1 1 0 0 生物检查法 - DrugFuture

国家药监局重点实验室专栏[重点实验室简介]国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室是国家药监局２０１９年首批认定的重点实验室ꎬ依托单位为中国食品药品检定研究院生物制品检定所ꎮ生物制品检定所主要开展应用基础研究ꎬ方向包括:治疗类生物技术产品㊁预防类菌苗/疫苗及其创新性产品和一些重要的体内外诊断试剂(血液筛查)的质量控制和质量评价研究ꎻ建立符合国际规范的质量检定用标准物质㊁生产与检定用菌种库和细胞库等ꎮ通过提供疫苗及生物技术产品等国家标准物质㊁建立标准的检验技术㊁研究与制定完善的药品质量标准ꎬ生物制品检定所在我国药品质量控制㊁创新性药品研究与产业化发展中起到不可或缺的技术支撑作用ꎮ生物制品质量研究与评价重点实验室具备完善的生物制品检验检测体系ꎬ检测技术范围与检测能力在国内相同领域是唯一的也是最全面的ꎬ共获得的ＣＮＡＳ实验室资质认定的项目２２２项ꎮ２０１３年生物制品检定所被评估认定成为ＷＨＯ生物制品标准化和评价合作中心ꎬ２０１７年通过ＷＨＯ生物制品标准化和评价合作中心再认定ꎮ通过广泛的国际药交流(ＷＨＯ㊁英国ＮＩＢＳＣ㊁美国药学会㊁美国ＦＤＡ和人用药物注册技术要求国际协调会议ＩＣＨ等)ꎬ重点实验室不仅引进国外先进的药品质量监管理念和技术ꎬ还将我国的一些优势技术运用于国际标准品和国际药品质量标准的建立中ꎬ在相关领域的国际标准制定中发挥重要作用ꎮ实验室主任:徐苗ꎬ女ꎬ医学博士ꎬ研究员ꎬ博士生导师ꎬ中国食品药品检定研究院生物制品检定所所长ꎮ主要从事疫苗等生物制品质量控制与评价的研究和管理工作ꎮ先后主持国家级课题４项ꎬ参与省部级以上课题６项ꎬ以第一或通信作者在«Ｎａｔｕｒａｌｐｒｏｔｏｃｏｌｓ»«ＥｍｅｒｇｉｎｇＭｉｃｒｏｂｅｓ＆Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ»等杂志上发表论文８０余篇ꎬ编写专著５部ꎬ获授权专利６项ꎬ其中３项已经完成转化ꎬ先后获得中华预防医学会科学技术一等奖㊁中国防痨协会科学技术奖一等奖㊁中国药学会科学技术奖二等奖㊁北京市科学技术二等奖等多个奖项ꎮ获国家市场监管总局抗击新冠疫情先进个人㊁中国药学会以岭生物青年生物奖等ꎮ㊀基金项目:国家重点研发计划(Ｎｏ.２０２１ＹＦＣ２３０２４０４)作者简介:吴小红ꎬ女ꎬ硕士ꎬ副研究员ꎬ研究方向:新型冠状病毒ｍＲＮＡ疫苗及狂犬病疫苗质量控制ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｗｕｘｉａｏｈｏｎｇ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎ通信作者:刘欣玉ꎬ男ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ研究方向:疫苗质量控制ꎬＴｅｌ:０１０－５３８５１７８０ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｌｉｕｘｉｎｙｕ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎ中和抗体检测应用于新型冠状病毒ｍＲＮＡ疫苗效力分析吴小红ꎬ赵丹华ꎬ所玥ꎬ彭沁华ꎬ王红玉ꎬ刘欣玉ꎬ李玉华(中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室ꎬ国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室ꎬ北京１０２６２９)摘要:目的㊀通过对新型冠状病毒(２０１９ｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓꎬ２０１９－ｎＣｏＶ)ｍＲＮＡ疫苗(新冠ｍＲＮＡ疫苗)免疫小鼠后产生的中和抗体进行检测ꎬ探索中和抗体检测法应用于ｍＲＮＡ疫苗体内效力评价的可行性ꎮ方法㊀采用６~８周ＢＡＬＢ/ｃ小鼠进行后肢肌肉免疫ꎬ检测不同免疫剂量和不同免疫程序的中和抗体滴度ꎮ并对８家企业生产的新冠ｍＲＮＡ疫苗免疫的小鼠血清进行中和抗体和ＩｇＧ抗体检测ꎮ结果㊀２㊁５㊁１０μｇ不同剂量ｍＲＮＡ疫苗按照不同免疫程序免疫小鼠后中和抗体检测结果显示ꎬ抗体阳转率均为１００％ꎬ中和抗体反应有明显的剂量－效应关系ꎮ２针间隔１４ｄ加强免疫组抗体滴度显著高于间隔７ｄ加强免疫组及１针组(Ｆ＝５７.１３ꎬＰ<０.００１)ꎮ２μｇ剂量间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体几何平均滴度(ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｍｅａｎｔｉｔｅｒꎬＧＭＴ)分别为２１８和４６８ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.４０ꎬＰ＝０.００３)ꎻ５μｇ剂量间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体ＧＭＴ分别为４９９和１４３６ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.６２ꎬＰ＝０.００２)ꎻ１０μｇ剂量间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体ＧＭＴ分别为６０８和１９０９ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.２３ꎬＰ＝０.００５)ꎮ国内８家企业生产的新冠ｍＲＮＡ疫苗免疫小鼠后均可产生高滴度的ＩｇＧ抗体(１０４.５~１０７.５)和中和抗体(１０２.６~１０４.８)ꎬ效力测定结果均符合企业质量标准ꎮ各企业生产的ｍＲＮＡ疫苗的中和抗体滴度结果差异有统计学意义(Ｆ＝７０.０３ꎬＰ<０.００１)ꎮ结论㊀小鼠免疫后中和抗体检测可用于ｍＲＮＡ疫苗的体内效力评价ꎮ关键词:新型冠状病毒ꎻｍＲＮＡ疫苗ꎻ中和抗体ꎻＩｇＧ抗体ꎻ效力中图分类号:Ｒ９１７㊀文献标志码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２３)１１－０８９６－００６ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２３.１１.００９ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅｐｏｔｅｎｃｙｏｆｍＲＮＡＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｉｎｖｉｖｏｕｓｉｎｇｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓａｙＷＵＸｉａｏｈｏｎｇꎬＺＨＡＯＤａｎｈｕａꎬＳＵＯＹｕｅꎬＰＥＮＧＱｉｎｈｕａꎬＷＡＮＧＨｏｎｇｙｕꎬＬＩＵＸｉｎｙｕꎬＬＩＹｕｈｕａ(ＮＭＰＡＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＱｕａｌｉｔｙＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓꎬＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＡｒｂｏｖｉｒｕｓＶａｃｃｉｎｅꎬＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０２６２９ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｐｏｔｅｎｃｙｏｆｍＲＮＡＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｉｎｖｉｖｏｂｙｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓａｙａｆ￣ｔｅｒｍｉｃｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎꎬａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｎｇｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｔｈｅｖａｃｃｉｎｅ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＢＡＬＢ/ｃｍｉｃｅａｔ６~８ｗｅｅｋｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｍＲＮＡＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅａｎｄｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｍｍｕｎｅｄｏｓａｇｅａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｓｃｈｅｄｕｌｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ.Ｔｈｅｖａｒｉａｎｔｖａｃｃｉｎｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄａｔｉｎｔｅｒｖａｌｓｏｆ７ｄｏｒ１４ｄꎬａｎｄｓｅｒｕｍｓａｍｐｌｅｓｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｔ７ｄａｆｔｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｄｏｓｅｏｆｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ.