土壤DNA 纯化难点——腐殖质

土壤腐殖质的研究摘要: 土壤有机质一直是土壤学研究领域的重点，作为有机质主体的土壤腐殖质的研究更是成为土壤学、环境化学和地球化学等领域的热点方向之一。

文中通过对土壤腐殖质的组成和结构，土壤腐殖质的性状以及土壤腐殖质分析技术三方面的研究简单阐述了土壤腐殖质的基本情况和对土壤的影响以及对在研究中有待进一步用分析化学解决的几个问题也进行了探讨。

关键词: 土壤腐殖质土壤肥力核磁共振红外光谱1 引言土壤腐殖质是一类高分子有机物，是土壤有机质的主体，是动、植物残体通过微生物分解、合成的产物，是土壤肥力的重要标志。

由于它具有胶体特性，能吸附较多的阳离子，因而使土壤具有保肥力和缓冲性，它还能使土壤疏松和形成结构，从而改善土壤的物理性。

它也是土壤微生物必不可少的碳源和能源。

腐殖质最显著特征之一就是能与金属离子、氧化物、氢氧化物、矿物质和包括毒性污染物在内的有机物发生相互作用，形成具有千差万别的化学和生物学稳定性的溶于水和不溶于水的缔合物。

这些作用对于土壤养分的保蓄，土壤良好结构的形成以及土壤有害物质的毒性消除具有重大的意义[1]。

现今，随着化肥和农药的使用越来越普遍以及化学工业发展造成的环境污染的加剧，实施可持续的有机农业便成为世界农业发展的必然趋向。

因此，进行土壤有机质的研究对于农业发展就是得相当重要了。

而土壤腐殖质的形成、结构及性质的明确了解是阐明土壤保肥、供肥机制的前提，也是认识土壤与作用间养分循环的基础，同时也为农业生产上有机培肥措施的制定及有机肥料的研制提供理论依据。

近年来，现代仪器分析技术的发展为土壤腐殖质的研究提供了先进的手段，使其研究有了许多新的突破。

本文将讨论土壤腐殖质的组成和土壤腐殖质的分析化学研究情况。

2 土壤腐殖质的组成从18世纪80年代开始，土壤中的一类黑色物质引起了人们的广泛关注，随着对其化学组成和结构研究的深入，最后被定名为土壤腐殖质[2]。

土壤腐殖质是动、植物残体在微生物作用下分解并再合成的一类深色、难分解、大分子有机化合物[3]。

土壤腐殖质的提取、分离与纯化综述大车神[摘要]腐殖质（humic substances; HS）是一类呈棕黑色或棕褐色、无定形、酸性、亲水性、多分散的有机物质，广泛存在于土壤、水体(如河流、湖泊、海洋和地下水等)以及沉积物中，根据溶解性，腐殖质可分为3类：腐殖酸(HA,又称胡敏酸，只溶于碱不溶于酸)，富里酸(FA，又称黄腐酸，既溶于酸又溶于碱)和胡敏素(Humin，又称腐殖素、腐黑物，酸碱都不溶) 殖酸、富里酸广泛存在于土壤、水体以及沉积物中，对有金属离子、机污染物、及水处理过程中消毒副产物的形成有重要的影响。

本文通过查阅文献，总结目前学者对于腐殖酸的提取、分离与纯化的相关技术进行阐述。

【关键词】腐殖酸、富里酸、胡敏酸、胡敏素、分离提纯一、概述土壤是人类赖以生存的物质基础,是人类不可缺少、不可再生的自然资源[1,2]。

土壤有机质是土壤的重要组成部分,在土壤肥力、环境保护、农业可持续发展等方面都具有重要作用。

其主要成分包括有机质及其他有机物，其中腐殖质类物质占有机质总量的85%～95%。

腐殖质（humic substances; HS）是一类呈棕黑色或棕褐色、无定形、酸性、亲水性、多分散的有机物质，广泛存在于土壤、水体(如河流、湖泊、海洋和地下水等)以及沉积物中[3]。

根据溶解性，腐殖质可分为3类：腐殖酸(HA,又称胡敏酸，只溶于碱不溶于酸)，富里酸(FA，又称黄腐酸，既溶于酸又溶于碱)和胡敏素(Humin，又称腐殖素、腐黑物，酸碱都不溶)[4,5]，其中可提取腐殖质(HA+ FA)组成复杂，存在氨基、羟基、醌基、羰基和甲氧基等多种基团，能够对水体中各种机污染物和重金属的迁移转化进行影响和控制[6-8]。

