流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin VPI双染色法

流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis) 本文主要讲述PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)PI（碘化丙啶）染色特点：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，二是不能通过功能正常的完整细胞膜。

基于以上特性，目前主要有两大方面的应用，配方也不同：细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)一方面的应用是检测细胞周期，检测细胞周期时，为了保证所有的细胞都能染上PI，因此要将细胞用乙醇固定，并加入Triton X-100 ，以增加膜的通透性；同时由于DNA使细胞的粘附性增大，加入EDTA以降低细胞粘附性；为了消除RNA的干扰，要加RNAase。

由于要鉴定DNA含量，因此PI染料必须过饱和，所以PI终浓度很高，一般50ug/mL。

由于晚期凋亡细胞DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。

另一方面的应用是检测膜通透性（凋亡），由于PI不能进入完整的活细胞膜，因此一般认为PI染色阳性的细胞是死细胞。

Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒中就是这种染液，它的作用是鉴定死细胞，从而与凋亡细胞区分开来。

它的配制就是将PI溶于PBS，终浓度较低，一般2.5ug/mL。

所需试剂：1、PI染液：用于检测细胞周期的PI配制如下：方法一：10×PI配制方法,用时用PBS稀释至工作液：5mg-----PI0.1ml---Triton X-1003.7mg--EDTA10ml----PBS2、RNaseA——2mg方法二,直接配制PI工作液：PI -----5mgRNaseA——2mg1.0%Trition X-100——0.25ml枸椽酸钠——100mg生理盐水——65ml调pH值至7.2-7.5加蒸馏水至100ml, 棕色瓶分装，保存在4℃操作步骤1.细胞培养铺细胞至6孔板或者35mm培养皿，约4－5*10e5 cells/well, 如果要加药物，在此时可以加以不同种或不同浓度的药物。

FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞一、实验目的a)了解凋亡细胞的变化及检测方法。

b)了解FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞的原理及方法。

二、实验原理a)细胞凋亡是细胞内由多个基因控制的死亡程序被活化而导致的细胞自杀（cell suicide）。

膜磷脂酰丝氨酸原来位于细胞膜的内部。

在细胞凋亡早期，细胞膜上的膜磷脂酰丝氨酸外翻与AnnexinV结合，使其被染成绿色。

在细胞凋亡晚期，细胞膜破裂，使得PI进入细胞当中与DNA结合，使其被染成红色。

b)细胞坏死（cell necrosis）：是由外部化学、物理或生物因素的侵袭而造成的细胞崩溃裂解，也被描述为细胞谋杀（cell murder）。

c)喜树碱（camp tothecin，CPT）是一种植物来源的抗肿瘤药物，可诱导肿瘤细胞凋亡。

d)Annexin V是一种可与磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）特异结合但不能通过正常细胞膜的物质。

碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一种发出红色荧光的DNA结合染料，也不能透过活细胞完整细胞膜。

e)细胞凋亡早期，细胞膜PS由膜脂双层内侧转位至外侧，FITC标记的AnnexinV（AnnexinV-FITC）即可与其结合，使细胞膜处呈绿色。

细胞凋亡中晚期，膜通透性变大，PI可进入细胞与核内DNA结合。

f)激光共聚焦显微镜（LSCM）以单色激光作为光源，并用附设光源针孔(pinhole)使光源成为点光源.除此之外，在检测器前方也有一个检测针孔，点光源对标本内焦平面上的每一检测针孔后的光电点扫描，标本上的被照射点在检测针孔成像，由倍增管或冷电耦合器件逐点或逐线接受，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像，光源针孔与检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔，焦平面以外的点不会在检测针孔成像，这就是所谓的“共聚焦”，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。

检测细胞凋亡的三种流式方法细胞凋亡（apoptosis）是细胞自主性死亡的过程，是正常细胞发育和组织调控的重要途径。

为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展出了许多方法来检测和定量细胞凋亡的发生。

其中流式细胞术（flow cytometry）是最常用的方法之一，根据不同的细胞特征和所需信息，可以有多种方法用于检测细胞凋亡。

下面将介绍三种常用的流式细胞术方法。

1. 荧光标记的Annexin V/PI双染法：Annexin V是一种细胞外结合蛋白，具有高度特异性结合细胞凋亡的特点。

当细胞凋亡发生时，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞内翻转至细胞外，而Annexin V能够结合在PS上。

