医学免疫学实验六 淋巴细胞功能检测
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医学免疫学实验指导：免疫细胞的检测
医学免疫学实验指导：免疫细胞的检测内容实验、外周血单个核细胞的分离与纯化试验、E玫瑰花结试验试验、溶血空斑试验试验、外周血单个核细胞的分离与纯化—密度梯度离心法（isolation and purification of peripheral blood mononuclear cell）人体外周血单个核细胞（主要包括淋巴细胞和单核细胞）与血液中的其它成分存在密度差异，红细胞与中性粒细胞的比重是1.092，单个核细胞约为1.075~1.090，血小板约为1.032。
市售的淋巴细胞分层液的比重为1.077±0.002g/L，与单个核细胞比重相近。
通过离心后，各种血液成分将按其密度梯度重新分布聚集，从而将单个核细胞与其他血细胞分离。
[材料]1．淋巴细胞分层液（Ficoll-Hypaque，比重为1.077±0.002g/L）、肝素溶液（200U/ml）、无Ca2+ 、Mg2+ Hank’s液，2%的台盼蓝染液。
2．离心管、毛细吸管、水平离心机、注射器等。
[方法]1．无菌采集人静脉血2ml，用肝素溶液抗凝（每1ml 全血加20U肝素），加Hank’s 液2ml作等倍稀释。
2．用毛细吸管将稀释的抗凝血沿管壁轻缓地加入盛有2~3ml淋巴细胞分层液的离心管中，使血液重叠于分层液上，两者间保持界面清晰。
3．将加好血液的离心管置水平离心机，2000rpm离心20min后，小心取出。
离心后的血液成分分布如图。
图密度梯度离心法分离前后血细胞分层示意图4．将毛细吸管轻轻插入，吸出白色云雾状的单个核细胞层；或先吸去上层的血浆、稀释液及血小板后，再用另一支毛细吸管仔细吸出单个核细胞层，用5倍体积的Hank’s液洗涤3次，每次1500rpm，离心10min。
5．细胞计数：将洗涤后的细胞加0.5ml的完全RPMI-1640培养基（含10%灭活的小牛血清）制成细胞悬液。
取0.1ml细胞悬液与2%冰醋酸等量混合，用血球计数板按白细胞计数法计数，并按下式计算出4个大方格内的细胞数：细胞数（/ml）= 4个大方格细胞数×104×稀释倍数46．细胞活力检查：取2滴细胞悬液与1滴2%台盼蓝染液混匀，5min后在高倍镜下观察，活细胞不着色，死细胞染成蓝色，计算活细胞百分率。
单个细胞分离技术PBMC
美丽的海医校园
临床免疫学实验指导
海南医学院
实验六 单个核细胞分离及细胞免疫功能检测 【实验目的】 1.熟悉淋巴细胞分离方法 2.了解T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义
T细胞介导的免疫应答特征：是T细胞辅助细胞（Th1）介导的 单个核细胞（L, M），以浸润为主的炎症反应与细胞毒性T细胞
（CTL或TC）发生特异性细胞毒效应.
计数池区域 一个计数全池 大方格 白细胞中方格 红细胞中方格 红细胞小方格 边长（mm） 3 1 0.25 0.20 0.05 面积（mm2） 池深（mm） 9 1 0.0625 0.0400 0.0025 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 体积（mm3 ul） 0.90 0.10 0.00625 0.00400 0.00025
细 胞 计 数 原 则 计 左 上 ， 不 计 右 下
血细胞计数板
血细胞计数板上四个角的 四个大方格
1个大方格中16个中方格 计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。 （只计算上边和左边的压线细胞， 右边和下边压线细胞不计算）
单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）
E+淋巴细胞百分率测定：正常人参考值： 60%-80%
由于干扰因素较多，主观因素影响，临床意义不明显
结果不稳定，重复性不高等原因，很少做。
T细胞总数测定——Et花环沉降法（E+淋巴细胞百分率：60-80%）
人类T细 胞的主要 标志 的CD2、 CD3和 TCR均 能吸附 绵羊红 细胞于淋 巴周
围，形
4个大方格内 细胞总数 4 × 稀释倍数 ×104
单个核细胞总数/ml=
单个核细胞总数/ml = X/4×10×(稀释倍数) ×103 =X×104 关于稀释倍数：这里不是指血液稀释倍数。是指最后洗涤 离心弃去上清液后的单个核细胞沉淀中，加入缓冲液1.0ml后。
临床免疫学实验指导
海南医学院
实验六 单个核细胞分离及细胞免疫功能检测 【实验目的】 1.熟悉淋巴细胞分离方法 2.了解T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义
T细胞介导的免疫应答特征：是T细胞辅助细胞（Th1）介导的 单个核细胞（L, M），以浸润为主的炎症反应与细胞毒性T细胞
（CTL或TC）发生特异性细胞毒效应.