富里酸( Fulvicacid，简称 FA)属于腐植酸的一种，别名为黄腐殖酸，是土壤腐植质的组成成分之一。

颜色较浅，多呈黄色。

主要由碳、氢、氧和氮等元素构成，碳氢比值较低，分子式为C14H12O8[9,10]。

土壤DNA和植物DNA提取方法现在主要的提取方法有：氯仿异戊醇抽提法、离心柱试剂盒法和磁珠法。

其中磁珠法作为一种新型核酸提取法，相较于传统方法来说优势明显：（1）生物磁珠具有小尺寸效应和表面效应，能够高效提取DNA；（2）磁珠表面能够进行化学修饰，从而与DNA进行特异性吸附；（3）磁珠法用时少，操作简单，且对环境无污染。

一、提取难点要想在土壤和植物中提取DNA，样本的液化是关键的一步，像土壤和植物都是固体样本，很难直接在试剂盒的作用下用于核酸提取。

提取过程中固体样本会跟杂质一样，严重阻碍磁珠吸附核酸，并且损耗大量的磁珠位点，很难取得良好的提取效果。

所以，在土壤和植物DNA提取时，要对样本进行预处理。

土壤的预处理首先需要浸泡，必要时可以进行水浴，因为从土壤中提取DNA并非提取土壤本身，而是提取土壤中存在的微生物DNA。

然后在样本中加入氧化锆-二氧化硅微珠和缓冲液，接着对其进行离心，取上清液即可用于进一步提取。

在植物中提取DNA时，需要剪取适量样本，对其进行研磨。

研磨时如果需要保护RNA，可以采用液氮研磨的方式。

如果不需要提取RNA，也可以加入裂解液或者生理盐水帮助研磨成匀浆状态，如果所得匀浆较为浑浊，可对其进行适当离心处理，取上清液即可用于进一步提取。

二、磁珠法提取试剂盒深圳市朗司医疗科技有限公司，开发出了新型高效的土壤和植物基因组DNA提取试剂盒，能够最大限度的去除土壤和植物提取DNA过程中所产生的杂质，保留目标所需DNA。

【图：使用朗司土壤试剂盒提取4种土壤样本的电泳结果】【图：使用朗司植物试剂盒提取叶片（50mg）总DNA的电泳结果，S1-S16为重复实验】三、磁珠法核酸提取仪（16通量）结合磁珠法核酸纯化技术，配合公司自主研发的16通量LemnisCare MGX-1600全自动核酸提取仪，可以完成目标核酸的自动提取，更加安全可靠，大大节省科研人员操作的同时，得到高纯度的土壤和植物DNA。

土壤DNA提取的解决专家简介土壤样品含有大量的微生物，其中绝大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究。

从土壤样品中提取DNA是研究土壤微生物最为有效的方法。

目前从土壤样品中提取微生物DNA的方法主要有直接法和间接法。

直接法是指把土壤样品放在裂解液中，经过有效的破壁方法使微生物的DNA全部释放到裂解液中，然后再进行分离提取，如Zhou的方法。

间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中，如Buffer PBS等，把微生物从土壤中分离出来，然后再进行DNA的提取。

间接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金属盐对DNA 提取带来的影响，但是这种方法会丢失许多微生物，得到的DNA 并非土壤样品中的全基因组(宏基因组)，目前已经很少研究者会采用这种方法。

从土壤样品中直接提取DNA可最大可能性地获得全基因组，但是这种方法却面临以下几个问题：1.腐殖酸的污染。

土壤中，特别是森林，草地土壤含有非常丰富的腐殖酸。

腐殖酸是一系列的有机物分子，部分分腐殖酸同核酸分子非常类似，在纯化过程中非常难于去除。

微量的腐殖酸污染都会导致下游应用，如PCR，酶切的失败。

2.裂解方法。

土壤样品中含有各种微生物，如细菌和真菌等。

革兰氏阳性细菌和真菌都含有非常厚的细菌壁，让这些微生物的细胞壁有效破裂是提取高产量宏基因组DNA的关键。

由于土壤样品的复杂性，使用酶法(如溶菌酶，破壁酶，蜗牛酶)或液氮研磨都不可行，因为土壤中含有各种金属离子或抑制因子导致消化酶的活性失活，或土壤中的沙粒等会导致液氮研磨很难进行。

