欧洲鳗血清免疫球蛋白纯化及部分特性分析

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牙鲆血清免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析

牙鲆血清免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析刘云;孙峰;姜国良【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2007(14)4【摘要】运用Sephacryl S-200凝胶层析和HiTrap rProtein A Sepharose亲和层析2种方法对牙鲆(Paralichthys olivaceus)血清免疫球蛋白进行分离纯化,结果表明,牙鲆免疫球蛋白分布于33%～50%的硫酸铵饱和溶液中,其中45%的分离效果最好.凝胶层析和亲和层析样品均出现2个蛋白峰,用还原SDS-PAGE检测确定牙鲆免疫球蛋白存在于第2个蛋白峰中.牙鲆免疫球蛋白重链分子量约为75.4 kD,轻链分子量约为29.9 kD和28.2 kD,推测牙鲆血清免疫球蛋白的分子量为836 kD.制备了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体,免疫双扩散法检测多克隆抗体效价为1:32,免疫斑点法检测多克隆抗体效价至少为1:1 600.运用免疫印迹法(Western-bloting)检测了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体的特异性,实验证明该抗体与牙鲆全血清中免疫球蛋白重链、轻链反应均成阳性.【总页数】7页(P547-553)【作者】刘云;孙峰;姜国良【作者单位】中国海洋大学,海洋生命学院,山东,青岛,266003;中国海洋大学,海洋生命学院,山东,青岛,266003;大连自然历史博物馆,辽宁,大连,116023;中国海洋大学,海洋生命学院,山东,青岛,266003【正文语种】中文【中图分类】Q59.486【相关文献】1.牙鲆孵化酶的分离纯化及其部分生物化学性质研究 [J], 史振平;樊廷俊;丛日山;汤志宏;汪小锋;付永锋2.牙鲆皮肤黏液免疫球蛋白的纯化及部分特性分析 [J], 许国晶;绳秀珍;唐小千;邢婧;战文斌3.中华鲟、史氏鲟及达氏鳇血清免疫球蛋白的纯化及部分特性分析 [J], 刘红柏;张颖;杨雨辉;叶继丹;孙大江4.欧洲鳗血清免疫球蛋白纯化及部分特性分析 [J], 林天龙;陈强;俞伏松;杨金先;龚晖;林能锋;许斌福;伊光辉5.鲈血清免疫球蛋白分离纯化及部分特性分析 [J], 张福淼;杨桂文;李国田;曹善东;安利国因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定

I 血液及组织样品的制备分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。

掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。

一、血液样品(一）采血测定用的血液，多由静脉采集。

一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。

(二）血清、全血及血浆的制备1.血清的制备血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。

制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。

将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。

为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。

2.全血及血浆的制备取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。

每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。

将已抗凝的全二于2，000r / min 离心10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。

血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。

3.抗凝剂凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。

抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。

（1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。

每毫升血液用1-2mg 即可。

配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃烘箱烤干（若超过150 ℃则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。

1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质

11316 温度对酶活性的影响按 11313 方法在不同温度下测定酶活力 ,确定酶的最适温度 ,另外将蛋
白酶溶液于不同温度保温 ,每隔 15 min 取样并迅速冷却到室温 ,再测定酶的活力 ,确定温度对酶活力影响。 11317 p H对酶活力的影响分别以不同 p H 的缓冲液配制底物并稀释酶液 ,再按 11313 方法测定酶活力 ,确定酶的最适 p H。 11318 酶抑制剂及金属离子对酶活力影响将各种酶抑制剂及金属离子分别加入到酶溶液中 ,于 25 ℃保持 10 min ,再用常规方法测定酶活力 ,并计算酶的活力剩余。
(2) D EA E Sep harose Fast Flow 层析将透析
第 4 期陈吉祥等 :1 种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质 3 19
液直接加入经 0102 mol/ L p H 7. 8 Tris2HCl 缓冲液平衡好的 D EA E - Sep harose Fast Flow 柱 (110 cm × 15 cm) ,用含 0～0. 5 mol/ L NaCl 的相同缓冲液梯度洗脱 ,流速 24 mL/ h ,每管 1 mL 收集洗脱液 ,测定蛋白吸收和酶活力。
113 实验方法 11311 细菌培养及胞外产物获得细菌的培养用 2216 E 海水液体培养基 ,培养温度 28 ℃,培养时间 24 h ,振荡频率为 180 r/ min 。培养物于 4 ℃ 5 000 r/ min 离心 10 min ,收集上清液 ,再分别用 0145 μm 和 0120μm 滤膜过滤 ,滤液 - 20 ℃保存备用。 11312 酶的分离纯化
2 结果
211 鳗弧菌蛋白酶的分离纯化鳗弧菌蛋白酶粗酶液经硫酸铵盐析后 ,在
D EA E2Sep harose 柱层析中 ,酶活力集中在第 2 峰 , 在 Sep hadex G100 柱层析中的酶活力集中于第 2 峰 ,酶的分离纯化结果见表 1 ,纯化后蛋白酶的比活性为 2196 ×105 U/ mg ,纯化倍数 4142 ,酶的收率为 25123 %。 212 酶的分子量测定