Propidium Iodide（PI）能够穿过损伤的细胞膜，结合到细胞核内的DNA分子上。

通过将Annexin V标记为绿色荧光染料，将PI标记为红色荧光染料，通过流式细胞术定量测量荧光信号的强度，可以区分出未凋亡细胞（Annexin V和PI双阴性），早期凋亡细胞（Annexin V阳性，PI阴性），晚期凋亡和坏死细胞（Annexin V和PI双阳性）等不同状态的细胞。

2.荧光标记的DNA碎片染色法：3. 荧光标记的Caspase活性检测法：Caspases是细胞凋亡过程中的关键酶，它们在给定的信号下被激活并参与调节细胞凋亡的执行阶段。

通过使用荧光标记的Caspase底物，如FLICA系列（Fluorochrome Inhibitor of Caspases）、CaspGLOW系列（Caspase-Glo Kits），可以测量细胞中Caspase的活性。

这些底物在被Caspase酶剪切后会释放出荧光信号，通过流式细胞技术可以测量荧光信号的强度。

由于Caspase活性与细胞凋亡过程密切相关，因此可以利用这些荧光标记底物来定量测量细胞凋亡的发生。

总结起来，流式细胞术是一种非常有效的方法用于检测细胞凋亡的发生。

Annexin V/PI双染法可以定量测量不同状态的细胞，DNA碎片染色法可以测量细胞凋亡的程度，荧光标记的Caspase活性检测法可以测量细胞中Caspase的活性。

一、实验目的本实验旨在观察细胞凋亡的形态学特征，了解细胞凋亡的发生过程，为细胞凋亡的研究提供形态学依据。

二、实验材料1. 细胞培养：小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3细胞）；2. 试剂：H2O2（双氧水）、Annexin V-FITC、PI（碘化丙啶）、RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液；3. 仪器：倒置显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪、超净工作台、CO2培养箱。

三、实验方法1. 细胞培养：将小鼠胚胎成纤维细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的CO2培养箱中培养，待细胞生长至80%左右时，进行实验处理。

2. 实验分组：（1）正常组：不做任何处理，作为对照组；（2）凋亡组：加入0.8mol/L H2O2溶液处理细胞24小时。

3. 细胞染色：（1）Annexin V-FITC/PI双重染色：收集细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，加入Annexin V-FITC和PI，室温避光孵育15分钟；（2）H.E染色：收集细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，加入H.E染色液，室温避光孵育15分钟。

4. 细胞观察：（1）荧光显微镜观察：用荧光显微镜观察细胞凋亡形态学特征，包括细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等；（2）流式细胞仪检测：用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

5. 数据分析：采用SPSS软件对实验数据进行统计分析。

四、实验结果1. 荧光显微镜观察：凋亡组细胞出现细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等形态特征，与对照组相比，凋亡组细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。

2. 流式细胞仪检测：凋亡组细胞凋亡率显著升高（P<0.05），约为对照组的2倍。

五、实验讨论1. 细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，具有形态学特征，如细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等。

本实验中，凋亡组细胞出现这些形态特征，表明细胞凋亡已发生。

2. Annexin V-FITC/PI双重染色是一种常用的细胞凋亡检测方法，可以检测细胞凋亡率。

Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。

细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。

用标记了FITC的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。

Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。

将AnnexinⅤ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。

离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基；用冷PBS洗涤细胞两次；用400ul 1X?Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1 X 10 cells/ml；在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。

5. 加入10ul PI后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟；在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

使用流式细胞仪正确分析Annexin V-FITC/PI双染的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。

因为荧光补偿设置与PMT的电压直接相关，所以不同仪器之间的补偿不同。

（Annexin V－FITC）/ PI双染法检测肿瘤细胞坏死及凋亡情况：原理：细胞膜组分磷脂酰丝氨酸（PS）在正常情况下位于细胞膜内侧，当细胞坏死或凋亡时，则迁移至细胞膜外侧。

磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与PS具有高度的结合力。

荧光素FITC 标记的Annexin V 可以作为探针检测暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸，指示坏死或凋亡的细胞。

FITC-Annexin V结合到细胞后，在蓝色光的激发下，发出绿色荧光。

碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一种核酸染料，它不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染，而细胞膜保持完好的早期凋亡细胞则不会有红色荧光产生。

联合应用Annexin V-FITC和PI对培养体系中的细胞进行染色，Annexin V(-)/PI(-)代表健康活细胞，Annexin V(+)/PI(-)代表早期凋亡细胞，Annexin V(+)/PI(+)代表晚期凋亡细胞和坏死细胞，后两者之和即为受损细胞总量。