计数池区域 一个计数全池 大方格 白细胞中方格 红细胞中方格 红细胞小方格 边长（mm） 3 1 0.25 0.20 0.05 面积（mm2） 池深（mm） 9 1 0.0625 0.0400 0.0025 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 体积（mm3 ul） 0.90 0.10 0.00625 0.00400 0.00025
细 胞 计 数 原 则 计 左 上 ， 不 计 右 下
血细胞计数板
血细胞计数板上四个角的 四个大方格
1个大方格中16个中方格 计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。 （只计算上边和左边的压线细胞， 右边和下边压线细胞不计算）
单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）
E+淋巴细胞百分率测定：正常人参考值： 60%-80%
由于干扰因素较多，主观因素影响，临床意义不明显
结果不稳定，重复性不高等原因，很少做。
T细胞总数测定——Et花环沉降法（E+淋巴细胞百分率：60-80%）
人类T细 胞的主要 标志 的CD2、 CD3和 TCR均 能吸附 绵羊红 细胞于淋 巴周
围，形
4个大方格内 细胞总数 4 × 稀释倍数 ×104
单个核细胞总数/ml=
单个核细胞总数/ml = X/4×10×(稀释倍数) ×103 =X×104 关于稀释倍数：这里不是指血液稀释倍数。是指最后洗涤 离心弃去上清液后的单个核细胞沉淀中，加入缓冲液1.0ml后。
淋巴细胞的功能检测一T细胞功能检测二B细胞功培训课件
淋巴细胞的功能检测一T细胞功能检测二 B细胞功
2
第一节 淋巴细胞的功能检测
淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外 实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对 抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体 外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂 原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴 细胞分泌产物的测定
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2．应用与方法学评价：
➢该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检
测抗体分泌量。
➢优点：
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量； 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
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淋巴细胞的功能检测一T细胞功能检测二 B细胞功
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(四) 体内试验
➢体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、 破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。 ➢将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫 前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血 清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判 断受检者体内B细胞的功能。
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3．临床应用与评价
➢溶血空斑试验主要用于测定药物和 手术等因素对体液免疫功能的影响 ➢评价免疫治疗或免疫重建后机体产 生抗体的能力。
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淋巴细胞的功能检测一T细胞功能检测二 B细胞功
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(三) B细胞抗体形成功能的检测 ——酶联免疫斑点法
1.原理：
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淋巴细胞的功能检测一T细胞功能检测二 B细胞功
形态学
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3H－TdR掺入 法
淋巴细胞的功能检测一T细胞功能检测二 B细胞功
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(二) 溶血空斑试验 1. 原理：
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免疫学实验——淋巴细胞功能检测
材料: 1.肝素(100单位/毫升)、 淋巴细胞分层液人 的正常血液 2.0.5%绵羊红细胞悬液(用Hanks液配制), Hanks 液 3.吸收过的胎牛血清:取经56℃30分钟加热灭 活后的胎牛血清加半量压积兔红细胞混合后， 37℃水浴20分钟，2000转/分离心10分钟， 取上清液即成。 4. 灭菌注射器，针头，试管，吸管等。
Thanks For watching
B细胞产生抗体能力的测定
ELISPOT法
原理：ELISPOT全称为酶联免疫斑点试验，可用于测定产 生IgG和IgM抗体的B细胞。其方法是用抗原包被固相，然后 加入抗原特异性B细胞。如果B细胞产生抗体，抗体与板上的 抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代 表一个产生抗体的细胞。
方法
1.抗原包被: 37C° 2h，或4C°过夜。固相载体可用聚苯乙烯 平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。 2.抗体生成细胞培育:加入适量抗体生成细胞，37C°, 5%CO. ，3~4h，或过夜。洗涤，去除为与固相结合的细胞。 3.测定斑点产生细胞:加二抗，37C° ，5%CO.2，2~3h。加辣 根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。 4计数: 24h后用10~30倍显微镜下计数斑点形成细胞。
淋巴细胞功能检测
实验任务
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用， 请设计一个方案证实之(从影响淋巴细胞功能、
T淋巴细胞增殖的角度考虑) .