3.DNA得率难于控制。

土壤样品或因肥沃，或因贫瘠，或因含水量丰富，或因干枯，或因取样的深浅度，都会造成微生物数量和品种发生剧烈改变。

在一个小范围的土壤样品DNA含量往往会差别成千上百倍。

此外，某些土壤中含有的化学成分，如重金属盐，粘土物质都会造成DNA得率降低。

Magen公司的HiPure Soil DNA Kit采用硅胶柱纯化技术，是专门为土壤DNA提取为设计的。

土壤腐殖质的提取、分离与纯化综述土壤腐殖质的提取、分离与纯化综述大车神[摘要]腐殖质（humic substances; HS）是一类呈棕黑色或棕褐色、无定形、酸性、亲水性、多分散的有机物质，广泛存在于土壤、水体(如河流、湖泊、海洋和地下水等)以及沉积物中，根据溶解性，腐殖质可分为3类：腐殖酸(HA,又称胡敏酸，只溶于碱不溶于酸)，富里酸(FA，又称黄腐酸，既溶于酸又溶于碱)和胡敏素(Humin，又称腐殖素、腐黑物，酸碱都不溶) 殖酸、富里酸广泛存在于土壤、水体以及沉积物中，对有金属离子、机污染物、及水处理过程中消毒副产物的形成有重要的影响。

本文通过查阅文献，总结目前学者对于腐殖酸的提取、分离与纯化的相关技术进行阐述。

【关键词】腐殖酸、富里酸、胡敏酸、胡敏素、分离提纯一、概述土壤是人类赖以生存的物质基础,是人类不可缺少、不可再生的自然资源[1,2]。

土壤有机质是土壤的重要组成部分,在土壤肥力、环境保护、农业可持续发展等方面都具有重要作用。

其主要成分包括有机质及其他有机物，其中腐殖质类物质占有机质总量的85%～95%。

腐殖质（humic substances; HS）是一类呈棕黑色或棕褐色、无定形、酸性、亲水性、多分散的有机物质，广泛存在于土壤、水体(如河流、湖泊、海洋和地下水等)以及沉积物中[3]。

根据溶解性，腐殖质可分为3类：腐殖酸(HA,又称胡敏酸，只溶于碱不溶于酸)，富里酸(FA，又称黄腐酸，既溶于酸又溶于碱)和胡敏素(Humin，又称腐殖素、腐黑物，酸碱都不溶)[4,5]，其中可提取腐殖质(HA+ FA)组成复杂，存在氨基、羟基、醌基、羰基和甲氧基等多种基团，能够对水体中各种机污染物和重金属的迁移转化进行影响和控制[6-8]。

富里酸( Fulvicacid，简称 FA)属于腐植酸的一种，别名为黄腐殖酸，是土壤腐植质的组成成分之一。

颜色较浅，多呈黄色。

主要由碳、氢、氧和氮等元素构成，碳氢比值较低，分子式为C14H12O8[9,10]。

土壤DNA提取：常用土壤DNA分离试剂盒解决方案土壤中的微生物资源非常丰富，但用传统技术培养的微生物仅占微生物总数的0.01％~10％，且大部分微生物处于不可培养的状态，使相当多的菌种不能被充分地开发和利用。