1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质(精)

第 9卷第 4期 2002年 12月中国水产科学Journal of Fishery Sciences of ChinaVol. 9No. 4Dec. , 20021种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质陈吉祥 , 刘霜 , 李筠 , 王祥红 , 杜宗军 , 于德华 , 纪伟尚 , (青岛海洋大学海洋生命学院 , 达尔文实验室 , 山东青岛 266003摘要 :从山东省莱州海区自然发病的花鲈 (L ateolobrax japanicus 体内分离到 1株致病性鳗弧菌 , 经硫酸铵盐析、DEAE 2Sepharose Fast Flow 和 Sephadex 2G 100凝胶层析等方法从其培养液中分离纯化了 1种胞外蛋白酶。

用 SDS 2PA GE 电泳测得蛋白质的分子量为3617kD , 酶的最适温度为 50℃ , 对热不稳定 ,70℃ 15min 完全失去活力 ; 最适 p H 为 710;1mmol/L 的 PMSF 对酶活性无影响 , 部分金属离子如 Cu 2+、 Fe 2+、 Fe3+、 Zn 2+对酶活力有抑制作用 , 而 Ca 2+对酶有一定程度的激活作用 ,1mmol/L EDTA 能完全抑制酶的活性 , 表明该酶是 1种金属蛋白酶。

关键词 :鳗弧菌 ; 胞外蛋白酶 ; 分离纯化 ; 理化性质中图分类号 :S941142文献标识码 :A -8737-05收稿日期 :2001-11-221基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (39870581 ; 英国达尔文项目(162/8/065 1作者简介 :陈吉祥 (1963- 男 , 副研究员 , 博士后 , 从事海洋微生物学与免疫学 1子 , 已从霍乱弧菌、创伤弧菌 -3][4]从 11种胞外蛋白酶 , 证明其对虹鳟 ;Lamas [5]利用鳗弧菌及其胞外蛋白产物对虹鳟进行腹腔注射后 , 虹鳟表现出极为相似的症状。

肖慧等 [6]从山东沿海养鱼场发病鱼的体内分离到 1株致病性鳗弧菌 , 感染实验表明该菌株对花鲈 (L ateolabraxjapanicus 等海水养殖鱼类有较强的致病性 , 常伴有严重的血管出血及组织损伤、出血等病症。

盐浓度对欧洲鳗肌原纤维蛋白理化性质和凝胶形成性能的影响

杨玉，李婕妤，石林凡，等. 盐浓度对欧洲鳗肌原纤维蛋白理化性质和凝胶形成性能的影响[J]. 食品工业科技，2023，44（17）：68−75. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022100301YANG Yu, LI Jieyu, SHI Linfan, et al. Effects of NaCl Concentration on Physicochemical Properties and Gel-forming Ability of Myofibrillar Protein from European Eel[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(17): 68−75. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022100301· 研究与探讨 ·盐浓度对欧洲鳗肌原纤维蛋白理化性质和凝胶形成性能的影响杨　玉1，李婕妤2，石林凡2，任中阳2，翁武银2, *（1.福清市产品质量检验所，福建福清 350300；2.集美大学海洋食品与生物工程学院，鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建厦门 361021）摘　要：为探究盐浓度对欧洲鳗肌原纤维蛋白热诱导凝胶形成性能的影响，测定了蛋白的浊度、表面疏水性和活性巯基的变化，考察了0.1、0.3、0.5 mol/L 的NaCl 浓度下的肌原纤维蛋白热诱导凝胶的性质。