淋巴细胞功能检测
•T细胞增殖（转化）实验 •绵羊红细胞玫瑰花环试验 •B细胞产生抗体能力的测定 •细胞因子的检测
T细胞增殖（转化）实验
原理：T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继变化，在 24~48h细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如 细胞变化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由 淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细胞增殖又叫淋巴细胞 转化。据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。
淋巴细胞的分离和功能检测
水平式离心（2000rpm，20min）
吸出白色云雾状单个核细胞层，洗涤3次备用
h
7
密度梯度分离单个核细胞 （Ficoll分层液）
h
8
细胞活性： ＞95%
单个核细胞纯度：＞95%
细胞获得率： ＞80%
最佳温度： 20℃
h
9
Percoll分离法
属于连续密度梯度离心分离法
Percoll：包有乙烯吡咯顽酮的硅胶粒 特点：渗透压低、黏度小、无毒
h
18
单核细胞去除法
粘附法
单核细胞37℃下能粘附在塑料或玻璃表面， 淋巴细胞则不能，将PBMC置于细胞培养 瓶中培养1小时，即可去除单核细胞。
淋巴细胞纯度：＞95%
活性：＞95%
h
19
L-亮氨酸甲酯法
L-亮氨酸甲酯在溶酶体酶的作用下可转化成 有毒L-亮氨酸- L-亮氨酸甲酯，导致单核细胞破坏。 同时可去除NK细胞和Tc细胞。
alkaline phosphatase technique)
碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色 法(APAAP法)，用兔抗鼠IgG起搭桥作用， 其中一个Fab段连接McAb ，另一个Fab段 连接APAAP复合物， 再通过复合物中的碱 性磷酸酶催化底物显色来判断抗原分子的 存在。
h
53
APAAP酶免疫桥联法
h
61
h
62
T细胞增殖功能测定
单向混合淋巴细胞培养
5. 计算相对反应（RR）
（实验组cpm－阴性对照组cpm） RR＝
阳性对照组cpm－阴性对照组cpm
h
63
T细胞增殖功能测定
单向混合淋巴细胞培养
注意点
1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细 胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或 抑制反应。 3. 本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于 20000 rpm。
吸出白色云雾状单个核细胞层，洗涤3次备用
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7
密度梯度分离单个核细胞 （Ficoll分层液）
h
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细胞活性： ＞95%
单个核细胞纯度：＞95%
细胞获得率： ＞80%
最佳温度： 20℃
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Percoll分离法
属于连续密度梯度离心分离法
Percoll：包有乙烯吡咯顽酮的硅胶粒 特点：渗透压低、黏度小、无毒
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单核细胞去除法
粘附法
单核细胞37℃下能粘附在塑料或玻璃表面， 淋巴细胞则不能，将PBMC置于细胞培养 瓶中培养1小时，即可去除单核细胞。
淋巴细胞纯度：＞95%
活性：＞95%
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L-亮氨酸甲酯法
L-亮氨酸甲酯在溶酶体酶的作用下可转化成 有毒L-亮氨酸- L-亮氨酸甲酯，导致单核细胞破坏。 同时可去除NK细胞和Tc细胞。
alkaline phosphatase technique)
碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色 法(APAAP法)，用兔抗鼠IgG起搭桥作用， 其中一个Fab段连接McAb ，另一个Fab段 连接APAAP复合物， 再通过复合物中的碱 性磷酸酶催化底物显色来判断抗原分子的 存在。
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APAAP酶免疫桥联法
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T细胞增殖功能测定
单向混合淋巴细胞培养
5. 计算相对反应（RR）
（实验组cpm－阴性对照组cpm） RR＝
阳性对照组cpm－阴性对照组cpm
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T细胞增殖功能测定
单向混合淋巴细胞培养
注意点
1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细 胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或 抑制反应。 3. 本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于 20000 rpm。
免疫细胞功能检测技术
测量上清液中 释放的51Cr
混合培养4-6小时
(四) 体内试验
➢特异性抗原皮肤试验 ➢PHA皮肤试验
.
Hale Waihona Puke 二、B细胞功能检测➢B细胞增殖能力的试验 ➢溶血空斑试验 ➢B细胞抗体形成功能的检测 ➢体内试验
.
(一)B细胞增殖能力的试验
抗IgM 细菌脂多糖 SAC的SPA
B细胞增殖
形态学
3H－TdR掺入 法
.
Thanks！
.
12～16
核大小、染色质 增大、疏松
增大、疏松
核仁
清晰、1～4个 有或无
有丝分裂
有或无
无
胞质、着色
增多、嗜碱
增多、嗜碱
浆内空泡
有或无
有或无
伪足
有或无
.
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
2. 淋巴细胞转化的刺激物
非特异性刺激物： PHA ------T细胞 ConA -------T细胞 PWM -------T、 B细胞 LPS -------B细胞
中性粒细胞 NBT 甲臜颗粒沉积于胞质中
.
二、巨噬细胞功能检测
(一)炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
.
(四) 细胞毒作用测定
用IFN-γ激活小鼠巨噬细胞，观察其对 125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤 P815的杀伤活性。
.