步骤：1．如上法构建杀伤体系靶细胞0.5ml、效细胞0.5ml，分别加入24孔培养板，置37℃、5％CO2培养箱中分别孵育3h、6h、12h；2. 把杀伤体系中的细胞培养液吸出至一合适离心管内（内含已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞）；3. PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶消化细胞，室温孵育至轻轻吹打可以使细胞吹打下来时，吸除胰酶，避免胰酶消化不够或消化过度；4. 加入收集的细胞培养液，轻轻吹打均匀，转移到离心管内，1000g 离心5min，弃上清，用1ml PBS轻轻重悬细胞并计数（细胞数量不少于1×105），然后1000g离心5min，收集细胞；5. 加入400μl 1×Binding Buffer 轻轻重悬细胞；6. 加入5μl AnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15 min；7. 加入10μl PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5min；8. 在30min内进行流式细胞仪检测，AnnexinV-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

流式测细胞凋亡原理
细胞凋亡是一种形态学特征独特的程序性细胞死亡方式，它在多种生理和病理状态下发挥重要作用。

流式细胞术可以用来分析和测量细胞凋亡，其中包括细胞表面标记物的检测和细胞染色。

流式细胞术是一种流式细胞仪结合荧光标记物的技术。

在细胞凋亡的研究中，最常用的荧光染料是亚碧菜素（annexin V）和PI（propidium iodide）。

亚碧菜素可以结合凋亡细胞表面的磷脂（phosphatidylserine），而PI则可以进入破损的细胞膜并结合DNA。

流式细胞术中，细胞样本首先经过适当的处理，如细胞固定和染色，以保持细胞形态并增强荧光信号。

然后，样本通过流式细胞仪中的流动通道，单个细胞经过激光束的照射而产生荧光信号。

流式细胞仪会同时检测和记录细胞的形态学特征和荧光信号。

在细胞凋亡的测量中，亚碧菜素和PI的荧光信号用于区分不同类型的细胞。

在正常细胞中，磷脂位于细胞膜的内侧，不会结合亚碧菜素。

而在凋亡细胞中，磷脂外露到细胞膜的外侧，可以与亚碧菜素结合。

通过检测亚碧菜素的荧光信号，可以确定凋亡细胞的比例。

同时，PI的荧光信号用于鉴定破损的细胞，因为PI只能进入破损的细胞并结合DNA。

通过流式细胞术，可以获得细胞凋亡的定量信息，例如凋亡细
胞的比例和凋亡细胞的亚型。

这对于研究细胞凋亡的机制以及相关疾病的发生和发展具有重要意义。

流式检测细胞凋亡A n n e x i n V检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的D N A断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)B r d U F l o w K i t s检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)A n n e x i n V检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。

它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。

在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。

Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。

由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。

因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。

实验用品1. 一次性12⨯75mm Falcon试管。

2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8︒C保存。

3. 微量加样器和加样头。

4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10⨯，使用时，用稀释为1⨯浓度的应用液。

磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS 可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。

磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。

体内的吞噬细胞可通过识别磷脂酰丝氨酸来清除凋亡细胞。

Annexin-V（green）是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合，细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期坏死细胞可能为阴性），是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。

将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

PI和Annexin-V双标：碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

*注意：细胞凋亡时其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。

在分析结果时应该注意。

活细胞不能被Annexin V-FITC或PI染色（右图左下象限）。

早期凋亡细胞因磷脂酰丝氨酸的暴露及具有完整细胞膜，故呈Annexin V-FITC染色阳性及PI染色阴性（右图右下象限）。

坏死或晚期凋亡的细胞呈Annexin V-FITC及PI染色双阳性（右图右上象限）。

*注意：未处理的对照细胞进行常规培养的过程中也有一小部分的细胞死亡发生。

悬浮细胞的染色：Ⅰ、将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5×106）用PBS洗2次，加入200μlBinding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10μl及PI(50ug/ml)5μl,室温避光30min,加入400μlPBS，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1小时），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

流式细胞仪1，使用特定的方法诱导细胞凋亡，设置一个没有处理的control组2，在一定孵育期后收获细胞，用冰冷的PBS清洗3，准备1X的annexin结合液，例如，对于10个实验来说，加1ml 5X annexin 结合液（组分C）到4ml 去离子水中4，准备一个100ug/ml的PI工作液，例如，通过稀释5ul 1mg/ml的PI储存液（组分B）到45ul 1X annexin 结合液中。