从土壤中提取的DNA，是微生物、动植物遗体等的总DNA。

由于土壤微生物成分复杂，常规提取总DNA的方法难以去除腐殖酸，而腐殖酸会抑制聚合酶链式反应（PCR）扩增中的TaqDNA聚合酶以及酶切反应的限制性内切酶活性。

另外，土壤质地和成分的差异也会影响土壤微生物DNA的提取效果。

因而，从土壤中提取DNA，腐殖物质等抑制因子的去除就成为了重中之重。

如何从土壤样本中提取纯化DNA？Norgen土壤DNA分离试剂盒为从土壤样本中检测微生物提供了一种方便、快速的方法。

所有类型的土壤样品均可使用该工具包进行处理，包括普通土壤样品和腐殖酸含量高的难处理土壤样品，如堆肥和粪便。

该试剂盒使用提供的OSR（有机物去除）溶液去除所有微量腐殖酸和PCR抑制剂。

然后使用一种简单快速的旋转柱程序进一步纯化DNA。

总基因组DNA可以从土壤中发现的各种微生物中分离和纯化，如细菌、真菌和藻类。

纯化的DNA质量最高，与下游PCR应用完全兼容，因为在分离过程中去除了所有腐殖酸物质和PCR抑制剂。

该土壤DNA分离试剂盒具有以下特点：1.快速简便的土壤样品中微生物检测方法；2.处理所有土壤类型，包括常见的土壤样品和腐植酸含量高的难处理的土壤样品，如堆肥和粪肥；3.使用OSR（Organic Substance Removal）溶液去除有机物质；4.从DNA样本中去除所有腐殖酸；5.使用快速离心柱形式进行快速简便的处理；6.从包括细菌、真菌和藻类在内的各种微生物中分离出高质量的总DNA；7.纯化的DNA质量很高，完全兼容下游PCR应用，因为在分离过程中去除了腐殖酸物质和PCR抑制剂。

从表层土壤和粘土样品中分离出的DNA浓度比较。

Norgen土壤DNA提取试剂盒和Competitor M的试剂盒用于从250 mg表层土壤和粘土样品中分离DNA。

土壤腐殖质对作物生长及土壤环境的影响解丽萍土壤腐殖质作为土壤的一种有机质，主要是植物残体在微生物的作用下分解和转化形成的，在保持土壤肥力与结构方面起着重要的作用，从而影响作物生长与产量。

随着现代农业的不断发展，土壤退化、腐殖质流失等现象日趋严重，气候变化对土壤管理提出了新挑战。

探讨土壤腐殖质的有效管理与优化策略对确保粮食安全与农业可持续发展有着十分重要的意义。

1土壤腐殖质的组成与土壤结构的关系1.1土壤腐殖质及其组成土壤腐殖质是一种由植物、动物和微生物分解生成的有机物质，在土壤中形成一种从深褐色到黑色的复合物，富含碳、氢、氧以及少量的氮、磷、硫等元素，也含有微生物和土壤动物的生物组分。

1.2土壤腐殖质与土壤结构之间的关系土壤腐殖质因富含有机质成分而能在土壤内形成胶体，增强土壤持水性和保肥性，改良土壤结构[1]。

腐殖质含有羧基和酚羟基等官能团，能在土壤胶体颗粒表面与铝离子、铁离子等结合，生成稳定的腐殖质/矿物配合物，利于土壤团粒稳定及结构改良。

另外，土壤腐殖质微生物代谢产物及其分解产物还能促进土壤团聚体形成，强化土壤结构稳定性，提高土壤通气性、渗透性等。

2土壤腐殖质对作物生长及土壤环境的影响2.1供给营养土壤腐殖质由有机物质经分解而成，富含氮、磷、钾等营养元素，为作物的生长提供养分。

腐殖质中的氮作为植物生长最主要的营养元素，能增加土壤中氮含量，有利于作物生长发育。

氮素在植物生长期间对蛋白质及叶绿素的合成起着重要作用，所以腐殖质中的氮素对植物养分需求非常关键。

腐殖质中的磷、钾及其他微量元素在作物生长过程中同样起着举足轻重的作用。

其中的磷在植物生长发育过程中起着至关重要的作用，参与调控能量代谢、DNA 合成等过程；钾元素能增强作物抵抗逆境的能力，有利于生长、开花及结果。

所以，土壤中丰富的腐殖质能有效供给这些营养元素以满足作物生长发育所需，并促进作物产量与品质的提升。

2.2改良土壤结构腐殖质具有保水、保肥等性能，能显著强化土壤质地与性质，对作物健康成长提供必要支撑。

腐殖质在土壤污染修复中的作用分析论文腐殖质在土壤污染修复中的作用分析论文摘要：随着城市化的不断推进, 很多工业企业逐渐搬离市区, 遗留了大量受污染的场地。

工业污染场地是我国当前面临的新环境问题, 制约着城市土地资源的安全再利用。

工业污染场地土壤修复技术虽然不断革新, 但是受制于资金因素, 大部分修复项目多集中在一线与省会城市, 修复技术相对粗糙, 无法全部达到预期效果。

腐殖质作为一种天然有机质, 可以有效处理工业污染场地中的重金属与有机污染物, 本文主要分析了腐殖质在工业污染场地土壤修复中的应用要点。

关键词：腐殖质; 工业污染; 土壤修复;在社会经济快速发展的背景下, 工业生产速度不断加快, 但是受限于传统生产意识, 人们并没有及时采取有效措施对生产过程进行有效控制, 导致工业污染持续加重, 其逐渐成为影响持续发展与环境保护的重要因素。