２０１９ｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒ￣ｕｓ(２０１９－ｎＣｏＶ)ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒａｎｄＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｔｅｓｔａｎｄｅｎ￣ｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｓｅｐａｒａｔｅｌｙ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｍｍｕｎｅｄｏｓａｇｅｏｆ２ꎬ５ꎬ１０μｇｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｍｉｃｅｗａｓ１００％ａｎｄｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｒｅａｃ￣ｔｉｏｎｈａｄａｎｏｂｖｉｏｕｓｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｏｆｔｈｅ１４－ｄａｙｉｎｔｅｒｖａｌｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅ７－ｄａｙｉｎｔｅｒｖａｌｇｒｏｕｐａｎｄｏｎｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ(Ｆ＝５７.１３ꎬＰ<０.００１).Ｔｈｅｇｅｏｍｅｔｒｉｃｍｅａｎｔｉｔｅｒｓ(ＧＭＴ)ｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙ２μｇｄｏｓａｇｅｉｎｔｅｒｖａｌｏｆ７－ｄａｙａｎｄ１４－ｄａｙｗｅｒｅ２１８ａｎｄ４６８ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(ｔ＝３.４０ꎬＰ＝０.００３)ꎻＴｈｅＧＭＴｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙ５μｇｄｏｓａｇｅｉｎｔｅｒｖａｌｏｆ７－ｄａｙａｎｄ１４－ｄａｙｗｅｒｅ４９９ａｎｄ１４３６ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(ｔ＝３.６２ꎬＰ＝０.００２)ꎻＴｈｅＧＭＴｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙ１０μｇｄｏｓａｇｅｉｎｔｅｒｖａｌｏｆ７－ｄａｙａｎｄ１４－ｄａｙｗｅｒｅ６０８ａｎｄ１９０９ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(ｔ＝３.２３ꎬＰ＝０.００５).ＨｉｇｈｌｅｖｅｌｓｏｆＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙ(１０４.５~１０７.５)ａｎｄｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ(１０２.６~１０４.８)ｃｏｕｌｄｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇｍｉｃｅｗｉｔｈｔｈｅＣＯＶＩＤ－１９ｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅꎬｐｏｔｅｎｃｙｏｆｔｈｅｖａｃｃｉｎｅｓｗｅｒｅａｌｌｍｅｔｗｉｔｈｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｗｉｔｈｇｏｏｄｌｏｔｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｅꎬｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｓａｍｏｎｇｔｈｅｖａｒｉｏｕｓｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｎ￣ｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ(Ｆ＝７０.０３ꎬＰ<０.００１).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｓｔｏｆｔｈｅｍｉｃｅａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｐｏｔｅｎｃｙｏｆＣＯＩＤ－１９ｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｉｎｖｉｖｏ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:２０１９ｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓꎻｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅꎻＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙꎻＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙꎻＰｏｔｅｎｃｙ㊀㊀新型冠状病毒感染(ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ２０１９ꎬＣＯＶＩＤ－１９)的流行对人类健康造成了严重影响ꎮ疫苗接种已被证实对严重疾病㊁降低住院率和死亡率非常有效[１－２]ꎮ其中ｍＲＮＡ疫苗由于具有能够同时诱导体液免疫和细胞免疫㊁研发和生产周期短㊁容易实现量产等优势ꎬ成为国际上主要采用的ＣＯＶＩＤ－１９疫苗研发技术ꎮ随着新型冠状病毒(２０１９－ｎＣｏＶ)变异株的不断出现ꎬ单价变异株疫苗及多价变异株疫苗可作为加强免疫以及异源序贯免疫来应对病毒变异造成的感染威胁[３]ꎮ新冠ｍＲＮＡ疫苗的效力评价目前尚无国际标准ꎬ欧洲及世界卫生组织(ＷＨＯ)专家多推荐体外活性研究作为该疫苗效力评价的主要方法[４－６]ꎮ鉴于ｍＲＮＡ疫苗为创新技术疫苗ꎬ缺乏系统的疫苗质量研究经验ꎬ我国现阶段采用体内和体外双效力指标进行评价[７]ꎬ体内效力的评价可利用动物免疫后检测中和抗体和/或总抗体的方法来进行[８]ꎮ本研究对新冠ｍＲＮＡ疫苗不同免疫剂量和不同免疫程序诱导的中和抗体反应进行初步研究ꎬ并对新冠变异株ｍＲＮＡ疫苗及二价ｍＲＮＡ疫苗免疫小鼠后的抗体阳性率和抗体水平进行体内效力分析ꎬ从而评价ｍＲＮＡ疫苗的质量ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验动物㊀ＳＰＦ级ＢＡＬＢ/ｃ小鼠ꎬ６~８周龄ꎬ体重１８~２２ｇꎬ雌雄不限ꎬ由中国食品药品检定研究院动物所提供ꎬ实验动物生产许可证号:ＳＣＸＫ(京)２０２２－０００２ꎬ使用许可证号:ＳＹＸＫ(京)２０２２－００１４ꎬ动物实验伦理批准文号:中检动(福)第２０２２(Ｂ)００８号ꎮ１.２㊀主要试剂及仪器㊀１０ˑＰＢＳ㊁ＴＭＢ㊁终止液购自索莱宝公司ꎻＨＲＰ标记的羊抗小鼠ＩｇＧ购自美国Ｊａｃｋｓｏｎ公司ꎻＢＳＡ购自美国Ｓｉｇｍａ公司ꎻＤＭＥＭ㊁胎牛血清㊁胰酶㊁ＨＥＰＥＳ㊁双抗均购自美国Ｇｉｂｃｏ公司ꎻ荧光素酶检测试剂购自美国普洛麦格Ｐｒｏｍｅｇａ公司ꎻＰｒｏｍｅｇａＧｌｏＭａｘ９６微孔板化学发光检测仪(Ｇｌｏｍａｘｎａｖｉｇａｔｏｒ)购自美国普洛麦格Ｐｒｏｍｅｇａ公司ꎻ酶标仪(ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００)购自美国蒂肯公司ꎮ１.３㊀实验用疫苗㊁细胞㊁不同型别假病毒㊀实验用疫苗为国内企业生产的ｍＲＮＡ疫苗ꎬ编号Ｖ１~Ｖ９ꎮ其中Ｖ１为原型株疫苗ꎬＶ２~Ｖ７为二价２０１９－ｎＣｏＶ变异株ｍＲＮＡ疫苗(ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.４/５株和Ｄｅｌｔａ株双价㊁ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.４/５株和Ｂｅｔａ株双价㊁ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.２株和原型株双价以及ＯｍｉｃｒｏｎＸＢＢ.１.５株和ＢＱ.１.７株双价)ꎬＶ８~Ｖ９是２０１９－ｎＣｏＶ变异株ｍＲＮＡ疫苗(ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.１)ꎻＶｅｒｏ细胞购自ＡＴＣＣꎬ本室传代保存ꎻ假病毒原型株㊁Ｄｅｌｔａ株㊁Ｂｅｔａ株㊁Ｏ￣ｍｉｃｒｏｎＢＡ.１㊁ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.２㊁ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.４/５㊁ＯｍｉｃｒｏｎＸＢＢ.１.５购自北京云菱生物技术公司ꎻ不同株２０１９－ｎＣｏＶＳ蛋白抗原分别购自北京义翘神州生物技术有限公司和北京百普赛斯公司ꎮ１.４㊀免疫剂量及免疫程序１.４.１㊀ｍＲＮＡ疫苗免疫剂量和免疫程序研究㊀将Ｖ１ｍＲＮＡ疫苗(原型株)配制成不同浓度后ꎬ按照不同的免疫程序分成Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ３组:Ａ组程序为免疫１针ꎬ１４ｄ采血ꎻＢ组程序为间隔７ｄ加强免疫１针后７ｄ采血ꎻＣ组程序为间隔１４ｄ加强免疫１针后７ｄ采血ꎮ每种免疫程序按照不同的免疫剂量分成３个小组ꎬ分别是每只小鼠注射２㊁５和１０μｇꎬ共计９组ꎬ每组１０只小鼠ꎮ同时１０只小鼠注射生理盐水作为阴性对照组ꎮ每只小鼠后肢肌肉注射１００μＬ疫苗ꎬ眼球取血分离血清ꎬ－２０ħ保存备用ꎮ用假病毒中和试验法检测抗２０１９－ｎＣｏＶ中和抗体ꎮ１.