结果表明，欧洲鳗肌原纤维蛋白的浊度、表面疏水性和活性巯基分别在30、35和40 ℃开始增加。

随着NaCl 浓度的增加，肌原纤维蛋白的热吸收峰温度降低，而储能模量和损耗模量增加。

0.5 mol/L NaCl 溶解的欧洲鳗肌原纤维蛋白热诱导凝胶破断强度为98.81 g ，高于低浓度NaCl 溶解的蛋白热诱导凝胶。

四种海水养殖鱼类血清免疫球蛋白的分离纯化及分子量测定

四种海水养殖鱼类血清免疫球蛋白的分离纯化及分子量测定冯娟;胡超群【期刊名称】《热带海洋学报》【年(卷),期】2002(021)004【摘要】利用Protein A-sepharose亲和柱层析一步法,首次分离纯化了4种海水养殖鱼类(3种暖水性鱼类:紫红笛鲷Lutjanus argentimaculatus、青石斑鱼Epinephelus awoara、尖吻鲈Latescalcarifer和1种冷水性鱼类牙鲆Paralichthys olivaceus)血清中的免疫球蛋白(Ig).3种暖水性鱼类Ig的分离效果较好,牙鲆较差.层析曲线的洗脱峰值说明牙鲆血清的Ig同紫红笛鲷、青石斑鱼、尖吻鲈3种暖水性鱼类血清的Ig在结构和功能上有明显的差异.通过SDS-PAGE电泳测得其重链分子量分别为紫红笛鲷79.5 kDa和75.0 kDa、青石斑鱼77.2 kDa、尖吻鲈81.8kDa和75.7 kDa,牙鲆73.5 kDa;轻链分子量分别为30.1 kDa、31.1 kDa、29.7 kDa和15.0kDa.【总页数】6页(P8-13)【作者】冯娟;胡超群【作者单位】中国科学院南海海洋研究所,广东,广州,510301;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300;中国科学院南海海洋研究所,广东,广州,510301【正文语种】中文【中图分类】S942.5;Q512.2【相关文献】1.四种方法对鲢血清免疫球蛋白的纯化及分子量测定 [J], 孙军;高谦;聂品2.4个品系罗非鱼血清免疫球蛋白的分离纯化及分子量测定 [J], 赵飞;柯剑;姜兰;谭爱萍;吴雅丽;薛慧娟3.灵芝菌丝体多糖的分离纯化及其单糖组成分析与分子量测定 [J], 王海燕;戴军;陈尚卫4.四种常见海水养殖鱼类配合饲料投喂效果的比较研究 [J], 钟明杰;李仁伟;洪志翔5.四种海水养殖鱼类血清转铁蛋白多态性的初步研究 [J], 李明云;张春丹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

四种鱼的血清、体表黏液SDS-PAGE分析

四种鱼的血清、体表黏液SDS-PAGE分析张婷;史晋绒;赵田田;宋柯;解崇友;岳兴建【摘要】鱼类的血清和体表黏液在其适应复杂水体环境的生理生化反应中起着重要的作用.为了解鱼类血清和体表黏液的蛋白组分与含量的差异,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对体表黏液丰富的宽体沙鳅Sinibotia reevesae、中华沙鳅S.superciliars、长薄鳅Leptobotia elongata及南方鲇Silurus meridionalis四种鱼的血清与体表黏液的蛋白组分展开研究,共获得158条蛋白区带,其中血清67条,体表黏液122条,其分子量在10.92 ～ 194.48 kD之间.聚类分析显示宽体沙鳅血清蛋白与中华沙鳅的相似度最高(0.67),与南方鲇的相似度最低(0.40).四种鱼的血清蛋白组分的差异体现了其在进化上的亲缘关系.而体表黏液蛋白组分中中华沙鳅与南方鲇的相似度最高(0.53),与长薄鳅的最低(0.47),未呈现出与血清类似的遗传分化规律.【期刊名称】《四川动物》【年(卷),期】2015(034)006【总页数】5页(P880-884)【关键词】血清;体表黏液;SDS-PAGE;蛋白组分【作者】张婷;史晋绒;赵田田;宋柯;解崇友;岳兴建【作者单位】内江师范学院生命科学学院,长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室,四川内江641112;内江师范学院生命科学学院,长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室,四川内江641112;内江师范学院生命科学学院,长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室,四川内江641112;内江师范学院生命科学学院,长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室,四川内江641112;内江师范学院生命科学学院,长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室,四川内江641112;内江师范学院生命科学学院,长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室,四川内江641112【正文语种】中文【中图分类】Q959.4;Q954鱼类生活在水体环境中，有着复杂的生理生化反应，血清和体表黏液对于鱼类适应变化的环境有着重要的意义。