(五) 巨噬细胞促凝血活性测定
淋巴细胞亚群分析六项
淋巴细胞亚群分析六项淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，分布于人体内的淋巴组织和淋巴器官中。
这些细胞可以通过各种方式参与免疫反应，帮助我们抵御各种外来病原体和疾病的侵袭。
而淋巴细胞亚群分析六项则是用于评估淋巴细胞的不同类型和功能状态的一种常见检测指标。
淋巴细胞亚群分析六项主要包括T细胞亚群、B细胞亚群、NK细胞、调节性T细胞（Treg细胞）、CD4+/CD8+比值以及NK细胞活性。
通过对这些指标的检测和分析，可以更全面地了解人体免疫系统的状态，判断免疫功能是否正常。
首先是T细胞亚群的分析。
T细胞是淋巴细胞中最重要的一类细胞，可以分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。
CD4+T细胞被称为辅助性T细胞，主要协调和调节免疫反应。
CD8+T细胞则是细胞毒性T细胞，可以直接杀伤病原体感染的细胞。
通过对CD4+/CD8+比值的测定，可以了解到人体免疫系统的平衡状态。
其次是B细胞亚群的分析。
B细胞是另一类重要的淋巴细胞，主要负责产生和分泌抗体，是体液免疫的重要组成部分。
B细胞亚群分析可以评估不同类型的B细胞数量和功能状况，进而了解免疫系统对抗原的识别和应答能力。
此外，NK细胞的分析也是淋巴细胞亚群分析的重要指标之一。
NK 细胞是自然杀伤细胞的简称，主要负责识别和杀伤感染细胞和肿瘤细胞。
通过对NK细胞数量和活性的检测，可以了解到人体免疫系统对抗肿瘤和感染的能力。
同时，调节性T细胞（Treg细胞）的分析也是淋巴细胞亚群分析的重要内容之一。
Treg细胞可以抑制和调节免疫反应，维持免疫系统的平衡状态。
通过对Treg细胞数量和功能的测定，可以判断免疫系统是否处于正常调节状态。
最后是NK细胞活性的分析。
NK细胞的杀伤能力是评估免疫系统对抗肿瘤和感染的重要指标之一。
通过对NK细胞活性的测定，可以了解该细胞的杀伤能力是否正常。
淋巴细胞亚群分析六项是一项重要的免疫学检测指标，可以帮助医生评估患者的免疫功能是否正常。
通过对这些指标的检测和分析，可以更全面地了解免疫系统的状态，有助于指导临床治疗和预防疾病的发生。
检测淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖实验设计
③细胞培养至56h，每孔内加入3H-TdR工作液 各20 μl，轻轻震荡混匀后置37°c CO ₂培养箱内 继续培养至72h终止培养
④终止培养时，用多头细胞收集器将细胞收 集在49型玻璃纤维滤膜上，将滤膜置烤箱内烤干
⑤滤膜冷却后移入存有5ml闪烁液的闪烁杯中， 避光放置一段时间后，用FJ-2107液闪计算器测量 放射性，结果用刺激指数（SI）表示
实验步骤：
①静脉采血肝素抗凝，充分摇匀后加入 细胞微量培养板内（20 μl/孔）每个样品设自 发转化孔和分裂原刺激孔均为三个复孔
②自发转化孔每孔内加完全RPMI-1640液 0.2ml，分裂原刺激孔每孔内加PHA液0.1ml， RPMI-1640液0.1ml。加样后，轻轻震荡混匀， 置37°c CO ₂培养箱内培养
管、玻片等常规实验仪器。 三、PHA、瑞氏姬姆萨染液，肝素，Hanks液
等常规实验试剂。
1、T淋巴细胞功能的测定（T细胞转化、增 殖实验、迟发性超敏反应的检测、T细胞分 泌细胞因子的检测、CTL细胞介导的细胞毒 试验）
2、B淋巴细胞功能的测定 3、单核巨噬细胞、NK细胞等的功能测定 4、细胞因子的检测 5、CD分子、表面受体、黏附分子的检测
问题背景：
市场上有一广告产品， 据说有免疫增强作用请设 计一个方案证实之。（从 影响淋巴细胞功能、T淋巴 细胞增殖的角度考虑。）
T淋巴细胞受到特异性抗原或非特异性抗原 （PHA、PWM和ConA）刺激均能使细胞发生转 化。T淋巴细胞转化率的高低可反映人体细胞免 疫功能水平，常被作为细胞免疫功能指标之一。
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
① 稳定、特异，且抗原用量少； ②可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测 ③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞
抗体介导免疫方法指导淋巴细胞检测
抗体介导免疫方法指导淋巴细胞检测淋巴细胞是一类非常重要的免疫细胞，主要参与机体的免疫应答。
在体外检测淋巴细胞数量和功能状态的方法中，抗体介导的免疫方法是一种常用的技术。
它通过使用特异性抗体来标记淋巴细胞，实现对它们的检测和分析。
本文将为您介绍抗体介导免疫方法在淋巴细胞检测中的应用。
抗体介导免疫方法的基本原理是将特异性抗体与要检测的淋巴细胞表面标志物结合，从而实现对目标细胞的选择性检测。
在淋巴细胞检测中，一种常用的方法是使用荧光染料标记的抗体。
这种抗体是通过与荧光染料结合，使得目标细胞在荧光显微镜下呈现出不同的颜色或亮度，从而可以进行定量或定性分析。
抗体介导免疫方法在淋巴细胞检测中具有许多优势。
首先，它可以对不同的淋巴细胞亚群进行检测和分析。
我们知道，淋巴细胞可以分为多个亚群，如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞等。
通过使用特异性抗体，我们可以标记和区分不同亚群的淋巴细胞，从而更好地了解免疫应答的状态。
其次，抗体介导免疫方法可以进行淋巴细胞功能分析。
除了对淋巴细胞进行数量检测外，我们还可以使用不同的功能标记来分析淋巴细胞的功能状态。
例如，通过标记细胞因子产生的抗体，我们可以检测淋巴细胞的细胞因子释放情况，从而了解免疫应答的类型和强度。
此外，抗体介导免疫方法还可以用于淋巴细胞亚群分离和纯化。
通过使用特异性抗体和磁珠等技术，我们可以选择性地捕获和纯化目标淋巴细胞，以进一步进行深入的研究。
这对于研究特定亚群的功能、免疫治疗的设计以及临床诊断都具有重要意义。
总之，抗体介导免疫方法在淋巴细胞检测中发挥着重要的作用。
它不仅可以对淋巴细胞亚群进行定量检测和功能分析，还可以实现淋巴细胞亚群的纯化和分离。
这些应用为深入研究淋巴细胞的功能和免疫应答提供了有力工具，也为临床诊断和治疗提供了参考依据。
