苯腙分别显出红棕色,但由于丙酮酸生成的颜色较深,以同等克分子计算,在480-530nm波长范围内其浓度约为α-酮戊二酸生成的颜色的3倍,利用这一差别可以反映出丙酮酸的生成量。
本实验设谷草转氨酶活力为:样品液与AST基质液在37℃下反应60min时产生的草酰乙酸自行脱羧成为1μmol丙酮酸所需的酶量为1个活力单位。
2试剂配制
(1) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)
称取NaH2PO4.2H2O 2.96495g,Na2HPO4.12H2O 29.0142g,溶解于蒸馏水中,定容到1000mL。
(2) 20μmol/L丙酮酸钠标准溶液
称取22mg丙酮酸钠,溶解于0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)100mL中。
现配现用。
(3) AST基质液
称取α-酮戊二酸29.2mg,DL-门冬氨酸2.66 g,置于亦小烧杯中,加入1N 氢氧化钠溶解,并校正pH至7.4,再用pH7.4的磷酸缓冲液定容至100mL,置冰箱中保存备用(可保存一周)。
(4) 0.02% 2,4—二硝基苯肼溶液
称取20mg2,4—二硝基苯肼先溶解于10 mL纯盐酸中,电炉加热助溶,待2,4—二硝基苯肼全部溶解后,用蒸馏水稀释至100mL,过滤后盛于棕色中,
置冰箱中保存备用。
(5) 1mol/L NaOH溶液:
称取4g NaOH溶解于蒸馏水后,定容到100mL。
(6) 0.4 mol/L NaOH溶液
称取16 g NaOH溶解于蒸馏水后,定容到1000mL。
3实验方法
(1) 样品的处理按 3.5 方法进行。
(2) AST标准曲线的制作
○1将测定所用试剂除氢氧化钠溶液外全部置于水浴箱内,预温至然后使用.取6支试管,按表6进行配制
表6AST标准曲线的配制
20μmol/L丙酮酸
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
钠标准溶液
AST基质液0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25
0.1mol/L磷酸缓
0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
冲液(pH7.4)
混匀,将各管置于37℃水浴中保温60min
2,4-二硝基苯肼0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
混匀,将各管置于37℃水浴中保温20min
0.4 mol/L
5 5 5 5 5 5
NaOH溶液
混匀,将各管置于37℃水浴中保温10min
○2冷却后以0管为对照用分光光度计比色测定吸光值OD520nm。
○3以丙酮酸含量为纵坐标,吸光值OD520nm为横坐标绘制标准曲线(见图4)。
图4 AST标准曲线见图4,建立回归方程为:
y =1.3294x (线性相关系数:R=0.9992)其中:x-吸光度;
y-丙酮酸含量(μmol/L)
(3) 样品AST含量测定
测定方法同ALT含量测定。