鳗弧菌_Vibrioanguillarum_胞外产物中蛋白酶的纯化及其性质

依据洗脱曲线 , 将每一纯化步骤中 D280 nm较高者进行 SDS2PAGE 分析 , 凝胶组成为 : 10 % T/ 3. 5 % C. 电泳完毕 , 凝胶以 0. 05 % 考马斯亮兰 R2250 (Sigma) 染色 , 染色液组成为 : VCH3OH VCH3COOH V H2O = 5 1 5 , 脱色液组成为 : VCH3CH2OH VCH3COOH V H2O = 5 7 88. 标准蛋白标识物 (promega) 组成为 : 磷酸化酶 B ( Mr 97. 4 ×103) , 牛血清白蛋白 ( Mr 66. 2 ×103) , 卵清白蛋白 ( Mr 42. 7 ×103) , 碳酸酐酶 ( Mr 31. 0 ×103) , 溶菌酶 ( Mr 14. 4 ×103) .
应用与环境生物学报 2002 ,8 (4) :414～418 Chin J Appl Environ Biol = ISSN 1006 - 687X
2002208225
鳗弧菌 ( Vibrio anguillarum) 胞外产物中蛋白酶的纯化及其性质
魏玉西 3 汪靖超程殿林徐永立 1
4 期
魏玉西等 : 鳗弧菌 ( Vibrio anguillarum) 胞外产物中蛋白酶的纯化及其性质
415
行之有效的纯化方法.
1 材料和方法
1. 1 菌株与培养条件鳗弧菌 ( V . anguillarum) 菌株系从山东威海海域
染病的牙鲆 ( Paralichtys olivaceus) 鱼体分离 ,培养条件同文献[ 5 ] . 1. 2 胞外产物的制备
(U) . 1. 5 蛋白酶的纯化
除非特别说明 ,一切操作均在 4 ℃下进行. 1. 5. 1 (NH4) 2 SO4沉淀 100 mL ECP 液在慢慢搅动下加入 (NH4) 2SO4固体 ,使之达 80 %饱和度 ,并连续搅拌 1 h ,以冷冻离心机离心 ( n = 10 000 r/ m , t = 15 min) ,沉淀部分加 0. 01 mol/ L PBS (pH 7. 0) 溶解后对相同缓冲液透析 24 h ,再以聚乙二醇浓缩至约 3 mL. 冷藏 ,待后续处理. 1.5. 2 Sephadex G2100 柱色谱先以 0. 01mol/ L PBS(pH 7. 0) 平衡色谱柱 (2. 0 ×70 cm) ,上样 2 mL ,以 0. 01mol/ L PBS (pH 7. 0) 洗脱 , 控制流速为 0. 5 mL/ min ,部分收集 ,每管 3 mL. 同时以紫外检测仪 (上海沪西 ,HD22121 型) 测 D280 nm ,绘制洗脱曲线. 1. 5. 3 DEAE2Sepharose 柱色谱 DEAE2Sepharose 柱 (1. 2 ×30 cm) ,先以 20 mmol/ L Tris (pH 7. 4) 平衡. 将 (B) 中所得洗脱曲线中蛋白酶活力高者合并、上柱 , 以 0. 01～0. 5 mol/ L NaCl/ 20 mmol/ L Tris (pH 7. 4) 进行梯度洗脱 ,部分收集 ,测吸光度并绘制洗脱曲线. 1. 5. 4 DEAE2Cellulose 柱色谱 DEAE2Cellulose 柱

