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黄芪活性成分抗肿瘤研究进展
邓春;赵红艳;高美丽
【期刊名称】《国外医学（医学地理分册）》
【年(卷),期】2018(039)003
【摘要】黄芪是一种传统的中草药,具有抗肿瘤作用,其活性成分主要包括多糖、皂苷和黄酮等.近年来关于黄芪抗肿瘤的研究日益增多,本文主要对黄芪活性成分影响的VEGF/MMP信号通路与抗血管生成、PI3K/Akt/mTOR信号通路介导的抗肿瘤作用进行阐述,进而对黄芪及其活性成分抑制癌细胞增殖、侵袭和转移,诱导癌细胞凋亡等方面的影响及相关分子研究进行简要综述,以期对进一步探究黄芪活性成分抗肿瘤机制提供科学依据.
【总页数】5页(P276-280)
【作者】邓春;赵红艳;高美丽
【作者单位】西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室,陕西西安710049;西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室,陕西西安 710049;西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室,陕西西安 710049
【正文语种】中文
【中图分类】R711
【相关文献】
1.白术抗肿瘤活性成分及其抗肿瘤机制研究进展 [J], 龙家英;李小芳;王娴;唐海龙;刘凯;谢青璇
2.核桃青皮活性成分胡桃醌抗肿瘤作用研究进展 [J], 孙卉;何志贵;师俊玲
3.核桃青皮活性成分胡桃醌抗肿瘤作用研究进展 [J], 孙卉;何志贵;师俊玲
4.白术抗肿瘤活性成分及其抗肿瘤机制研究进展 [J], 龙家英;李小芳;王娴;唐海龙;刘凯;谢青璇
5.石斛属植物抗肿瘤活性成分及其机制研究进展 [J], 李健;王美娜;赵美丽;李鹤娟;胡玥;陈建兵
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黄芪多糖对B16-F10荷瘤鼠髓样抑制细胞免疫活性的影响柴旺;何小鹃;朱军璇;吕诚;赵宏艳;吕爱平;喻长远【期刊名称】《中国中医基础医学杂志》【年(卷),期】2012(018)001【摘要】目的:观察黄芪多糖对B16-F10荷瘤鼠髓样抑制细胞免疫活性的影响,探讨黄芪多糖在抗肿瘤免疫机制方面所发挥的作用.方法:建立B16-F10荷瘤鼠模型,通过计算抑瘤率观察黄芪多糖的体内抗肿瘤活性；通过流式细胞术检测脾脏中Gr-1+CD11b+髓样抑制细胞比例；采用酶联免疫吸附试验检测血清中IL-10、VEGF 水平.结果:与模型组相比,黄芪多糖治疗可以明显抑制荷瘤鼠黑色素瘤的生长,且可以降低荷瘤鼠脾脏Gr-1+ CD11b+髓样抑制细胞比例,抑制外周血VEGF、IL-10的分泌,有显著性差异.结论:适当浓度的黄芪多糖可能通过降低髓样抑制细胞的比例,抑制VEGF、IL-10的分泌和肿瘤的生长.【总页数】3页(P63-65)【作者】柴旺;何小鹃;朱军璇;吕诚;赵宏艳;吕爱平;喻长远【作者单位】北京化工大学,北京100029;中国中医科学院中医临床基础医学研究所,北京100700;西南交通大学,成都610031;中国中医科学院中医临床基础医学研究所,北京100700;中国中医科学院中医基础理论研究所,北京100700;中国中医科学院中医临床基础医学研究所,北京100700;北京化工大学,北京100029【正文语种】中文【中图分类】R285.5【相关文献】1.舌鳞癌患者外周血髓样来源抑制细胞的表达及意义 [J], 储眉;苏宇雄;周媛;李源莹;梁玉洁;廖贵清2.黄芪多糖对小鼠胸腺和脾免疫活性细胞的影响 [J], 许嘉第3.全反式维甲酸减少舌癌小鼠髓样来源抑制细胞 [J], 储眉;唐文;周媛;苏宇雄;廖贵清4.哮喘小鼠中髓样抑制细胞及Arg-1、iNOs的表达 [J], 余孟珠; 李莉; 薛菲; 单文琪; 吕剑平; 汪雪峰5.黄芪多糖对树突状细胞免疫活性的影响 [J], 骆殊;邵佳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