就现状来看, 实际处理应用的修复技术比较简单, 以异位修复为核心, 搭配固化稳定化、水泥窑焚烧技术以及化学处理等技术, 总体来讲整个产业还处于初期阶段。

腐殖质可以应用在工业污染场地土壤修复中, 人们可以从腐殖质结构性质、分离和纯化等角度出发, 确定其应用要点, 实现对土壤的有效修复。

1 工业污染场地土壤修复要求1.1 工业污染场地类型1.1.1 重金属污染重金属是指相对密度超过5.0的金属元素, 工业生产中常见的有Zn、Mn、Ge、Cu等, 因为As属性与重金属元素相似, 其往往被看作为重金属, 同时也是工业生产中主要的重金属污染元素之一[1]。

一般而言, 重金属污染主要集中在冶炼业、化学原料以及相关制品业、皮革以及相关制品业、蓄电池制造业等。

1.1.2 有机污染物当有机物进入工业土壤中, 会对土壤产生具有污染性的有机化合物时, 人们就可以将其看作有机污染物。

有机污染物主要包括持久性有机污染物(POPs) 、多环芳烃(PAHs) 以及农药等, 另外还包括石油类污染物, 主要集中于油漆、石油化工以及农药生产等相关行业[2]。

腐殖质名词解释腐殖质指土壤中的植物残体和动物分解的产物，是形成土壤团聚体、结构体、胶体、矿物组成、土壤肥力和土壤生物活性的主要因素。

主要来源于森林、草原和农田的凋落物，腐殖质的数量可达总重量的10%以上。

腐殖质是一种富含有机物、矿质养分以及水分的有机沉积物。

主要是由多种动、植物的残体经过微生物分解转化而成的，还有少量是微生物合成的。

它是土壤养分的重要组成部分，在自然条件下，只有在有氧的情况下才能够被分解利用。

当土壤中所含的碳、氮、硫等营养元素被消耗殆尽时，腐殖质就开始起作用了。

据科学测定，腐殖质占土壤干重的30— 40%，直接参与土壤团粒结构的形成，对土壤温度变化也有缓冲作用。

土壤中的腐殖质主要分布在耕作层。

腐殖质在有氧的条件下能够分解为二氧化碳、水和腐殖酸等物质。

腐殖酸的积累，使土壤表面呈现酸性反应;随着腐殖酸的减少，土壤逐渐转变为碱性反应。

这种转变过程称为腐殖质化作用。

土壤有机质含量过低或土壤脱钙严重，会出现酸性反应。

腐殖质是一种复杂的混合物，其成分随土壤中各类养分含量的增减而变化。

其中腐殖酸约占65%— 75%，腐殖质约占15%— 20%，还有粘粒、水分等。

腐殖质具有腐殖质和有机质的双重性。

它含有丰富的无机养分，是构成土壤团粒结构的主要成分；同时它还含有有机质和腐殖酸，能够促进作物的生长发育，改良土壤结构。

3、矿质养分的数量比例与粘粒含量之间有明显的相关性。

粘粒的数量随土壤pH值降低而增加，土壤有机质含量与腐殖质含量都与pH值有密切的相关性，而腐殖质的含量又与pH值有最大的相关性。

腐殖质化作用可以把有机养分转化为腐殖酸，提高土壤的肥力。

从中可以看出腐殖质对肥力和土壤结构有很大影响，而土壤的有机质含量则与肥力成正比。

这些均说明了土壤中的有机质和腐殖质对土壤的形成和肥力起着十分重要的作用。

4、土壤容重与孔隙度之间也存在着明显的相关性。

当容重增大时，孔隙度随之增加，而当容重降低时，孔隙度随之降低。