欧洲鳗鲡免疫球蛋白阳性细胞的组织化学定位与分布特点

２００８年８月
华
中
农
业
大
学
学
报
Ｖｏ．７Ｎｏ４１２．
Ａｕ．２０，０￣５５ｇ０８５００
ＪｕｎｌｆＨｕｚｏｇＡｇｉｕｔｒｌｉｅｓｔｏｒａａｈｎｒｃｌａｖｒｉｏｕＵｎｙ
作用Ｅ。Ｉ平可作为鱼类疾病诊断、防、疫以及相关免疫细胞的研究极少，见有关鳗鲡淋巴ｇ水预免仅
保护效果的指标，当受到病原微生物感染以及维生细胞表面存在不同的Ｉｇ以及欧鳗淋巴细胞体外转＿３９～欧素Ａ、聚糖、壳酵母细胞等免疫增强剂刺激时，清化试验条件建立的相关报道ｌｏ。目前，鳗血清血中Ｉ平会明显升高，体的免疫保护率与血清抗Ｉｇ水鱼ｇ多克隆和单克隆抗体已有制备＿］但未见相关１，体水平呈明显正相关＿］２。免疫组化研究表明，类免疫组化的研究报道。对鳗鲡Ｉ＋胞的组织定位 ≈ 鱼ｇ细Ｉｇ阳性（ｇ）胞主要在肾脏和脾脏分布较多，Ｉ＋细在以及相关淋巴组织特性的研究将有助于深入了解鳗肠和鳃也有分布，在胸腺分布较少Ｅ。而］鲡的免疫应答机理。为此，本试验运用蛋白Ａ亲和鳗鲡（ｇｉｌ）欧洲和亚洲各国广泛养殖的层析法分离纯化了欧鳗血清Ｉ，备了特异性兔抗Ａｎｕｌ是ａｇ制

医学专题血清白球蛋白的离纯化及鉴定整理后

分离纯化的一般程序
选择材料破碎细胞
提取（预处理）分离纯化（粗分级，细分级）分析及鉴定
实验目的
通过从血清中分离、纯化、鉴定血清白蛋白和γ-球蛋白的实验，培养学生综合应用盐析、离心、色谱、电泳分光等技术来分离纯化特定蛋白质的技能。
实验原理
1. 初分级: 血清经饱和硫酸铵盐析后获得白蛋白粗分离样品和球蛋白粗分离样品。
• 影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。 • 逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。
操作
一、盐析
－－白蛋白、γ球蛋白的粗分离
<1> 取0.5ml血清 <2> 取0.5ml饱和(NH４)２SO４溶液，
缓慢滴入，边加边摇。 <3> 混匀后于室温中放置10分钟。 <4> 8000r/min×10min <5> 小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。 <6> 沉淀加0.5ml蒸馏水，使之溶解，作为纯化 γ球蛋白
用。
2. 脱盐
盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵离子成分，样品中含有过高的离子浓度会影响离子交换层析的效果，所以在用离子交换层析进行细分级前需要脱盐。
凝胶色谱法是一个温和而又快速的脱盐方法，同时可将蛋白质转换到用于离子交换层析的低离子强度缓冲液中。
凝胶过滤的原理
洗脱液中蛋白质及盐分的检查
取96孔板一块，上四排加20％磺基水杨酸，下三排加BaCl2液。
从下端管口取1滴洗脱液，滴于20％磺基水杨酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，开始收集蛋白样品。
从下端管口取1滴洗脱液，滴于BaCl2中，出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。
二、G-25凝胶层析脱盐

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文章编号:1000-0615(2001)01-0052-06收稿日期:2000 03 14资助项目:福建省科委重点项目、回国留学人员A 类资助项目(97-2-139)第一作者:林天龙(1955 ),男,福建福州人,研究员,主要从事鱼类免疫学、病原学研究。

Tel :0591 *******,E mail:lint@欧洲鳗血清免疫球蛋白纯化及部分特性分析林天龙1, 陈强2, 俞伏松1, 杨金先1, 龚晖1, 林能锋1, 许斌福1, 伊光辉3(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州 350003;2.福建省农业科学院地热农业利用研究所,福建福州 350003;3.华中农业大学水产学院,湖北武汉 430070)摘要:采用饱和硫酸铵分步盐析法结合柱层析提取、纯化欧洲鳗血清免疫球蛋白(Ig),实验证实欧洲鳗Ig 主要分布在硫酸铵饱和度30%-50%的区间内;Sephacryl-S200进一步提纯的Ig 主要存在于第一个蛋白峰;而Sepharo s e-4B 柱层析提纯的Ig 则存在于第二个蛋白峰;DEAE-52离子交换柱层析可进一步纯化Sepharose -4B 柱层析的产物;ELISA 和Western-blot 分析证实上述提取物具有抗体的免疫学活性;SD S-PAGE 分析纯化的Ig,显示欧洲鳗Ig 重链约为68kD 、轻链约为26kD 。