没有使用的这部分工作液用于以后的实验。

5，再次离心2步骤中洗过的细胞，弃上清用1X annexin 结合液重悬。

调整细胞密度，用1X的annexin 结合液稀释到大约1x106/ml，为每个实验准备100ul 足够的体积。

6，加5ul Alexa Fluor 488 annexin V(组分A)和1ul 100ug/ml PI工作液（4步骤中准备的）到每100ul的细胞悬液中。

7，室温孵育细胞15min.显微镜观察1，使用特定的方法诱导细胞凋亡，设置一个没有处理的control组2，在一定孵育期后收获细胞，用冰冷的PBS清洗3，准备1X的annexin结合液，例如，配置1ml，加200ul 5X annexin 结合液（组分C）到800ul去离子水中4，准备一个100ug/ml的PI工作液，例如，通过稀释5ul 1mg/ml的PI储存液（组分B）到45ul 1X annexin 结合液中。

没有使用的这部分工作液用于以后的实验。

5，再次离心2步骤中洗过的细胞，弃上清用1X annexin 结合液重悬。

调整细胞密度，用1X的annexin 结合液稀释到大约1x106/ml，为每个实验准备足够的体积。

6，加5-25ul的annexin V缀合物（组分A）和1-2ul(100ug/ml)PI工作液到100ul 的细胞悬液中。

高浓度的annexinV缀合物会产生较好的结果；最佳染色浓度需要凭借经验7，室温孵育细胞15min8，1X annexin 结合液清洗细胞9，用一个合适方法使细胞固定在载玻片上，用一个适当的滤镜观察荧光效果。

流式检测凋亡的讨论2010-07-15 14:28 来源：丁香园点击次数：15397 关键词：流式检测凋亡关于凋亡的流式检测wanhood一、PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。

这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1.细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。

研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。

许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。

在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。

在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。

此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。

细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。

但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。

因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。

根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。

也可用于活细胞的分类。

试剂与仪器PBS溶液（配制方法见附录）；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。

用棕色瓶4℃避光保存。

70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1.收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。

流式细胞仪检测细胞凋亡的原理一、原理在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V进行荧光素(EGFP、FITC)标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

二、注意事项1、必须活细胞检测,不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。

2、特殊细胞的染色方法:在消化或吹打时,有些细胞(如神经元细胞)很容易受到损伤,导致晚期凋亡或坏死比例非常高,不能反映真实结果。

实验的解决方法:先低速离心,吸取细胞培养板中的液体,留少许液体,加入适量PI和Annexin-V染色10min后,将漂浮细胞吸至离心管中,离心洗涤两次,用PBS漂洗贴壁细胞两次,加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中,离心洗涤,再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测。

应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例,增加早期凋亡细胞比例。

3、由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白,只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大,因而在消化细胞时,建议一般不采用含EDTA的消化液。

4、必须设置阴性对照和补偿对照(分别单染)。

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源：易生物实验浏览次数：197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

关键词：细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。

因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×）60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。

1、Q： Annexin V R-PE 20 tests是BD公司用于凋亡流式检测的试剂盒，产品显示种属为人，请问能否用于大鼠细胞的检测？A：可以。

因为Annexin V是与PS亲和，而PS在不同种属间应该没差异。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

2、Q：用流式作细胞凋亡为什么跟tunel差别那么大啊？？tunel测出来的细胞凋亡率大概有30%而作流式测出来的凋亡率只有2%（阴性对照0.5%）差别好大啊，用的是beckman公司的Annexin V /PI双染试剂盒，实验步骤如下：（1）胰酶消化贴壁细胞，加培养基中止，离心1000转5min（2）吸去上清，PBS0.5ml 重悬细胞（因为要送到别处作流式，期间路程约1h，户外温度约37度）（3）然后加入Annexin V /PI各5微升，避光20min，上机。

请问这是什么原因导致的？A：我也用这两种方法做过凋亡，是存在两种方法测的凋亡率差别有点大，但还没有大到你这样的程度。

双染测的是凋亡的早期事件PS外翻。

TUNEL测的是凋亡最晚期的事件DNA 片段化。

而且TUNEL在检测过程中，把操作损伤细胞和坏死细胞当作了凋亡细胞，而且如果TUNEL是肉眼计数的话，也会有判断上的误差，所以，往往TUNEL作出来的凋亡率高一点。