在实际操作中，我们需要选择合适的抗体和染料来进行淋巴细胞检测。
选择合适的抗体要考虑其特异性和亲和力，以确保对目标细胞的选择性识别。
Lu 淋巴细胞体外增殖功能检测
DNA合成检测法
DNA复制完成、 蛋白合成， 为有丝分裂 作准备
RNA转录、蛋 白合成为DNA 复制做准备
DNA合成期 增殖期的细胞需要大量核苷酸
DNA合成检测法
利用在细胞培养过程中掺入放射性（如 3H-Tdr 掺入法）或
非放射性的核苷类似物（如 Brdu 掺入实验），直接检测 DNA合成水平变化
刺激淋巴细胞增殖
Day 3:
CCk8检测细胞增殖
将细胞浓度分别调节为 2x106 /mL和4x106 /mL，加入96 孔板，每孔90μL，加入25μg/mL或50μ g/mL ConA溶液10 μL ，细胞培养箱（37℃，5%CO2)中孵育72h。培养期间可 观察细胞增殖情况。
美洲商陆 激活人和小鼠T和B细胞 G-菌 测定小鼠B细胞 检测人B细胞
葡萄球菌蛋白A（SPA）G+菌
高浓度时，经丝裂原受体与B细胞结合，多克隆诱导B细胞 增殖和分化； 低浓度时， BCR特异性识别TI-1抗原的B细胞能竞争结合到 足够抗原量被激活； 感染初期（在TD-Ag免疫应答启动前）快速产生特异性抗体
的BrdU水平
LPS 2D 3D 12.05
0.65 Medium
5.77
BrdU 7AAD Flow cytometric analysis of DNA content (propidium iodide) and DNA synthesis (BrdU) after two or three days of stimulation
细胞染色法
利用荧光染色可穿透细胞膜的特性染色细胞，当细胞分裂
时，荧光标记物被平均分配到两个子代细胞中，其荧光强 度是亲代细胞的一半，如CFSE染色细胞
C3He anti-u 10
免疫学检验-免疫细胞及其功能检验技术
• 所用的方法应力求操作简便、尽量保持细胞活性 兼顾细胞纯度和获得率。
一、白细胞的分离 （一）自然沉降法
加抗凝血于试管中
室温或37℃中静置 （30-60min）
分层
结果示意图
（二）高分子聚合物沉降法
抗凝血与等量3%明胶或 6%右旋糖酐溶液混匀
室温或37℃中静置 （30～60min）
分层结果与自然沉降法 类似
四、吞噬细胞的分离
•吞噬细胞包括两类：一类是大吞噬细胞即单核吞 噬细胞系统（包括血液中的单核细胞以及组织器 官中的巨噬细胞）；另一类是小吞噬细胞，即中 性粒细胞。 •分离原理：主要根据其表面标志和生物学特性。
（一）单核细胞的分离
• Percoll密度梯度分离法 • 流式细胞术分离法（常用方法） • 免疫磁珠分离法：分选CD14+细胞（常用方法
） • 黏附法
黏附法会影响单核细胞的功能，仅适用于去除 单核细胞。
（二）巨噬细胞的分离
• 斑蝥敷贴法：（用于分离人巨噬细胞）
操作要点：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的滤纸帖敷在前 臂内侧皮肤，4~5小时后见皮肤局部充血，48小时后出 现水泡，吸取渗出液（主要为巨噬细胞）、离心洗涤。
• 腹腔渗出液分离法：（用于分离动物巨噬细胞）
优点：速度快、得率高 不足：白细胞黏性增加
二、外周血单个核细胞的分离
•外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）主要是指淋巴 细胞和单核细胞。 •PBMC是免疫学实验中最常用的细胞群 •PBMC也是T、B细胞分离纯化的细胞来源。
人外周血中各类血细胞密度
（二） Percoll分层液法
连续密度梯度分离液 （Percoll液+PBS，离
一、白细胞的分离 （一）自然沉降法
加抗凝血于试管中
室温或37℃中静置 （30-60min）
分层
结果示意图
（二）高分子聚合物沉降法
抗凝血与等量3%明胶或 6%右旋糖酐溶液混匀
室温或37℃中静置 （30～60min）
分层结果与自然沉降法 类似
四、吞噬细胞的分离
•吞噬细胞包括两类：一类是大吞噬细胞即单核吞 噬细胞系统（包括血液中的单核细胞以及组织器 官中的巨噬细胞）；另一类是小吞噬细胞，即中 性粒细胞。 •分离原理：主要根据其表面标志和生物学特性。
（一）单核细胞的分离
• Percoll密度梯度分离法 • 流式细胞术分离法（常用方法） • 免疫磁珠分离法：分选CD14+细胞（常用方法
） • 黏附法
黏附法会影响单核细胞的功能，仅适用于去除 单核细胞。
（二）巨噬细胞的分离
• 斑蝥敷贴法：（用于分离人巨噬细胞）
操作要点：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的滤纸帖敷在前 臂内侧皮肤，4~5小时后见皮肤局部充血，48小时后出 现水泡，吸取渗出液（主要为巨噬细胞）、离心洗涤。
• 腹腔渗出液分离法：（用于分离动物巨噬细胞）
优点：速度快、得率高 不足：白细胞黏性增加
二、外周血单个核细胞的分离
•外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）主要是指淋巴 细胞和单核细胞。 •PBMC是免疫学实验中最常用的细胞群 •PBMC也是T、B细胞分离纯化的细胞来源。
人外周血中各类血细胞密度
（二） Percoll分层液法
连续密度梯度分离液 （Percoll液+PBS，离
淋巴细胞功能测定
免疫学技术原理与应用PAIT-12淋巴细胞功能测定孙汭中国科技大学生命科学学院免疫学研究所PMIT-12淋巴细胞功能测定一、常用的淋巴细胞功能测定二、T淋巴细胞功能测定三、B淋巴细胞功能测定四、NK细胞细胞毒试验一、常用的淋巴细胞功能测定1、淋巴细胞增殖试验① 3H-TdR掺入法原理：淋巴细胞在丝裂原或特异性抗原刺激下转化为淋巴母细胞，发生转化过程中，细胞DNA合成大量增多。
此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside, 3H-TdR), 使3H-TdR掺入新合成的DNA中，经β-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA 的3H-TdR掺入量，根据掺入细胞内的核素的量可判断淋巴细胞增殖的程度。