关键词:欧洲鳗;免疫球蛋白;纯化中图分类号:S917 文献标识码:A Purification and partial characterization ofserum immunoglobulin in Anguilla anguillaLIN Tian long 1, CHEN Qiang 2, YU Fu song 1, YANG Jin xian 1, GONG Hui 1,LIN Neng feng 1, XU Bin fu 1, YI Guang hui 3(1.A nimal H usbandry and Veterina ry Me dicine Institute,Academy o f Agricultu r a l Sciences ,Fu z hou 350003,China;2.Geothermic U tilization Institute ,Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003,China;3.Fisheries College,Huazhon g Agricultural University ,Wuhan 430070,China)Abstract:The purification of serum immunoglobulin in European eel(Anguilla anguilla)was carried out by using ammonium sulfate precipitation followed by column chromatography.The results showed that most of the eel serum Ig was precipitated at 30%to 50%ammonium sulfated saturation.Further purification by Sephacryl-S200showed that the Ig presented in the first protein peak ,and by Sepharose 4B the eel Ig existed at the second protein peak;the purified production from Sepharo se 4B were further separated by DEAE 52column into two fractions,and the Ig was found in the first fraction.The antibody activity of the productions stated above was proved by ELISA and Western blot.SDS PAGE showed that the heavy chain and light chain of the eel serum Ig were 68kD and 26kD respec tively.Key word:Anguilla anguilla;immunoglobulin;purification鱼类是低等的脊椎动物,其免疫系统不如高等脊椎动物那样完善。

尽管鱼类免疫学的研究起步较第25卷第1期2001年2月水产学报JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Vol.25,No.1Feb.,2001晚,但近几年的研究发现,多数硬骨鱼都有类似于高等脊椎动物的免疫器官与免疫效应细胞,能产生类似高等脊椎动物IgM 的免疫球蛋白,人们已经证实在鲑(Salmo salar )、(Ictalurus punctatus )、鲟(Acipenser baeri)、鳜(Sinip erca chuatsi)、鲤(C yprinus carpio )等鱼类中Ig 的存在[1-4]。

此外,还发现鱼类的鳃、肠道、皮肤粘液和鱼卵中也存在类似的Ig [5-9]。

这些免疫球蛋白在鱼体的免疫防御中起着十分重要的作用,在鱼病防制和鱼类疫苗学研究方面也具有重要意义[10]。

欧洲鳗(Anguilla anguilla)作为近几年我国水产养殖的主要品种之一,其免疫学研究几乎处于空白状况,伴随大规模集约化养殖而来的是暴发性、毁灭性疾病的漫延,严重打击了养殖户的生产积极性。

要从根本上解决这些问题,必需将免疫预防手段引入到欧洲鳗养殖业,积极开展欧洲鳗基础免疫学研究,建立欧洲鳗体液免疫和细胞免疫水平的分析检测手段,建立快速、特异、准确的病原学检测方法,为鱼类疫苗学、鱼类预防医学研究奠定基础。

为此,我们分离纯化了欧洲鳗的血清免疫球蛋白(Ig ),并对其特性进行了初步研究与分析。

1 材料与方法1.1 实验动物与菌株欧洲鳗体重150~180g,取自长乐市顺德养殖场,室温暂养于40L 水族箱中,日换水约1/3,观察一周后用于实验。

新西兰大白兔是由福建省药检所提供的标准实验动物(合格证23-004号);温和气单胞菌(本所研究中心分离),大肠杆菌(福建省卫生防疫站惠赠)。

1.2 欧洲鳗血清抗体的制备与纯化1.2.1 欧洲鳗血清制备健康鳗经250 10-6的MS-222(Sigma)麻醉后,由后腹主动脉采血,全血置4 ,待血清充分析出后,以5000r min -1离心10min,收集血清,-20 冻存备用。