４.２㊀实验疫苗免疫和检测㊀ｍＲＮＡ变异株疫苗及二价疫苗均按照企业的免疫剂量和免疫程序进行免疫和采血ꎬ分离血清后于－２０ħ保存ꎮ分别进行中和抗体和ＩｇＧ结合抗体的检测ꎮ１.５㊀假病毒中和试验(ＰＢＮＡ法)㊀按照操作规程进行[９－１０]ꎬ在９６孔板上３倍系列稀释的血清１００μＬꎬ分别加入各型假病毒[用ＤＭＥＭ培养基稀释至１.３ˑ１０４半数组织培养感染剂量(ＴＣＩＤ５０)/ｍＬ]ꎬ每孔加入５０μＬꎬ同时设立病毒对照和细胞对照ꎮ３７ħ５％ＣＯ２培养箱中和１ｈꎬ加入２ˑ１０５个/ｍＬ的Ｖｅｒｏ细胞悬液ꎬ每孔１００μＬꎬ３７ħ５％ＣＯ２培养箱培养２０~２８ｈ后ꎬ从细胞培养箱中取出９６孔板ꎬ用多道移液器从每个上样孔中吸弃１５０μＬ上清ꎬ然后加入１００μＬ荧光素酶检测试剂ꎬ室温避光反应２ｍｉｎꎮ反应结束后ꎬ用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸６~８次ꎬ使细胞充分裂解ꎬ从每孔中吸出１００μＬ液体ꎬ加于对应９６孔化学发光检测板中ꎬ置于化学发光检测仪中读取发光值ꎮ计算抑制率＝{１－[样品组的发光强度均值－空白对照ＣＣ(ＣｅｌｌＣｏｎｔｒｏｌꎬＣＣ)均值]/[阴性组的发光强度ＶＣ(ＶｉｒｕｓＣｏｎｔｒｏｌꎬＶＣ)均值－空白对照值ＣＣ均值]}ˑ１００％ꎮ根据中和抑制率结果ꎬ按照ＲｅｅｄＭｕｅｎｃｈ法计算中和抗体滴度半数效应剂量(５０％ｍａｘｉｍａｌｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬＥＣ５０)ꎬＥＣ５０>３０为抗体阳性ꎮ１.６㊀特异性抗２０１９－ｎＣｏＶＳｐｉｋｅ蛋白ＩｇＧ抗体检测㊀将２０１９－ｎＣｏＶ各株抗原分别用１ˑＰＢＳ稀释至２μｇ ｍＬ－１ꎬ取９６孔板每孔加１００μＬꎬ(５ʃ３)ħ条件下包被过夜１６ｈꎬＰＢＳＴ洗板３次ꎬ拍干后加入封闭液(２％ＢＳＡ溶液)ꎬ１００μＬ/孔ꎬ３７ħ孵箱里封闭２ｈꎬ加入系列稀释后的待检测血清样本ꎬ３７ħ孵箱里孵育后１ｈꎬＰＢＳＴ洗板３次ꎬ加入辣根过氧化物酶(ＨＲＰ)标记的羊抗小鼠ＩｇＧ抗体ꎬ每孔１００μＬꎬ３７ħ孵育后１ｈꎬＰＢＳＴ洗板３次ꎬ加入底物ＴＭＢ５０μＬꎬ室温避光显色３~５ｍｉｎꎬ加入１ｍｏｌ Ｌ－１硫酸溶液终止液终止ꎬ１５０μＬ/孔ꎬ在酶标仪上检测波长４５０ｎｍ/６３０ｎｍ的ＯＤ值ꎬ以阴性小鼠吸光度均值的２.１倍为ｃｕｔｏｆｆ值ꎮ血清Ａ值大于ｃｕｔｏｆｆ值为抗体阳性ꎬ取阳性Ａ值最大的血清稀释度为血清的ＩｇＧ抗体滴度ꎮ１.７㊀统计学方法㊀使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８.０进行数据分析ꎬ相同免疫剂量不同免疫程序以及相同免疫程序不同免疫剂量间中和抗体滴度以及不同企业ｍＲＮＡ疫苗免疫后中和抗体之间比较采用单因素方差分析评估组间差异ꎬ中和抗体和ＩｇＧ抗体之间差异采用ｔ检验分析ꎬＰ<０.０５表示差异有统计学意义ꎮ２㊀结果２.１㊀不同免疫剂量和不同免疫程序的抗体反应㊀针对原型株ｍＲＮＡ疫苗不同免疫剂量和免疫程序的中和抗体检测结果显示ꎬ２㊁５㊁１０μｇｍＲＮＡ疫苗免疫小鼠后ꎬ１针免疫组和２针免疫组抗体阳性率均为１００％ꎮ２㊁５㊁１０μｇ首针免疫后１４ｄ或２１ｄ中和抗体反应具有明显的剂量－效应关系ꎮ相同免疫剂量㊁不同免疫程序结果显示ꎬ２针免疫组高于１针免疫组ꎬ其中２μｇ剂量组不同针次之间抗体滴度结果差异有统计学意义(Ｆ＝２０.６４ꎬＰ<０.００１)ꎻ５μｇ剂量组不同针次之间抗体滴度结果差异有统计学意义(Ｆ＝１８.２７ꎬＰ<０.００１)ꎻ１０μｇ剂量组不同针次之间抗体滴度结果差异有统计学意义(Ｆ＝１１.３７ꎬＰ<０.００１)ꎮ２针免疫组中１４ｄ加强免疫组高于７ｄ加强免疫组及１针组(Ｆ＝５７.１３ꎬＰ<０.００１)ꎮ其中２μｇ间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫组产生的中和抗体几何平均滴度(ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｍｅａｎｔｉｔｅｒꎬＧＭＴ)分别为２１８和４６８ꎬ１４ｄ为７ｄ的２.１５倍ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.４０ꎬＰ＝０.００３)ꎻ５μｇ间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体ＧＭＴ分别为４９９和１４３６ꎬ１４ｄ为７ｄ的２.８８倍ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.６２ꎬＰ＝０.００２)ꎻ１０μｇ间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体ＧＭＴ分别为６０８和１９０９ꎬ１４ｄ为７ｄ的３.１４倍ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.２３ꎬＰ＝０.００５)ꎮ相同免疫程序㊁不同免疫剂量诱导的抗体反应结果显示ꎬ１针免疫组不同剂量间相比(Ｆ＝７.３３ꎬＰ＝０.００３)ꎻ２针免疫组ꎬ间隔７ｄ不同剂量间相比(Ｆ＝６.４０ꎬＰ＝０.００５)ꎻ２针免疫组ꎬ间隔１４ｄ不同剂量间相比(Ｆ＝７.６４ꎬＰ＝０.００２)ꎬ差异均有统计学意义ꎬ结果见表１ꎮ表１㊀Ｖ１疫苗不同免疫剂量和免疫程序的中和抗体滴度及阳性率剂量/μｇＧＭＴ(９５％ＣＩ)Ａ组Ｂ组Ｃ组Ｆ值Ｐ值阳性率(％)２６０(４６~７３)２１８(１６７~６２９)４６８(２６３~６７４)２０.６４Ｐ<０.００１１００.０５１８７(１０２~２７１)４９９(３１１~６８８)１４３６(７５９~２１１２)１８.２７Ｐ<０.００１１００.０１０３４９(５２~６４６)６０８(２６９~９４８)１９０９(７０９~３１０９)１１.３７Ｐ<０.００１１００.０Ｆ值７.３３６.４０７.６４３.４０ａ３.６２ｂ３.２３ｃＰ值０.００３０.００５０.００２０.００３ａ０.００２ｂ０.００５ｃ阳性率(％)１００.０１００.０１００.０///㊀注:ＧＭＴ为几何平均滴度:９５％ＣＩ:９５％可信区间ꎻ/表示无统计ꎻａｂｃ２㊁５㊁１０μｇ间隔７ｄ和间隔１４ｄ中和抗体滴度分别进行ｔ检验ꎮ２.２㊀８家企业生产的新冠变异株ｍＲＮＡ疫苗体内效力检测结果㊀８家企业生产的疫苗Ｖ２~Ｖ９按照企业的免疫剂量和免疫程序免疫ＢＡＬＢ/ｃ小鼠后ꎬ中和抗体及特异性ＩｇＧ抗体检测结果见表２ꎮ表２㊀不同企业生产的ｍＲＮＡ疫苗抗体检测结果生产者免疫程序检测批数ＬｇＩｇＧ(ＧＭＴ)中和抗体ＥＣ５０(ＧＭＴ)(ＬｇＥＣ５０)Ｖ３７ｄ２针免疫１４ｄ采血Ｖ４７ｄ２针免疫１４ｄ采血Ｖ５１４ｄ２针免疫２１ｄ采血Ｖ６１４ｄ２针免疫２１ｄ采血Ｖ７１４ｄ２针免疫２１ｄ采血Ｖ８１４ｄ２针免疫２８ｄ采血Ｖ９１４ｄ２针免疫２８ｄ采血２５.９５.６１２０２(３.１)Ｎ/Ａ３５.６５.７１２６８(３.１)Ｎ/Ａ１５.９６.０４１０(２.６)９６６(３.０)２６.０５.７６１７(２.８)１４５６(３.２)３６.０５.７６４４(２.８)１６７１(３.２)４６.９６.６６６７(２.８)３９３５(３.６)１４.５４.８１２９１(３.１)２０８０(３.３)２４.７４.９１５５６(３.２)２３５３(３.４)３４.７４.８１３６１(３.１)２５８２(３.４)４４.６４.９１０５０(３.０)１９３１(３.３)１６.０６.１１２７４(３.１)３８１２(３.６)２６.１５.８１１７０(３.１)２７９８(３.４)３６.０５.８１５８９(３.２)３０９７(３.５)４６.０６.０１２９８(３.１)４０７４(３.６)１５.０４.８７４９５(３.９)１４２７(３.２)２５.１５.０６２３０(３.８)１２５７(３.１)３５.３５.２９５８０(４.０)２８０６(３.４)１７.１/２４４５３(４.４)/２７.５/２７９７６(４.４)/３７.５/２６９７９(４.４)/１５.６/６５６３０(４.８)/２５.６/４０４４５(４.６)/３５.６/２５３４３(４.４)/Ｆ值或ｔ值１１.４７ａ１７.５６ｂ７０.０３ｃＰ值Ｐ<０.００１ａＰ<０.００１ｂＰ<０.００１ｃ㊀注: / 代表该疫苗为单价疫苗ꎻ Ｎ/Ａ 代表该组分未检测ꎻ １㊁２㊁３㊁４ 分别代表检测批数ꎮａ代表组分１ＩｇＧ结合抗体和中和抗体滴度ｔ检验结果ꎻｂ代表组分２ＩｇＧ结合抗体和中和抗体滴度ｔ检验结果ꎻｃ代表各企业之间中和抗体滴度方差分析结果ꎮ组分１和组分２代表双价疫苗中的单价组分ꎬ如Ｖ７疫苗:组分１为德尔塔株ꎬ组分２为奥密克戎ＢＡ.４/５株ꎮ２.３㊀特异性ＩｇＧ结合抗体和中和抗体结果分析㊀检测结果以对数转换后进行ｔ检验ꎬ组份１ＩｇＧ和ＥＣ５０比较ｔ＝１１.４７ꎬＰ<０.００１ꎻ组份２ＩｇＧ和ＥＣ５０比较ｔ＝１７.５６ꎬＰ<０.００１ꎬ均显示中和抗体检测结果和ＩｇＧ结合抗体检测差异有统计学意义ꎮＰｅａｒｓｏｎ相关系数ｒ分别为０.４２和０.２２ꎮ虽然两种方法抗体检测结果相关性较差ꎬ但均可以检测到高水平的抗体特异性反应ꎮ两种方法检测各企业３~４批疫苗ꎬＩｇＧ抗体结果批间变异系数在１.０％~７.６％ꎬ中和抗体结果批间变异系数在２.０％~７.９％ꎬ提示两种抗体检测方法均可以用于评价疫苗体内效价的批间一致性ꎮ各企业ｍＲＮＡ疫苗的中和抗体结果对数转换后进行组间方差分析ꎬ差异有统计学意义(Ｆ＝７０.０３ꎬＰ<０.