但如果凋亡率达到30%，ladder估计也应该跑的出来。

双染虽然是机器操作，但在调试补偿时，人为的影响还是挺明显的，也不是特别的客观。

a n n e i n v和p i染色步骤及注意事项The latest revision on November 22, 2020磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。

磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。

体内的吞噬细胞可通过识别磷脂酰丝氨酸来清除凋亡细胞。

Annexin-V（green）是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合，细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期坏死细胞可能为阴性），是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。

将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测的发生。

PI和Annexin-V双标：碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

*注意：时其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。

在分析结果时应该注意。

活细胞不能被Annexin V-FITC或PI染色（右图左下象限）。

早期凋亡细胞因磷脂酰丝氨酸的暴露及具有完整细胞膜，故呈Annexin V-FITC染色阳性及PI染色阴性（右图右下象限）。

坏死或晚期凋亡的细胞呈Annexin V-FITC及PI染色双阳性（右图右上象限）。

*注意：未处理的对照细胞进行常规培养的过程中也有一小部分的细胞死亡发生。

一文掌握AnnexinV-FITCPI细胞凋亡实验方法一、技术原理细胞凋亡（apoptosis）是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制控制，按照自身程序主动性、生理性的死亡过程。

细胞凋亡受凋亡相关基因调控，故又称为程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。

一般来说，凋亡早期，主要涉及胞内一些蛋白的变化，例如蛋白量的增高、位置的迁移、状态的改变等，还有一些磷脂、Ca2+的变化等；中晚期则伴随着DNA的断裂、凋亡小体的形成；而细胞形态的改变则伴随着整个凋亡过程。

二、产品应用目前可以采用单染色法和双染色法对细胞进行染色，流式细胞仪检测或荧光显微镜观察来检测细胞凋亡，其中Annexin V/PI法是当下较为流行的检测细胞凋亡的方法。

正常细胞中，磷脂酰丝氨（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡细胞中，PS会从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。

用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生；碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。

因此将Annexin-V 与PI结合使用，就可以检测出细胞群体中的早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞。

Apoptosis-AnnexinV 检测示意图碘化丙啶PI检测示意图三、使用方法1悬浮细胞，2000rpm离心5min收集细胞;对于贴壁细胞，要用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短(过长细胞膜破碎，造成假阳性，过短，细胞黏连影响检测)最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶消化液，加入细胞培养液终止消化，，2000rpm离心5min收集细胞；24℃预冷PBS，洗涤细胞2次（2000rpm x 5min）,收集细胞2～5×105 ；3离心弃上清，加入500μL结合缓冲液，轻轻吹打重悬细胞；4加入5μL Annexin V-FITC，轻轻吹打混匀，加入5μL PI 轻轻吹打混匀,室温避光孵育5-15min。

Annexin V—FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒一、概述在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS)由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。

AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

因此,将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V—/PI—）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI—）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。

图 Annexin V 检测细胞凋亡原理产品名称规格100testsAnnexin V-FITC Apoptosis DetectionKit I产品组成成分:Annexin V Binding Buffer， 10X conc (51—66121E)Annexin V—FITC （51—65874X）Propidium Iodide Staining Solution(51—66211E)三、实验步骤贴壁细胞需用0。

25％的胰酶消化。

注意过度消化可损伤细胞。

在消化时可加2%的BSA可防止消化过度。

如果用含EDTA的胰酶消化时,注意必须彻底清除EDTA:在标记前用1×PBS或1×bindingbuffer洗涤,清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2＋螯合，影响Annexin V的结合。

AnnexinV-FITCPI双染法流式细胞术检测细胞凋亡看到来我们眼科公共平台来使用Fortessa检测凋亡时，看到很多人都是泪流满面，鉴于此，作者大找网络资源结合自己的理解，针对普遍的问题给眼科的童鞋们一个交代，期待对大家有用，期待大家板砖！！Reference1. Galluzzi L, Aaronson SA, Abrams J, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ 2009; 16:1093-107.一、原理在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞早期凋亡的发生。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V与PI（7-AAD也可以）匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

二、注意事项1．Annexin V-EGFP，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。

2． Propidium Iodide （PI）有毒，操作时要戴手套。

3．推荐使用悬浮培养细胞，如果是贴壁细胞，用胰酶消化不当，会引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。