② MTT比色法原理：MTT（（3-4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑）是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，MTT代谢形成蓝色的甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。
甲攒经异丙醇溶解后呈紫蓝色，借助酶标仪测定OD值，可反映细胞增殖水平。
2、细胞毒试验①51Cr释放法原理：用放射性核素51Cr（Na251-CrO4，鉻酸钠）标记靶细胞，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合。
然后将51Cr标记的靶细胞与待检细胞（效应细胞）共同孵育一定时间后，若待检细胞能够杀伤靶细胞，则51Cr从靶细胞释放出来。
51Cr的释放量与效应细胞的活性成正相关。
即靶细胞被杀伤的越多，释放到上清中的游离51Cr越多，用γ计数仪测定上清中51Cr的放射活性（cpm）值，以计算待检细胞的细胞毒活性。
（一）、用51Cr铬酸钠标记靶细胞1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。
用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。
加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。
淋巴细胞功能检测T细胞功能检测B细胞功【可编辑的文档】
12～16
核大小、染色质 增大、疏松
增大、疏松
核仁
清晰、1～4个 有或无
有丝分裂
有或无
无
胞质、着色
增多、嗜碱
增多、嗜碱
浆内空泡
有或无
有或无
伪足
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
2. 淋巴细胞转化的刺激物
非特异性刺激物： PHA ------T 细胞 ConA -------T 细胞 PWM -------T 、 B细
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定 量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
(四) 体内试验
?体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、 破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。 ?将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫 前及免疫后 1周、2周、3周分别采血，分离血 清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判 断受检者体内 B细胞的功能。
一、T细胞功能的检测
?T细胞增殖试验 ?T细胞分泌功能测定 ?T细胞介导的细胞毒试验 ?体内试验
（一）T淋巴细胞增殖试验
1. 原理：
淋巴细胞
刺激物
DNA合成 母细胞
分化
细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
过渡型
细胞大小(直径μm) 12～20
(四) 体内试验
?特异性抗原皮肤试验 ?PHA皮肤试验
二、B细胞功能检测
?B细胞增殖能力的试验 ?溶血空斑试验 ?B细胞抗体形成功能的检测 ?体内试验
(一)B细胞增殖能力的试验
抗IgM 细菌脂多糖 SAC的SPA
免疫检验考试辅导：淋巴细胞检测
虽然自身免疫病多与自身抗体有关，但仍有部分疾病不存在相关的自身抗体，而与致敏淋巴细胞有关，还可能与免疫调节异常或其他因素有关。
这些相关因素的检测对疾病的诊断有一定的参考意义。
考试资料网
1.特异性致敏淋巴细胞在溃疡性结肠炎、外周神经炎及实验性变态反应性脑脊髓炎等疾病，可能与自身反应性致敏淋巴细胞有关。
虽然这些淋巴细胞在疾病中的确切作用要比自身抗体的作用更难证实，但相关性本身也具有一定参考价值。
检测致敏淋巴细胞可用器官特异性抗原作诱导剂，进行淋巴细胞转化试验或吞噬细胞移动抑制试验等；皮肤试验也能反映机体致敏情况，但有诱导致敏性或诱发变态反应的危险。
实验结果需结合临床或其他检查进行综合分析。
2.淋巴细胞数量及比例前已述及，在免疫缺陷病或免疫失调时容易发生自身免疫病，所以进行淋巴细胞数量及亚群比例的检查也有一定意义。
检测内容包括淋巴细胞总数、T和B细胞分类计数及CD4/CD8亚群比例测定等。
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该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规 模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及 药敏试验等。
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4） 红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液 、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂 盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、 无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量 移液器、枪头、血球计数板、计数器
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
96孔板布局
PBS孔
调零孔 未刺激组 刺激组
K8检测：培养结束后，每孔（调零组、未 刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将 培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测 定在450nm处吸光度。
优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能