００１)ꎮ３㊀讨论新冠ｍＲＮＡ疫苗临床前和临床研究中均证实疫苗的有效性与动物或人群保护力之间有一定的量效关系[１１－１４]ꎮ中和抗体是最重要的保护性抗体ꎬ与２０１９－ｎＣｏＶ感染者症状严重程度之间也有一定的相关性[１５－１６]ꎮ因此建立标准的中和抗体检测平台技术对ＣＯＶＩＤ－１９疫苗进行评价尤为重要[１７]ꎮ本研究采用的假病毒中和方法经国内多家实验室联合验证[９ꎬ１８]ꎬ抗体检测结果相对客观ꎬ与ＩｇＧ结合抗体检测相比更能体现疫苗的免疫原性ꎮ尤其对于多价疫苗ꎬ假病毒中和抗体检测方法可实现对不同变异株抗体分别进行检测ꎬ能较好的反映出针对多价疫苗各毒株组份疫苗诱导的抗体中和活性ꎮ通过对１批ｍＲＮＡ原型株疫苗不同免疫剂量和不同免疫程序的分析ꎬ提示ｍＲＮＡ疫苗免疫小鼠后的中和抗体水平与免疫剂量和免疫程序有密切关系ꎮ本研究发现ꎬ同等剂量下(２㊁５㊁１０μｇ)间隔７ｄ与间隔１４ｄ２针免疫的抗体结果差异有统计学意义ꎬ对于ｍＲＮＡ疫苗来说ꎬ间隔７ｄ的第２针加强免疫不是产生高滴度中和抗体的最适宜的程序ꎬ疫苗实际使用过程中第２针加强免疫的时间选择在２１ｄ或２８ｄ[１１－１２]ꎮ因此ｍＲＮＡ疫苗体内效力的评价应适当关注免疫程序的设计ꎮ研究结果显示ｍＲＮＡ变异株单价疫苗或二价疫苗中针对不同组分的ＩｇＧ抗体滴度均在１０４.５~１０７.５间ꎬ符合各企业的质量标准(不低于１０３或１０４)ꎬ且各企业生产的疫苗ＩｇＧ抗体结果批间一致性良好ꎬ变异系数在１.０％~７.６％之间ꎮ假病毒法检测中和抗体滴度在１０２.６~１０４.８之间ꎬ不同企业生产的疫苗免疫后中和抗体水平差异有统计学意义(Ｆ＝７０.０３ꎬＰ<０.００１)ꎬ与国产ｍＲＮＡ疫苗已公布的Ⅰ~Ⅱ期临床研究数据一致ꎬ不同企业新冠ｍＲＮＡ疫苗在人体内产生的中和抗体滴度有差异[１２－１５]ꎮ各企业不同批次中和抗体检测结果变异系数为２.０％~７.９％ꎮ因此中和抗体检测可用于不同企业ｍＲＮＡ疫苗效力的比较研究以及疫苗批间一致性的评价ꎮ辉瑞公司生产的ＢＮＴ１６２ｂ为３０μｇ/剂ꎬ莫德纳公司ｍＲＮＡ－１２７３为１００μｇ/剂ꎮ两款疫苗对２０１９－ｎＣｏＶ感染的保护效力分别达到了９４.６％和９４.１％ꎬ不同的人用剂量和免疫程序可产生相同的临床保护力[１９－２１]ꎮｍＲＮＡ－１２７３Ⅲ期临床研究结果显示接种该疫苗后假病毒法检测中和抗体滴度半数抑制稀释(５０％ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｄｉｌｕｔｉｏｎꎬＩＤ５０)为１０㊁１００和１０００ꎬ测算疫苗保护效力分别为７８％㊁９１％和９６％[２２]ꎻ新冠灭活疫苗ＮＶＸ－ＣｏＶ２３７３中和抗体滴度ＩＤ５０为５０㊁１００和７２３０(ＩＵ５０ ｍＬ－１)ꎬ疫苗保护效力分别为７５.７％㊁８１.７％和９６.８％[２３]ꎮ本研究结果显示国产新冠ｍＲＮＡ疫苗小鼠免疫后中和抗体均达到较高水平ꎬ无论是１针免疫还是２针免疫ＥＣ５０除个别企业因单价组分配比含量低ꎬ造成滴度偏低(Ｖ４)外ꎬ其余企业中和抗体滴度均在在１０００以上甚至更高ꎬ提示国产新冠ｍＲＮＡ疫苗的体内效力结果已达到较高的标准要求ꎮ虽然本研究未利用上述新冠ｍＲＮＡ疫苗进一步开展攻毒保护力研究ꎬ但随着ｍＲＮＡ疫苗大量的临床研究数据以及真实世界的保护力数据公布ꎬ会对疫苗的效力评价标准提供更有效的数据支持ꎮ尽快建立效力评价用疫苗参考品和血清检测用标准物质ꎬ提高国产ｍＲＮＡ疫苗的质量评价水平是下一步研究方向ꎮ参考文献:[１]㊀ＥＡＲＬＥＫＡꎬＡＭＢＲＯＳＩＮＯＤＭꎬＦＩＯＲＥ－ＧＡＲＴＬＡＮＤＡꎬｅｔａｌ.ＥｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａｎｔｉｂｏｄｙａｓａｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｅｆｏｒＣＯ￣ＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅꎬ２０２１ꎬ３９(３２):４４２３－４４２８. 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[９]ＮＩＥＪꎬＬＩＱꎬＷＵＪꎬｅｔａｌ.Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆａｐｓｅｕｄｏ－ｖｉｒｕｓｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２[Ｊ].ＥｍｅｒｇＭｉｃｒｏｂｅｓＩｎｆｅｃｔꎬ２０２０ꎬ９(１):６８０－６８６.[１０]ＮＩＥＪꎬＬＩＱꎬＷＵＪꎬｅｔａｌ.ＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｂｙａｐｓｅｕｄｏ－ｔｙｐｅｄｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄａｓｓａｙ[Ｊ].ＮａｔＰｒｏｔｏｃꎬ２０２０ꎬ１５(１１):３６９９－３７１５.[１１]ＬＩＪＬꎬＬＩＵＱꎬＬＩＵＪꎬｅｔａｌ.ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＢｉｖａｌｅｎｔｍＲＮＡＶａｃｃｉｎｅｓａｇａｉｎｓｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｖａｒｉａｎｔｓ[Ｊ].Ｖａｃ￣ｃｉｎｅｓ(Ｂａｓｅｌ)ꎬ２０２２ꎬ１０(１１):１８０７.[１２]ＹＡＮＧＲꎬＤＥＮＧＹꎬＨＵＡＮＧＢＹꎬｅｔａｌ.Ａｃｏｒｅ－ｓｈｅｌｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄＣＯＶＩＤ－１９ｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｗｉｔｈｆａｖｏｒａｂｌｅｂｉｏ￣ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎａｎｄｐｒｏｍｉｓｉｎｇｉｍｍｕｎｉｔｙ[Ｊ].ＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔＴａｒｇｅｔＴｈｅｒꎬ２０２１ꎬ６(１):２１３.[１３]ＣＨＥＮＧＬꎬＬＩＸＦꎬＤＡＩＸＨꎬｅｔａｌ.Ｓａｆｅｔｙａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅ￣ｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＡＲＣｏＶｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｉｎＣｈｉｎｅｓｅａｄｕｌｔｓ:ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄꎬｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄꎬｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎ￣ｔｒｏｌｌｅｄꎬｐｈａｓｅ１ｔｒｉａｌ[Ｊ].ＬａｎｃｅｔＭｉｃｒｏｂｅꎬ２０２２ꎬ３(３):ｅ１９３－ｅ２０２.[１４]ＸＵＫꎬＬＥＩＷＷꎬＫＡＮＧＢꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅꎬＳＹＳ６００６ꎬａｇａｉｎｓｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２[Ｊ].ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０２３(１３):１０５１５７６.[１５]ＧＡＲＣＩＡ－ＢＥＬＴＲＡＮＷＦꎬＬＡＭＥＣꎬＡＳＴＵＤＩＬＬＯＭＧꎬｅｔａｌ.ＣＯＶＩＤ－１９－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｐｒｅｄｉｃｔｄｉｓｅａｓｅｓｅｖｅｒｉｔｙａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０２１ꎬ１８４(２):４７６－４８８. [１６]ＫＨＯＵＲＹＤＳꎬＣＲＯＭＥＲＤꎬＲＥＹＮＡＬＤＩＡꎬｅｔａｌ.Ｎｅｕ￣ｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌｓａｒｅｈｉｇｈｌｙｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｏｆｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｒｏｍｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔＭｅｄꎬ２０２１ꎬ２７(７):１２０５－１２１１.[１７]ＷＡＮＧＹＣ.ＳｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓａｙｓａｒｅｎｅｅｄｅｄｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｎｇＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｓ[Ｊ].ＥＢｉｏＭｅｄｉ￣ｃｉｎｅꎬ２０２１(７３):１０３６７７.[１８]ＧＵＡＮＬＤꎬＹＵＹＬꎬＷＵＸＨꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｆｉｒｓｔＣｈｉｎｅｓｅｎａ￣ｔｉｏｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｓｆｏｒＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅꎬ２０２１ꎬ３９(２８):３７２４－３７３０.[１９]ＰＯＬＡＣＫＦＰꎬＴＨＯＭＡＳＳＪꎬＫＩＴＣＨＩＮＮꎬｅｔａｌ.