黄芪多糖生物活性研究进展作者：蔡江滢何菁荣邹兴龙张祎窦春江来源：《甘肃科技纵横》2022年第03期摘要：黄芪是传统药食两用的中药材之一，含有200多种化学成分，如多糖、皂甙、黄酮、氨基酸等有效成分，其中黄芪多糖是含量最多、免疫活性较强的一类水溶性物质。
研究发现，黄芪多糖具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、保护心脏、抗炎、抗氧化等生物学活性，除此之外，黄芪多糖还对正常的肠道菌群具有调节及促生长作用，具有一定的药用价值，有望作为一种新型中药益生元。
文章就近年来黄芪多糖的生物活性研究进展作一综述，旨在为黄芪多糖的药品研制及益生元的研究提供新思路。
關键词：黄芪多糖（APS）;益生元活性;微生态制剂中图分类号： R248.1 文献标志码：A黄芪（Astragalus membranaceus）为多年生草本植物，豆科黄芪属，分为膜荚黄芪和内蒙古黄芪。
最早被记载于《神农本草经》，至今已有两千多年的应用历史，主要产于我国甘肃省、内蒙古自治区、黑龙江省和山西省等地。
现代药理学研究和大量临床实践证实黄芪具有多种生物学活性，主要包括免疫调节、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、保肝、祛痰和利尿等作用[1-3]。
研究表明，黄芪中包含200多种化学成分，其中异黄酮（Isoflavonoids）、皂苷（Saponins）、黄芪多糖（Astrag⁃ alus polysaccharide，APS）等3种化合物是黄芪的主要活性成分。
异黄酮如芒柄花黄素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮及其糖苷具有加强免疫、强身健体的功效。
皂苷中的黄芪甲苷（Astragaloside IV）因其显著的药理活性，可作为黄芪质量代表性指标。
此外，黄芪中还含有氨基酸、维生素和微量元素[4-6]。
最新研究表明，黄芪多糖对多种益生菌具有促进生长作用，有可能成为中药益生元。
此外，值得注意的是，黄芪多糖的动物保健功能也已经成为研究热点，鉴于其特有的功效，黄芪多糖作为一种新型饲料添加剂，通过发挥抗菌、抗病毒、免疫调节等作用来提高动物机体的免疫功能，对于动物产品品质的改善、促进畜牧业的可持续性发展有着重要意义[7-8]。
黄芪多糖的实验报告1. 研究背景黄芪（Astragalus membranaceus）是一种著名的中草药，被广泛应用于中医临床治疗。
黄芪多糖是黄芪中的主要活性成分之一，具有多种药理活性和生物学功能。
为了更好地了解黄芪多糖的特性和潜在的应用价值，本实验对黄芪多糖进行了一系列的研究和分析。
2. 实验目的本实验的主要目的是评估黄芪多糖对细胞免疫活性的影响，并通过实验数据来验证其免疫调节效应。
3. 实验方法3.1 实验材料和仪器- 实验材料：黄芪多糖提取物、小鼠脾脏细胞、培养基等；- 实验仪器：细胞培养箱、细胞离心管、显微镜等。
3.2 细胞培养和处理1. 将小鼠脾脏取出并切碎，加入适量的PBS缓冲液进行均质；2. 将均质后的细胞悬液通过细胞筛过滤，得到单细胞悬液；3. 将单细胞悬液离心，取上清液，加入细胞培养基中，调整细胞浓度为1×10^7个/mL；4. 将细胞悬液分为实验组和对照组，实验组添加不同浓度的黄芪多糖提取物，对照组不添加；5. 将处理后的细胞培养在37摄氏度、5% CO2孵育箱中培养48小时。
3.3 细胞免疫活性检测1. 取出培养的细胞，使用显微镜观察细胞形态的变化；2. 利用MTT法检测细胞的增殖活性，计算细胞存活率；3. 通过流式细胞术检测细胞的凋亡率；4. 检测不同处理组中的细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的表达水平。