III. 调节/抑制T细胞（regulatory/suppressor T cell）：调节 机体免疫反应。通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度 损伤机体的重要作用。调节/抑制T细胞有很多种如CD25+ CD4+ T细胞。
IV. 记忆T细胞 (memory T cell)：在再次免疫应答中起重要作 用。
T淋巴细胞（T-lymphocyte）
T细胞由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中 数量最多，功能最复杂的一类细胞。它是淋巴细胞的主 要组分，具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅 助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂 原的应答反应以及产生细胞因子等，用以抵御疾病感染 、肿瘤。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫 的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶 细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最 终使免疫效应扩大和增强。
特异性抗原物质：异种抗原，同种组织抗原。
不同的刺激物质可刺激不同的淋巴细胞分化增殖，可以反 应不同细胞群的免疫功能。
刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)
ConA属有丝分裂原（mitogen)，可与T细胞表面 TCR复合物及CD2结合，使其形成细胞表面的分子 簇化，促使细胞活化并诱导细胞分裂，为非特异性 多克隆活化剂。
优点：敏感性高，重复性好 缺点：需要特定设备，存在放射性污染
CCK8（Cell Counting Kit-8）检测 细胞增殖
Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）是由日本同仁化学 研究所（Dojindo）开发的检测细胞增殖、细胞毒性的试 剂盒，为MTT法的替代方法，CCK-8 试剂盒利用了日本同 仁化学研究所（Dojindo）开发的四唑盐——WST-8 (2(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)2H-四唑单钠盐)，它在电子耦合剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中 的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（ Formazan）。 生成的甲臜量与活细胞的数量成正比。 OD450可间接反映活细胞数量。
正置显微镜、倒置显微镜、离心机、酶标仪
实验流程
取脾脏
4h后 检测
制备单细 胞悬液
细胞培 养3天
加入 CCK8
实验步骤
I. 取小鼠脾脏、制备单个核细胞悬液、计算细胞 浓度。
II. Con A刺激细胞：将细胞浓度调节为 4x106 /mL，加入96孔板，每孔90μL，加入2.5 μ g/mL 的 ConA 溶 液 10 μL ， 细 胞 培 养 箱 （ 37℃ ， 5%CO2) 中 孵 育 72h 。 培 养 期 间 可 观 察细胞增殖情况。
T细胞在体外培养时，受到非特异性丝裂原 （如PHA、ConA）或特异性抗原刺激后， 可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、 细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞。
淋巴细胞增殖活力的高低可以反映机体的细 胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能 的指标之一。
刺激淋巴细胞增殖的物质
非特异性刺激物：植物血凝素（PHA ，刺激T 细胞）、刀豆蛋白A（ConA，刺激T细胞）、 PWM（刺激B、T细胞）、LPS（刺激B细胞） 、抗CD3抗体等。
CCK8（Cell Counting Kit-8）检测 细胞增殖
CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中,不需要预配各种成 分。CCK-8法是用于测定细胞增殖或细胞毒性试验中活细 胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。WST-8 法检测细胞增殖、细胞毒性实验的灵敏度比其它四唑盐如 MTT, XTT, MTS或WST-1高。由于CCK-8溶液相当稳定 ，并且对细胞没有毒性，因此可以长时间孵育。
T细胞根据功能/表面标志分类
I. 细胞毒T细胞（cytotoxic T cell）：消灭受感染的细胞。这 些细胞可以对产生特殊抗原ห้องสมุดไป่ตู้应的目标细胞进行杀灭。细胞 毒T细胞的主要表面标志是CD8。
II. 辅助T细胞（helper T cell）：它可以增生扩散来激活其它 类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。主要表面标志是CD4 。 T细胞调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能。它们是已 知的HIV的目标细胞，在艾滋病发病时会急剧减少。
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4） 红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液 、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂 盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、 无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量 移液器、枪头、血球计数板、计数器