ＳａｆｅｔｙａｎｄＥｆｆｉｃａｃｙｏｆｔｈｅＢＮＴ１６２ｂ２ｍＲＮＡＣｏｖｉｄ－１９Ｖａｃｃｉｎｅ[Ｊ].ＮＥｎｇｌＪＭｅｄꎬ２０２０ꎬ３８３(２７):２６０３－２６１５.[２０]ＳＫＯＷＲＯＮＳＫＩＤＭꎬＤＥＳＥＲＲＥＳＧ.ＳａｆｅｔｙａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｔｈｅＢＮＴ１６２ｂ２ｍＲＮＡｃｏｖｉｄ－１９ｖａｃｃｉｎｅ[Ｊ].ＮＥｎｇｌＪＭｅｄꎬ２０２１ꎬ３８４(１６):１５７６－１５７７.[２１]ＢＡＤＥＮＬＲꎬＥＬＳＡＨＬＹＨＭꎬＥＳＳＩＮＫＢꎬｅｔａｌ.ＥｆｆｉｃａｃｙａｎｄｓａｆｅｔｙｏｆｔｈｅｍＲＮＡ－１２７３ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｖａｃｃｉｎｅ[Ｊ].ＮＥｎｇｌＪＭｅｄꎬ２０２１ꎬ３８４(５):４０３－４１６.[２２]ＧＩＬＢＥＲＴＰＢꎬＭＯＮＴＥＦＩＲＲＩＤＣꎬＭＣＤＥＲＭＯＴＴＡＢꎬｅｔａｌ.ＩｍｍｕｎｅｃｏｒｒｅｌａｔｅｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｍＲＮＡ－１２７３ＣＯ￣ＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ３７５(６５７６):４３－５０.[２３]ＦＯＮＧＹꎬＨＵＡＮＧＹꎬＢＥＮＫＥＳＥＲＤꎬｅｔａｌ.Ｉｍｍｕｎｅｃｏｒｒｅ￣ｌａｔｅｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＰＲＥＶＥＮＴ－１９ＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ[Ｊ].ＮａｔＣｏｍｍｕｎꎬ２０２３ꎬ１４(１):３３１.(收稿日期:２０２３－１０－１３)(上接第８８３页)[１５]ＷＵＹＢꎬＰＥＮＧＭＣꎬＺＨＡＮＧＣꎬｅｔａｌ.Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｒ￣ｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉ－ｃｌａｓｓｂｉｏａｃｔｉｖｅｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｆｏｒｑｕａｌｉｔｙａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｅｎＡｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓꎬｆｏｕｒＧｏｏｄｙｅｒａａｎｄｏｎｅＬｕｄｉｓｉａｓｐｅｃｉｅｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＣｈｉｎＨｅｒｂＭｅｄꎬ２０２０ꎬ１２(４):４３０－４３９.[１６]ＤＵＸＭꎬＩＲＩＮＯＮꎬＦＵＲＵＳＨＯＮꎬｅｔａｌ.ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎｔｈｅＡｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓａｎｄＧｏｏｄｙｅｒａｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＪＮａｔＭｅｄꎬ２００８ꎬ６２(２):１３２－１４８.[１７]ＤＵＸＭꎬＳＵＮＮＹꎬＣＨＥＮＹꎬｅｔａｌ.Ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｌｉ￣ｐｈａｔｉｃｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｆｒｏｍｔｈｒｅｅＧｏｏｄｙｅｒａｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＢｉｏｌＰｈａｒｍＢｕｌｌꎬ２０００ꎬ２３(６):７３１－７３４.[１８]张婉菁ꎬ刘量ꎬ胡荣ꎬ等.斑叶兰抗氧化活性组分研究及其乳膏的制备[Ｊ].中医药导报ꎬ２０１７ꎬ２３(１):５９－６２. [１９]朱平福ꎬ赵怡ꎬ金晶.斑叶兰抗炎作用的实验研究[Ｊ].中国民族民间医药ꎬ２０１０ꎬ１９(４):３５－３６.[２０]ＤＡＩＬＹꎬＹＩＮＱＭꎬＱＩＵＪＫꎬｅｔａｌ.ＧｏｏｄｙｓｃｈｌｅＡꎬａｎｅｗｂｕｔｅｎｏｌｉｄｅｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔＢｃｈＥｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｆｒｏｍＧｏｏｄｙｅｒａｓｃｈｌｅｃｈｔｅｎｄａｌｉａｎａ[Ｊ].ＮａｔＰｒｏｄＲｅｓꎬ２０２１ꎬ３５(２３):４９１６－４９２１.[２１]ＤＵＸＭꎬＳＵＮＮＹꎬＴａｋｉｚａｗａＮꎬｅｔａｌ.Ｓｅｄａｔｉｖｅａｎｄａｎｔｉ￣ｃｏｎｖｕｌｓａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｇｏｏｄｙｅｒｉｎꎬａｆｌａｖｏｎｏｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅｆｒｏｍＧｏｏｄｙｅｒａｓｃｈｌｅｃｈｔｅｎｄａｌｉａｎａ[Ｊ].ＰｈｙｔｏｔｈｅｒＲｅｓꎬ２００２ꎬ１６(３):２６１－２６３.[２２]党友超ꎬ黄哲ꎬ李蒙禹ꎬ等.黔产金线莲及其易混品(斑叶兰)的显微鉴定研究[Ｊ].贵阳中医学院学报ꎬ２０１８ꎬ４０(４):３０－３４.[２３]黄哲ꎬ党友超ꎬ王世清.黔产金线莲与其易混品斑叶兰的叶表皮显微特征研究[Ｊ].贵阳中医学院学报ꎬ２０１９ꎬ４１(２):３４－３７.(收稿日期:２０２３－０５－０８)。

药品监管科学研究专栏㊀基金项目:国家重点研发计划项目(Ｎｏ.２０２２ＹＦＦ０７１１１００)ꎻ中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金(Ｎｏ.２０２２Ｃ１)作者简介:林铌ꎬ女ꎬ博士ꎬ主管药师ꎬ研究方向:化妆品安全性评价ꎬ替代与转化毒理学ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｎｉｌｉｎ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎ通信作者:王钢力ꎬ女ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ研究方向:化妆品安全性评价ꎬＴｅｌ:０１０－６７０９５９２５ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｗａｎｇｇｌ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎꎻ路勇ꎬ男ꎬ博士ꎬ教授级高级工程师ꎬ研究方向:化妆品安全监管ꎬＴｅｌ:０１０－５３８５１５１５ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｌｕｙｏｎｇ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎ从化妆品监管科学角度探讨类器官及器官芯片的发展现状㊁趋势与启示林铌ꎬ张凤兰ꎬ余振喜ꎬ王钢力ꎬ路勇(中国食品药品检定研究院化妆品安全技术评价中心ꎬ北京１０００５０)摘要:类器官和器官芯片等新型体外替代模型是近年国际前沿技术和研究热点ꎬ并被逐渐应用于药品㊁化妆品领域的研发和监管中ꎬ使该类技术备受关注ꎮ本文首先简要阐释了类器官和器官芯片的基本概念㊁发展历程及技术特点ꎬ然后列举了该类技术在化妆品原料安全性㊁功效性测试中的应用场景ꎮ最后ꎬ结合国内外化妆品技术法规ꎬ对类器官和器官芯片在提升我国化妆品原料研发效能㊁支持监管决策方面的未来趋势进行了展望ꎬ并从监管科学角度提出了应用该类新技术时的监管建议ꎬ以期为符合我国国情的化妆品监管提供技术储备ꎬ促进创新性科学研究成果转化为实用性监管科学工具ꎮ关键词:类器官ꎻ器官芯片ꎻ化妆品ꎻ原料ꎻ安全性ꎻ功效性ꎻ监管科学中图分类号:Ｒ９５㊀文献标志码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２４)０４－０３５２－０７ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２４.０４.００８Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｔｕｓꎬｔｒｅｎｄａｎｄｅｎｌｉｇｈｔｅｎｍｅｎｔｏｆｏｒｇａｎｏｉｄｓａｎｄｏｒｇａｎ－ｏｎ－ｃｈｉｐｓｆｒｏｍｔｈｅｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｏｆｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｃｉｅｎｃｅｏｆｃｏｓｍｅｔｉｃｓＬＩＮＮｉꎬＺＨＡＮＧＦｅｎｇｌａｎꎬＹＵＺｈｅｎｘｉꎬＷＡＮＧＧａｎｇｌｉꎬＬＵＹｏｎｇ(ＣｅｎｔｅｒｏｆＳａｆｅｔｙ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＥｖａｌｕａｔｉｏｎｆｏｒＣｏｓｍｅｔｉｃｓꎬＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００５０ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｎｅｗｃｏｍｐｌｅｘｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌｓｓｕｃｈａｓｏｒｇａｎｏｉｄｓａｎｄｏｒｇａｎ－ｏｎ－ｃｈｉｐｓｈａｖｅｅｍｅｒｇｅｄａｔｔｈｅｆｏｒｅｆｒｏｎｔｏｆｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈꎬｇｒａｄｕａｌｌｙｂｅｉｎｇａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｒｕｇａｎｄｃｏｓｍｅｔｉｃｒｅｓｅａｒｃｈꎬｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬａｎｄｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎｗｈｉｌｅａｔｔｒａｃｔｉｎｇｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅａｔｔｅｎｔｉｏｎ.Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｂｒｉｅｆｌｙｅｘｐｌａｉｎｓｔｈｅｂａｓｉｃｃｏｎｃｅｐｔｓꎬｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｈｉｓｔｏｒｙꎬａｎｄｔｅｃｈｎｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｏｒｇａｎｏｉｄｓａｎｄｏｒｇａｎ－ｏｎ－ｃｈｉｐｓ.Ｉｔｔｈｅｎｐｒｏｖｉｄｅｓｅｘａｍｐｌｅｓｏｆｔｈｅｉｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｓａｆｅｔｙａｎｄｅｆｆｉｃａ￣ｃｙｔｅｓｔｉｎｇｏｆｃｏｓｍｅｔｉｃｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ.Ｆｉｎａｌｌｙꎬｃｏｍｂｉｎｉｎｇｄｏｍｅｓｔｉｃａｎｄｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｃｏｓｍｅｔｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓꎬｉｔｌｏｏｋｓｆｏｒｗａｒｄｔｏｆｕ￣ｔｕｒｅｔｒｅｎｄｓｕｓｉｎｇｏｒｇａｎｏｉｄｓａｎｄｏｒｇａｎ－ｏｎ－ｃｈｉｐｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｃｏｓｍｅｔｉｃｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｓｕｐｐｏｒｔｒｅｇｕ￣ｌａｔｏｒｙｄｅｃｉｓｉｏｎ－ｍａｋｉｎｇ.ＡｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙꎬｉｔｐｒｏｐｏｓｅｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｉｓｔｙｐｅｏｆｎｅｗｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｒｏｍａｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｏｆｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｃｉｅｎｃｅｗｉｔｈａｎａｉｍｔｏｐｒｏｖｉｄｅｔｅｃｈｎｉｃａｌｒｅｓｅｒｖｅｓｆｏｒｃｏｓｍｅｔｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｔｈａｔａｌｉｇｎｓｗｉｔｈＣｈｉｎａᶄｓｓｉｔｕａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｉｎｎｏｖａｔｉｖｅａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓｉｎｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｔｏｐｒａｃｔｉｃａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｔｏｏｌｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＯｒｇａｎｏｉｄｓꎻＯｒｇａｎ－ｏｎ－ｃｈｉｐｓꎻＣｏｓｍｅｔｉｃｓꎻＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓꎻＳａｆｅｔｙꎻＥｆｆｉｃａｃｙꎻＲｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｃｉｅｎｃｅ㊀㊀自«化妆品监督管理条例»(以下简称 新«条例» )实施以来ꎬ我国化妆品监管法规体系不断完善ꎬ增加或进一步规范了关于化妆品原料管理㊁安全评估㊁质量控制和功效评价等方面的技术要求ꎬ一系列配套法规政策也逐步落地ꎬ大幅提升了我国化妆品和新原料的质量安全监管要求ꎬ推动行业进入高质量发展的新时代ꎮ新«条例»引导企业加强科技创新和研发投入ꎬ行业关注的焦点逐步转变为化妆品创新技术和评价工具的研发和使用ꎬ新原料筛选㊁安全评估㊁功效评价和制造工艺等多个领域ꎬ随之涌现出了一批新技术新方法ꎬ受到了广泛关注ꎮ例如ꎬ近期市场上出现的纳米化妆品及原料㊁生物活性肽类和植物提取物类新原料㊁合成生物学和生物发酵等新技术及新工艺ꎬ也为化妆品的测试㊁评价和监管带来了比以往更大的挑战ꎮ化妆品从研发到上市销售等全生命周期的各环节中ꎬ原料的安全性和功效性评价和监管尤为重要ꎬ需要有充分的科学依据来支持其使用安全性或功效宣称的科学性㊁真实性和可靠性ꎮ用于化妆品原料的安全与功效评价方法主要分为基于动物实验㊁非动物试验(即替代方法ꎬ包括采用离体组织或细胞模型㊁计算机模拟和理化试验等方法)㊁人体测试和消费者评价等ꎮ基于保护动物福利和伦理方面的考虑ꎬ世界范围内普遍倡导动物试验遵循 ３Ｒ原则 (即替代㊁减少㊁优化原则)ꎬ且在行业新原料㊁新技术㊁新工艺的发展趋势下ꎬ促进了化妆品研发和测试的体外替代新模型不断涌现ꎮ近１０至２０年间ꎬ随着细胞生物学和组织工程学等技术的发展ꎬ类器官和器官芯片等新型复杂体外模型(ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌｓꎬＣＩＶＭｓ)不仅是当前国际前沿和科研热点ꎬ在国内外应用于药物临床前开发㊁新药进入临床试验申请(ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌｎｅｗｄｒｕｇꎬＩＮＤ)和监管科学方面也已有成功案例ꎮ近年ꎬ类器官㊁器官芯片模型逐步开始应用于化妆品原料的研发和测试中ꎬ在未来更有望成为创新技术化妆品及新原料研发㊁测试的有力工具[１]ꎮ本文首先简要介绍了类器官㊁器官芯片的基本概念和发展历程ꎬ比较介绍了这两种模型与其他体内外模型的不同和技术优势ꎬ并列举了一些类器官和器官芯片在化妆品原料研发㊁安全和功效评价测试中最新的应用场景和实例ꎮ然后ꎬ简述了此类新技术新模型国内的研发和技术标准制定的现状ꎮ最后ꎬ结合国内外化妆品安全性功效性评价的技术要求和法规监管体系ꎬ展望了类器官㊁器官芯片应用于我国化妆品原料研发㊁安全和功效评价的未来趋势ꎬ并对此提出了切实的监管对策及建议ꎮ１㊀类器官和器官芯片的概念１.１㊀类器官㊀类器官ꎬ是由干细胞在三维(３Ｄ)培养体系中ꎬ被诱导分化㊁自组装为具有复杂空间形态的组织ꎬ与体内来源的组织或器官具有高度相似性ꎮ尽管类器官并不是真正意义上的人体器官ꎬ但能在结构和功能上模拟真实器官ꎬ能够最大限度地模拟体内组织结构及功能并能够长期稳定传代培养[２]ꎮ２００９年ＨａｎｓＣｌｅｖｅｒｓ团队使用单个ＬＧＲ５＋肠干细胞在体外成功构建了第一个具有肠隐窝－绒毛结构的肠类器官ꎬ开启了类器官技术发展的新纪元ꎮ近十多年来ꎬ随着类器官技术不断发展ꎬ胃㊁视网膜㊁脑㊁肝㊁肾㊁皮肤㊁胰腺㊁肺㊁生殖器官及附属器等类器官被相继成功构建ꎬ现主要应用于病理生理模型构建㊁药效学筛选和毒性研究㊁化妆品原料的功效和安全性评价等领域[２]ꎮ１.２㊀器官芯片㊀器官芯片(ｏｒｇａｎ－ｏｎ－ｃｈｉｐｓ)模型的产生有赖于生物医学工程的发展ꎬ其技术核心是组织工程学和微流控技术等ꎮ器官芯片是通过将多种人源细胞培养在微米甚至纳米级别的芯片中ꎬ芯片材料为细胞或微组织提供必要支撑和生长环境ꎬ甚至可以通过重构血管和神经㊁免疫系统来更好地模拟人体器官真实的生长环境ꎮ此外ꎬ基于微流控技术的器官芯片内部的流体还为培养的组织细胞提供机械力ꎬ并在各个组织腔室间流动以提供氧气㊁营养物质和生长因子等ꎬ保证芯片内组织细胞能够长时间更好地维持活性和分化表型ꎮ除了类器官和器官芯片ꎬ近年的科研论文和科技新闻报道中也常出现 类器官芯片(ｏｒｇａｎｏｉｄｓ－ｏｎ－ｃｈｉｐｓ) 这一名称ꎮ类器官芯片多指整合了类器官和器官芯片两者技术优势的一类微生理系统ꎬ既兼具类器官模型通量高的优点ꎬ又能利用器官芯片的生物材料和微流控技术来模拟更复杂的㊁更接近真实人体的组织器官生长微环境ꎮ但有学者认为器官芯片或微生理系统的材料本身并不适合类器官组织的诱导形成和后期维持培养ꎬ因此这一概念最初是存在争议的ꎮ随着类器官培养技术和生物工程技术的发展成熟ꎬ减少了对细胞组织培养基的高度依赖ꎬ提高了生物材料的组织相容性ꎬ构建真正意义上的类器官芯片模型逐步实现[３]ꎮ２㊀类器官和器官芯片的技术特点由于类器官和器官芯片本质上是两种不同的技术路线ꎬ表１中汇总梳理了传统动物模型㊁２Ｄ培养细胞模型㊁３Ｄ培养细胞模型㊁类器官模型㊁器官芯片模型和类器官芯片模型各自的技术特点ꎬ通过比较研究进一步阐明类器官和器官芯片与经典的体内/外替代模型的异同ꎮ表１㊀不同评价筛选模型的技术特点动物模型２Ｄ细胞模型３Ｄ细胞模型类器官模型器官芯片模型类器官芯片模型优势①整体模型重现性好ꎻ②技术标准成熟①人源细胞一定程度上克服种属差异性ꎬ对受试物反应更敏感ꎻ②可实现受试物的高通量筛选ꎻ③可操作性强ꎬ技术标准成熟①３Ｄ立体结构培养比２Ｄ模型更接近细胞真实生长环境ꎬ更具生理相关性提高预测能力ꎻ②可实现高通量筛选ꎻ③技术较为成熟ꎬ标准可控①人源干细胞分化形成ꎬ结构和功能表达更接近人体器官ꎬ能重现不同组织结构对受试物反应的细微差异ꎬ预测能力更强ꎻ②高通量筛选ꎻ③更灵活地构建疾病模型ꎬ反映不同人种间差异ꎬ应用于个体化和精准医疗ꎻ④需要一定培养技术ꎬ现已有类器官培养和检测的成熟的试剂盒①人源组织细胞来源克服种属差异ꎬ提高预测能力ꎻ②能整合不同组织器官ꎬ模拟不同器官间的协同作用或相互影响ꎬ反映人体局部 