1.2.2 饱和硫酸铵分步盐析欧洲鳗血清用2倍量的生理盐水稀释后,加入pH 7.0的饱和硫酸铵,使其最终饱和度为30%,4 静置过夜,10000r min -1离心5min,沉淀用0.01mol L -1PBS (pH 7.4)重悬(30%饱和硫酸铵提取物),上清继续加入饱和硫酸铵至终浓度为50%,同上处理,重悬沉淀(50%饱和硫酸铵提取物),以PBS 透析除盐,-20 保存备用。

1.2.3 柱层析提纯Sephacryl-S200柱层析:盐析法所得的50%饱和硫酸铵提取物通过Sephacryl-S200(Pharmacia)柱层析进一步纯化,柱长70cm ,直径1.6cm,洗脱液为PBS,流速1mL min -1,BSZ-160自动部分收集器分管收集洗脱液,每管2mL,收集蛋白峰。

Sepharose-4B 柱层析:盐析法所得的50%饱和硫酸铵提取物通过Sepharose-4B(Pharmacia)柱,柱长70cm ,直径1.6cm,洗脱液同上,流速0.5mL min -1,收集洗脱液,每管2mL,收集蛋白峰。

DEAE-52阴离子交换层析:Sepharose-4B 柱层析的第二个蛋白峰合并浓缩后再经DEAE-52(华美进口分装)进一步纯化,柱长15cm,直径1cm,盐梯度洗脱,缓冲液为pH 8.5的0.015mol L -1Trisbuffer,NaCl 浓度由0至1.0mol L -1,洗脱流速为0.3mL min -1,每管1.5mL,收集蛋白峰。

1.3 欧洲鳗抗温和气单胞菌免疫血清Ig 的制备免疫菌株:温和气单胞菌接种LB 培养基,置27 恒温摇床过夜,再以1%甲醛25 灭活24h,经检验无活菌后用灭菌生理盐水洗菌3次,并调节至6.0 109CFU,4 备用。

健康鳗经250 10-6的M S-222麻醉后,每尾腹腔注射上述灭活菌体0.15~0.20mL,15d 后加强免疫一次,二免2周后腹主动脉采531期林天龙等:欧洲鳗血清免疫球蛋白纯化及部分特性分析54水产学报 25卷血,收集血清,测定凝集效价,血清Ig提纯按1.2.3中叙述的方法进行。

1.4 兔抗欧洲鳗Ig高免血清抗体的制备与纯化Sephacryl-S200柱层析纯化的Ig与等量弗氏完全佐剂(FCA)混合乳化,对新西兰大白兔背部皮内多点注射,每只兔子注射蛋白量约50 g,首免15d后,用纯化Ig与等量弗氏不完全佐剂(FIA)混合乳化进行二次免疫;二免15d后,用100 g纯化Ig进行加强免疫;三免10d后由耳静脉采血,E LISA测定血清抗体滴度,-20 冻存备用。

1.5 SDS-聚丙烯酰铵凝胶电泳(SDS-PAGE)分析用Mini-Protean cell系统(BioRad)按LaemmLi系统[11]进行变性不连续凝胶电泳,积层胶浓度为4%,分离胶浓度为13%,待测样品10~20 g与等体积样品缓冲液混合,沸水浴3min,稍作离心后上样。

20mA,恒流电泳20min,再改为30mA,恒流电泳50min,电泳后凝胶按郭尧君[12]中的双胺银染色法进行染色,分子量标准14.3~200kD(GIBCO/BRL)。

1.6 免疫印迹试验(Wes tern blot Analysis)待测样品经SDS-PAGE分离后用Mini Protean cell系统(BioRad)电泳转移至0.45 m的硝酸纤维膜上,电泳条件为100V恒压,时间60min,转移后以封闭液(pH7.4的0.01mol L-1PBS,含20%牛血清, 0.05%tween-20)封闭120min,加兔抗欧洲鳗Ig高免血清,稀释度1 3000,室温反应90min, PBST(pH7.4的0.01mol L-1PBS,含0.05%tween-20)洗三次;再加碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG (Sigma),稀释度1 5000,室温反应90min,PBST洗三次,加底物为NBT和BCIP(GIBCO/BRL),室温显色30min后水洗终止反应。