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
96孔板布局
PBS孔
调零孔 未刺激组 刺激组
K8检测：培养结束后，每孔（调零组、未 刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将 培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测 定在450nm处吸光度。
优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能
III. 调节/抑制T细胞（regulatory/suppressor T cell）：调节 机体免疫反应。通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度 损伤机体的重要作用。调节/抑制T细胞有很多种如CD25+ CD4+ T细胞。
IV. 记忆T细胞 (memory T cell)：在再次免疫应答中起重要作 用。
T淋巴细胞（T-lymphocyte）
T细胞由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中 数量最多，功能最复杂的一类细胞。它是淋巴细胞的主 要组分，具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅 助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂 原的应答反应以及产生细胞因子等，用以抵御疾病感染 、肿瘤。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫 的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶 细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最 终使免疫效应扩大和增强。
特异性抗原物质：异种抗原，同种组织抗原。
不同的刺激物质可刺激不同的淋巴细胞分化增殖，可以反 应不同细胞群的免疫功能。
刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)
ConA属有丝分裂原（mitogen)，可与T细胞表面 TCR复合物及CD2结合，使其形成细胞表面的分子 簇化，促使细胞活化并诱导细胞分裂，为非特异性 多克隆活化剂。
优点：敏感性高，重复性好 缺点：需要特定设备，存在放射性污染
CCK8（Cell Counting Kit-8）检测 细胞增殖
Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）是由日本同仁化学 研究所（Dojindo）开发的检测细胞增殖、细胞毒性的试 剂盒，为MTT法的替代方法，CCK-8 试剂盒利用了日本同 仁化学研究所（Dojindo）开发的四唑盐——WST-8 (2(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)2H-四唑单钠盐)，它在电子耦合剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中 的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（ Formazan）。 生成的甲臜量与活细胞的数量成正比。 OD450可间接反映活细胞数量。
正置显微镜、倒置显微镜、离心机、酶标仪
实验流程
取脾脏
4h后 检测
制备单细 胞悬液
细胞培 养3天
加入 CCK8
实验步骤
I. 取小鼠脾脏、制备单个核细胞悬液、计算细胞 浓度。
II. Con A刺激细胞：将细胞浓度调节为 4x106 /mL，加入96孔板，每孔90μL，加入2.5 μ g/mL 的 ConA 溶 液 10 μL ， 细 胞 培 养 箱 （ 37℃ ， 5%CO2) 中 孵 育 72h 。 培 养 期 间 可 观 察细胞增殖情况。
T细胞在体外培养时，受到非特异性丝裂原 （如PHA、ConA）或特异性抗原刺激后， 可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、 细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞。
淋巴细胞增殖活力的高低可以反映机体的细 胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能 的指标之一。
刺激淋巴细胞增殖的物质
非特异性刺激物：植物血凝素（PHA ，刺激T 细胞）、刀豆蛋白A（ConA，刺激T细胞）、 PWM（刺激B、T细胞）、LPS（刺激B细胞） 、抗CD3抗体等。
CCK8（Cell Counting Kit-8）检测 细胞增殖
CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中,不需要预配各种成 分。CCK-8法是用于测定细胞增殖或细胞毒性试验中活细 胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。WST-8 法检测细胞增殖、细胞毒性实验的灵敏度比其它四唑盐如 MTT, XTT, MTS或WST-1高。由于CCK-8溶液相当稳定 ，并且对细胞没有毒性，因此可以长时间孵育。
T细胞根据功能/表面标志分类
I. 细胞毒T细胞（cytotoxic T cell）：消灭受感染的细胞。这 些细胞可以对产生特殊抗原ห้องสมุดไป่ตู้应的目标细胞进行杀灭。细胞 毒T细胞的主要表面标志是CD8。
II. 辅助T细胞（helper T cell）：它可以增生扩散来激活其它 类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。主要表面标志是CD4 。 T细胞调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能。它们是已 知的HIV的目标细胞，在艾滋病发病时会急剧减少。