系统对受试物的反应ꎻ③可以通过重构血管和免疫微环境ꎬ进行疾病模型构建㊁药物化妆品原料的筛选和作用机制研究ꎻ④在药物开发等过程中缺乏合适动物模型时可作为替代检测模型ꎬ已有被国外监管机构接受的成功案例①整合类器官和器官芯片的技术优势ꎬ可以更好地模拟人体真实生理环境和结构功能ꎬ提高预测力的同时可进行高通量筛选研究ꎻ②缺乏合适动物模型时可作为替代检测模型ꎬ已有被国外监管机构接受的成功案例不足①种属差异性常导致模型预测力不足ꎻ②成本较高①与实际生物体差距较大预测能力有限ꎻ②成本较低①常采用生物支架培养ꎬ对细胞状态和后续测试可能产生一定干扰ꎻ②成本略高于２Ｄ细胞培养①与真实人体器官环境相比尚缺乏血液流体㊁免疫微环境等的构建ꎻ②培养成本高于传统模型ꎻ③国内外技术标准体系建设刚起步①需要依赖生物医学工程材料和外部的微流控㊁微泵等技术装置ꎻ②不同研发技术背景的器官芯片平台通常需经过组织培养㊁芯片和仪器操作培训后使用ꎻ③成本较高ꎬ不适用于高通量筛选ꎻ④国内外技术标准建设刚起步情况同器官芯片模型３㊀类器官和器官芯片在化妆品原料研发及评价中的应用㊀㊀化妆品原料的安全性和功效性评价不仅是原料研发的关键ꎬ更是各国化妆品质量安全监管的重要部分ꎮ在全球范围内化妆品测试普遍提倡减少动物试验的大趋势下ꎬ很多国家陆续禁止了化妆品的动物测试ꎬ提倡使用体外替代方法ꎬ如细胞试验㊁计算机模拟预测和理化试验等ꎮ欧盟委员会消费者安全科学委员会(ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＣｏｎｓｕｍｅｒＳａｆｅｔｙꎬＳＣＣＳ)每年发布的化妆品及其原料安全性评估指南中显示ꎬ近年来ＳＣＣＳ一直关注能够替代动物实验的新技术方法(ｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓꎬＮＡＭ)[５]ꎮ类器官和器官芯片作为一类极具潜力的ＮＡＭꎬ近年在化妆品评价的领域也有广泛应用ꎮ３.１㊀化妆品原料安全性评价㊀类器官既能在体外长期培养ꎬ又能维持稳定的表型和遗传学特征ꎬ结构和功能更接近于体内器官ꎬ更适合进行特定靶器官的毒理学研究ꎮ此外ꎬ干细胞可诱导形成不同分化方向和程度的类器官组织ꎬ更能真实地反映出不同人种㊁人体间对受试物毒性反应的差异ꎮ例如ꎬ皮肤类器官能够不仅能形成具有表皮㊁真皮和皮下脂质等全层皮肤ꎬ还包含毛囊细胞和汗腺样细胞等皮肤附属器ꎬ重构更完整的皮肤屏障功能ꎬ适用于化妆品原料的高通量毒性筛选[６－１０]ꎬ如利用皮肤类器官对具有抗氧化功能的化妆品原料墨角藻黄素的功效和安全性进行研究[１１]ꎮ或将纹身色素直接注射入类器官的真皮层ꎬ可导致细胞毒性和炎症因子升高ꎬ证明类器官模型在毒性测试中具有敏感性[１２]ꎮ在目前众多利用组织工程技术构建的人体皮肤模型中ꎬ重组人表皮模型是技术上最成熟的模型之一ꎬ已被应用于皮肤刺激性和腐蚀性测试等ꎬ已经过实验室间验证并被经济合作与发展组织(ＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｆｏｒＥｃｏｎｏｍｉｃＣｏｏｐｅｒａｔｉｏｎａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬＯＥＣＤ)收录于试验指南ＴＧ４３９和ＴＧ４３１中ꎬ填补了药品及化妆品领域动物替代方法的需求缺口ꎮ在皮肤芯片的应用方面ꎬ我国科研人员研发了１种具有致密皮肤屏障的表皮芯片模型ꎬ已完成对十多种常用化妆品原料的检测验证ꎬ器官芯片产生的数据结果与动物试验结果具有较好的相关性ꎬ有望作为皮肤刺激性筛选的替代模型[１３]ꎮ皮肤芯片还可用于防晒霜中常用纳米原料二氧化钛的安全性研究ꎬ研究结果显示由石英底座构建的皮肤芯片在模拟紫外线照射及纳米材料毒性研究中具有一定优势[１４]ꎮ通过构建皮肤和肝脏㊁肾脏㊁肺等其他器官的级联系统ꎬ可对化妆品原料的局部和系统毒性及体内毒性代谢动力学特征进行研究ꎬ获得多种毒代动力学参数ꎬ甚至重现人体内代谢的首过效应特征等[１５]ꎮ此外ꎬ口腔黏膜器官芯片还能够模拟人源口腔黏膜组织细胞的生长㊁重塑口腔微生物存在的微生态ꎬ为评价口腔清洁类产品的原料提供了更多的有效模型[１６－１７]ꎮ特别是当新技术㊁新工艺化妆品原料的评价中缺乏合适的动物模型时ꎬ器官芯片可为原料的局部或系统毒性评估提供更多有效的评价工具[１８]ꎮ３.２㊀化妆品原料功效性评价㊀为了应对化妆品创新的未来趋势ꎬ国内外研究人员也在功效评价模型研发方面不断突破ꎬ尝试将类器官和器官芯片模型应用于化妆品原料的功效评价ꎮ化妆品原料能否穿透真皮层是评价其功效成分能否作用于局部和/或全身ꎬ以及安全性的重要因素ꎬ通常采用体外透皮吸收试验进行检测ꎮ科研人员曾采用不同脂溶性的受试物咖啡因㊁水杨酸和睾酮在皮肤芯片上进行了皮肤吸收试验ꎬ结果显示皮肤芯片模型的检测通量和结果重现性均优于传统的Ｆｒａｎｚ扩散池法[１９]ꎮ亦可通过皮肤芯片结合皮肤代谢转运的计算模型来评估受试物透皮吸收特性㊁扩散速率㊁在局部皮肤和人体其他器官分配蓄积的情况[２０]ꎮ此外ꎬ文献中报道可通过皮肤芯片对辅酶Ｑ１０㊁姜黄素等化妆品原料的抗皱功效进行评价[２１－２２]ꎬ还可通过皮肤芯片模拟紫外线对皮肤细胞辐射ꎬ重现皮肤细胞老化的过程ꎬ并对新原料的抗皱功效进行评价筛选[２３]ꎮ目前国内不仅已建立表皮㊁真皮和全皮模型ꎬ还通过构建黑色素皮肤芯片模型成功进行化妆品美白功效的评价[２４]ꎮ此前多数器官芯片不适用于高通量筛选ꎬ而国内外科研团队均正在致力于开发的基于 器官芯片＋ＡＩ 的原料快速筛选平台ꎬ鉴于ＡＩ在快速识别作用靶点和化合物毒性预测方面的良好表现和巨大潜力ꎬ该项 跨界技术 能够解放繁复的人工操作ꎬ提升试验效率和结果重现性ꎬ获得更接近人体的精准实验数据ꎬ从而提高人体试验的成功率ꎬ未来有望成为原料高通量筛选的有力工具ꎮ４㊀国内外类器官和器官芯片的发展㊁技术标准和监管现状４.１㊀国际㊀国际类器官和器官芯片相关技术飞速发展ꎬ直到２０２２年国际首次采纳了赛诺菲提供的基于类器官芯片试验中获得的临床前药效数据ꎬ并获批美国ＦＤＡ的ＩＮＤ申请ꎬ迎来该技术的里程碑ꎮ这一标志性事件让制药工业界认为类器官和器官芯片有望成为突破临床前药物开发限制的革新技术ꎬ掌握这一技术将在一定程度上改变药物研发的现有周期和技术规则ꎮ这也标志着现在类器官和器官芯片的研发不是仅停留在科研层面ꎬ而是已经逐渐发展成熟ꎬ并开始为监管机构接受和认可ꎮ２０２２年６月ꎬ美国众议院通过的«２０２２年食品和药品修正案»(Ｈ.Ｒ.７６６７－ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｍｅｎｄｍｅｎｔｓｏｆ２０２２)中ꎬ首次将器官芯片和微生理系统作为独立的药物非临床试验评估体系纳入法案ꎬ与细胞模型㊁计算机模型和动物模型等视为同等重要的研究手段ꎮ４.２㊀国内㊀我国中科院大连化学物理研究所林炳承教授团队最初于２１世纪前期开展了基于微流控芯片技术的细胞研究工作ꎬ初步构建了人肝微粒体芯片ꎬ并于２０１０年正式启动器官芯片的研究工作[４]ꎮ随后１０年中ꎬ国内多家高校㊁科研院所和研发企业加入类器官和器官芯片的研发中ꎮ２０２３年５月我国第一个结合了基于心脏芯片进行药效学筛选的数据获得的候选药物已获批进入临床试验ꎬ拟用于治疗肥厚型心肌病及其导致的心力衰竭ꎮ这一突破性进展也是我国器官芯片模型应用于新药研发中的里程碑ꎮ随后ꎬ又有多项采用我国自主研发的肿瘤类器官芯片进行临床前药效学筛选的创新生物药品[如嵌合抗原受体Ｔ细胞免疫疗法(ＣＡＲ－Ｔ)㊁双特异性抗体等]成功获批ＩＮＤ申请ꎮ２０２０年ꎬ中国工程院将器官芯片评选为全球工程前沿技术ꎬ２０２１年初国家科技部将 基于类器官的恶性肿瘤疾病模型 列为 十四五 国家重点研发计划中首批重点专项ꎬ同年国家药品审评中心首次在发布的«基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则(试行)»中提到 ３Ｄ细胞模型㊁类器官和微流体模型 ꎬ推荐其作为基因修饰细胞治疗产品的有效性和安全性评估中当缺乏合适动物模型时可采用的评价模型ꎮ国内类器官和器官芯片行业尚处于起步阶段ꎬ近两年我国逐渐开始发布或立项了部分类器官和器官芯片相关规范㊁团体标准或行业共识ꎮ２０２２年７月中国抗癌协会等联合发布了«类器官药物敏感性检测指导肿瘤精准治疗临床应用专家共识»ꎬ同年由东南大学等多家单位牵头制定的国家推荐性标准 «皮肤芯片通用技术要求»成功立项ꎬ以期促进药品㊁化妆品等皮肤相关应用场景的体外评价方法和工具的标准化ꎮ２０２３年８月清华大学附属北京清华长庚医院等单位组织撰写的«人肝祖细胞类器官构建㊁质量控制与保藏操作指南»等３项团标正式发布ꎮ以上国标㊁团标的立项或发布ꎬ初步开启了国内类器官与器官芯片技术标准体系的建立ꎬ为今后的技术创新和产业发展奠定了一定的基础ꎮ同时也凸显此类创新技术工具相关监管科学研究的迫切需要ꎬ建立不同层级㊁互为补充的创新 两品一械 技术标准ꎬ稳步推进 两品一械 技术支撑体系建设ꎮ５㊀类器官和器官芯片的化妆品监管科学研究及监管建议㊀㊀为了规范此类新技术新工具在化妆品及原料研发中的应用ꎬ结合我国化妆品法规和行业现状ꎬ提出了该技术在化妆品原料安全性和功效性评价中的监管建议ꎬ并阐述了其对化妆品监管科学研究的影响和启示ꎮ５.１㊀类器官及器官芯片应用于化妆品原料研发的监管建议５.１.１㊀集合多学科领域专家人才共同参与相关技术标准的制定㊀类器官和器官芯片研究是一门医㊁理㊁工新兴交叉学科ꎬ为保证相关技术标准的科学性㊁前沿性㊁实用性和普遍适用性ꎬ建议由监管部门和研发一线高校及科研单位为主导ꎬ集合企业㊁临床医生㊁行业协会㊁检验检测和委托研究机构(ｃｏｎｔｒａｃｔｒｅｓｅａｒｃｈｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎꎬＣＲＯ)的科学家等专业人才共同参与标准指南的制修订ꎬ遵循对各类技术来源的类器官和器官芯片的准入标准公平一致㊁公开透明的原则ꎬ５.１.２㊀类器官和器官芯片模型通用的质量控制关注点㊀对于类器官模型在各类应用场景下的技术监管关注点包括且不限于:①类器官培养的生物支撑材料质量控制ꎬ如基质胶质量㊁批次等相关信息及证明文件ꎬ材料的生物相容性等ꎻ②细胞/组织/器官类似物的来源和ＣｏＡ(ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅｏｆａｎａｌｙｓｉｓꎬ即分析证明)文件ꎬ与临床组织或剂量的换算当量(若有)ꎻ③需对表征类器官分化程度㊁结构及功能特异性的生物标志物进行试验验证ꎻ若建立屏障结构ꎬ需对表征结构致密性和功能完整性的参数进行试验验证ꎻ④开展不少于测试试验周期的长期稳定性试验ꎬ验证指标包括表征类器官结构和功能的相关标志物基因和蛋白水平表达量或细胞水平分泌量等ꎻ⑤对于应用场景下为达到试验目的所选择的一系列试验方法㊁检测指标㊁质控设置和统计学方法的科学性㊁合理性㊁特异性ꎬ以及结果评价的决策树(如有)等ꎬ应进行分析说明ꎻ⑥类器官模型测试评价结果的验证ꎬ包括结果特异性㊁准确性㊁灵敏度和可重复性ꎬ以及方法学验证所选择的阴性/阳性对照物的相关信息等ꎮ对于器官芯片模型在各类应用场景下的技术监管关注点ꎬ除了类器官的①~⑥项以外ꎬ还包括且不限于:⑦器官芯片模型整体设计外观示意图及说明ꎬ包括共培养腔室和连接微通道的数量㊁液体容积ꎬ以及液流通过互相连通的不同腔室间的顺序等ꎻ⑧芯片材料的工作温度耐受性㊁材质透光性㊁密封无菌性㊁生物相容性㊁材料对溶液及不同受试物的吸附性等ꎻ⑨芯片内氧气㊁营养物质梯度ꎬ模型系统内的流体力学计算公式计算过程等ꎮ５.２㊀类器官及器官芯片应用于化妆品原料安全性评价的监管建议５.２.１㊀研究必要性㊀在国际化妆品监管合作组织(ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｏｐｅｒａｔｉｏｎｏｎＣｏｓｍｅｔｉｃＲｅｇｕｌａｔｉｏｎꎬＩＣ￣ＣＲ)提出的下一代风险评估(ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒｉｓｋａｓ￣ｓｅｓｓｍｅｎｔꎬＮＧＲＡ)思路框架中ꎬ推荐采用３Ｄ模型㊁类器官和器官芯片模型等ＣＩＶＭｓꎬ结合计算机模拟预测[如定量构效关系(ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓꎬＱＳＡＲ)模型㊁生理药代动力学(ｐｈｙｓｉｏ￣ｌｏｇｉｃａｌｌｙｂａｓｅｄｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃꎬＰＢＰＫ)模型等]和高通量筛选工具ꎬ评估受试物人体内暴露的情况㊁代谢特征及潜在毒性作用机制等ꎬ有助于做出更加科学的风险监管决策和早期干预方案[２５－２６]ꎮ在未来的化妆品评估体系下ꎬ类器官和器官芯片有潜力用于原料的安全性评估㊁剂量－毒性效应关系和安全边际值的预测㊁毒性机制研究等[２７－２８]ꎮ５.２.２㊀建立适合我国国情的原料安全性评价新模型工具的技术标准指南㊀一项新技术逐渐发展成熟ꎬ再到规范化和标准化ꎬ并形成技术标准或方法指南ꎬ最终被权威监管机构收录ꎮ具体需要结合本国国情和监管法规的要求ꎬ对模型稳定性进行表征ꎬ相关检测指标进行验证ꎬ并操作和检测技术进行标准化等ꎬ通过实验室间联合验证ꎬ最终将科研研究结果和验证试验数据转化为技术标准或方法指南ꎮ我国化妆品新原料在注册备案时ꎬ在毒理学终点的评估中认可使用动物替代方法ꎬ但对于使用替代方法的合规性做出了明确要求ꎬ如应采用整合测试和评估方法㊁方法选择的优先级等ꎮ５.２.３㊀针对创新模型工具的技术特点制定科学性㊁前沿性的技术标准指南㊀根据我国«化妆品安全技术规范»«化妆品安全评估技术导则»以及欧盟ＳＣＣＳ㊁ＩＣＣＲ提出的当前和下一步化妆品原料风险评估框架等文件ꎬ并参考药品领域美国ＦＤＡ预测毒理学路线图和ＥＭＡ３Ｒｓ检测方法监管标准等文件ꎬ建议对于应用类器官和器官芯片进行安全性评价的要点ꎬ除了 ５.１.２ 项下质量控制通用关注点①~⑨以外ꎬ还需关注毒性靶器官的特异性标志物在基因/蛋白水平表达量㊁细胞水平分泌量的改变ꎬ以及组织器官病理学水平的改变ꎻ安全评估相关参数如ＮＯＡＥＬ(ｎｏｏｂｓｅｒｖｅｄａｄｖｅｒｓｅｅｆｆｅｃｔｌｅｖｅｌꎬ无可见有害作用水平)㊁受试物毒代动力学参数(若有)㊁局部(单一组织器官)暴露量㊁(芯片内)系统暴露量等对于最终结果分析评估的重要影响等ꎮ虽然目前仍有不少毒理学家对类器官和器官芯片模型替代临床前动物毒理学试验持有谨慎态度ꎬ也许距离器官芯片和微生理系统完全取代动物试验还有一段路要走ꎬ但从化妆品风险评估框架的未来发展趋势可以看到ꎬ类器官和器官芯片似乎更有希望率先成为化妆品原料风险评估数据链中重要的一环ꎬ或作为弥补创新技术化妆品和新原料的安全及功效评价中数据缺口的有力工具ꎮ５.３㊀类器官及器官芯片应用于化妆品原料功效性评价的监管建议５.３.１㊀鼓励原料功效评价新技术工具创新性研究和多维度综合评价㊀化妆品及新原料的功效宣称也是我国化妆品监管的重点之一ꎬ化妆品在上市前应对其功效宣称进行科学的评价ꎬ新原料注册备案则要求提交 功能依据资料 ꎬ而保证化妆品及新原料功效宣称有效性的基础则是采用合适的评价模型和方法㊁进行科学合理的分析㊁建立科学严谨的功效评价体系ꎮ在国家药监局公布的２６种化妆品功效宣称中ꎬ抗皱㊁紧致功效等需要开展实验室或人体功效试验ꎬ试验方法一般采用体外试验和/或人体试验ꎬ体外测试中ꎬ除了生物化学法㊁细胞生物法ꎬ未来还可能用到３Ｄ皮肤模型㊁类器官和器官芯片等新模型方法ꎮ鼓励对化妆品原料功效开展人体和非人体的体内/外多维度综合评价ꎬ有效提升功效评价和相关宣称的科学合理性㊁合规性ꎮ５.３.２㊀积极申报并开展化妆品原料功效评价新技术工具的前瞻性㊁系统性课题研究和技术标准的制修订㊀我国化妆品及新原料的功效评价研究和监管起步相对较晚ꎬ相关方法和标准尚未完善ꎮ面对技术创新和品种多元化的趋势ꎬ当前的评价方法和模型已不能完全满足市场需求ꎬ驱动业界通过创新研究陆续转化推出多项功效评价的行业标准和团体标准ꎬ体现了对于功效评价 企业自律㊁行业监督㊁社会共治 的现代监管模式ꎬ有助于行业健康发展ꎮ与此同时ꎬ一些问题也逐渐显现ꎬ例如ꎬ对于一些前沿技术的应用ꎬ尚缺乏规范统一的技术标准指南ꎬ对一贯坚持的监管有效性和公平性均带来了一定的挑战ꎮ此外ꎬ创新化妆品和原料功效评价的另一难点是有时缺乏合适的体内㊁外模型ꎬ特别是针对祛斑美白㊁抗皱等特殊功效机理的㊁或可能被归属为具有较高活性的新原料ꎬ其功效评价和机制研究是否科学合理更关系到其安全使用量的界定和安全性评价的要求ꎬ避免功效宣称超出化妆品的定义范畴ꎮ在功效评价模型的研发中ꎬ企业也需根据我国法规和行业现状ꎬ提前做好规划和布局ꎬ使研发成果能够应用和转化ꎮ为解决以上问题ꎬ开展前瞻性㊁系统性的科研课题和监管科学研究都将有助于我国化妆品原料功效评价研究水平的提升ꎬ促进前沿科技成果转化为监管科学工具ꎬ推动行业高质量发展ꎮ６㊀结语及展望类器官和器官芯片模型可以很好地弥补化妆品行业飞速发展与检测技术方法不足之间的缺口ꎬ未来在化妆品原料的研发㊁快速筛选㊁安全和功效性评价方面有良好发展前景ꎮ中国食品药品检定研究院(以下简称 中检院 )作为国家药监局直属的技术支撑单位ꎬ近年来多次与国内外高校㊁科研单位合作研究类器官和器官芯片相关技术及其在药品㊁化妆品领域的评价应用ꎮ２０２２年中检院主持并联合东南大学等多家机构ꎬ启动了 十四五 国家重点研发计划项目 基于化妆品和生物制品等产品检验的动物实验替代技术研究 ꎬ将构建诱导多能干细胞分化形成的国产３Ｄ皮肤模型ꎬ并通过微流控芯片动态培养ꎬ构建具有良好生物屏障功能的体外皮肤器官芯片㊁肝－皮肤双器官芯片等模型ꎬ为应用非动物测试数据开展化妆品原料安全评估并形成体外系统性毒性整合评估策略ꎬ提供研究思路和新工具ꎬ有望实现与国际前沿技术同步甚至部分领先ꎮ同时作为监管部门ꎬ中检院也做好技术储备ꎬ根据市场环境和人民需求ꎬ时刻紧跟前沿技术发展趋势ꎬ及时发布配套技术法规文件ꎬ不断优化监管措施ꎬ以应对化妆品行业飞速发展对监管带来的挑战ꎮ参考文献:[１]㊀ＦＩＬＡＩＲＥＥꎬＮＡＣＨＡＴ－ＫＡＰＰＥＳＲꎬＬＡＰＯＲＴＥＣꎬｅｔａｌ.Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｍａｉｎｓａｆｅｔｙｔｅｓｔｓｏｆｃｏｓｍｅｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｎｅｗｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ[Ｊ].ＩｎｔＪＣｏｓｍｅｔＳｃｉꎬ２０２２ꎬ４４(６):６０４－６１３.[２]ＳＡＫＡＬＥＭＭＥꎬＤＥＳＩＢＩＯＭＴꎬＤＡＣＦꎬｅｔａｌ.Ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｓｐｈｅｒｏｉｄｓａｎｄｏｒｇａｎｏｉｄｓꎬａｎｄｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆｕｓｅｉｎｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓａｎｄｍｅｄｉｃｉｎｅ[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＪꎬ２０２１ꎬ１６(５):ｅ２０００４６３.。