4. 实验结果与分析4.1 细胞形态观察在实验组中，观察到处理后的细胞形态发生明显改变，细胞的形状更加粗糙，细胞膜变得不规则，并出现细胞聚集的现象。
与之相比，对照组中的细胞形态保持正常。
4.2 细胞存活率检测利用MTT法检测细胞存活率，实验结果显示，随着黄芪多糖提取物浓度的增加，细胞存活率逐渐下降。
说明黄芪多糖具有一定的细胞毒性作用。
4.3 细胞凋亡率检测通过流式细胞术检测细胞凋亡率，实验结果显示，黄芪多糖处理组的细胞凋亡率明显高于对照组。
说明黄芪多糖可以诱导细胞凋亡，从而起到免疫调节作用。
注射用黄芪多糖临床试验总结前言：临床前的实验表明：黄芪多糖可以增加动物脾重，增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能、显著提高抗体形成细胞数、增强移植物抗宿主反应、促进人外周血淋巴细胞的增殖功能增强NK细胞活性、显著增强某些细胞因子如：G-CSF,IL-1,IL-2,TNF-α,IFN-γ等的分泌[1-3]，促进骨髓造血干细胞的增殖和向红细胞系和粒细胞系的分化。
同时，对环磷酰胺所致大鼠骨髓造血功能的破坏有明显的保护作用，能阻止骨髓有核细胞的明显减少，对白细胞、血小板计数的下降有明显的回升作用，并与黄芪多糖的浓度存在量效关系[4-5]。
经卫生部药政管理局批准，按照GCP的原则，于98年5月至99年6月，由中国中医研究院广安门医院牵头（卫生部临床药理基地），北京肿瘤医院、山西省肿瘤医院、辽宁省肿瘤医院、湖南省肿瘤医院、江西省肿瘤医院6家医院共同完成。
一、试验目的：通过随机、开放、对照的设计，本临床试验主要观察注射用黄芪多糖对化疗所致血象下降的提升作用，对气虚症状的改善作用，对免疫功能的影响，以及进一步考察其临床应用的安全性。
二、试验对象与分组：试验对象：试验选取化疗后14天内WBC<4.0×109/L的肺癌、胃肠癌和乳腺癌的患者试验共完成观察病例487例，其中男性272例，占55.9%，女性215例，占44.1%，男女之比为：1.27:1,年龄分布在26～70岁之间，平均年龄53岁。
分组：分为3组，其中注射用黄芪多糖试验观察组（简称黄芪组）328例，惠尔血治疗对照组（简称G-CSF组）84例，单纯化疗空白对照组（简称空白组）75例。
治疗前黄芪组与对照组之间，在年龄、肿瘤的病理分型和临床分期、卡氏评分、气虚症状积分和外周WBC均数等各项指标上经统计比较，无显著性差异，具有较好的均衡可比性。
三、给药方法：试验周期为14天：（纳入病例在观察中，禁止应用任何其他升血药及免疫增强剂）黄芪组：注射用黄芪多糖 250mg加入生理盐水500毫升中静脉点滴（滴注时间不少于2.5小时），每日一次，连续应用7天，停药后继续观察7天。
3种中药多糖抗肿瘤作用的研究马秀梓;孙润广;李佳媚;李哲涛;乔进京【摘要】实验采用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法测定枸杞多糖、当归多糖和女贞子多糖对体外肿瘤细胞的增殖抑制作用．分别使用枸杞多糖、当归多糖和女贞子多糖作用于人白血病K562细胞，经不同浓度和不同时间作用后，采用MTT法测定3种多糖的体外抗肿瘤活性．结果显示：3种中药多糖都具有抗肿瘤活性，在一定范围内，随着多糖浓度的增加使得肿瘤细胞的抑制率增加，女贞子多糖在作用48h后对K562的抑瘤效果较枸杞多糖和当归多糖显著．%The MTT assay is used to study the inhibition rate of cell proliferation about Lycium barbarum Polysaccharide (LBP), Angelica Polysaccharide (APS). Ligustrum lucidum Polysaccharide(LLPS)act on tumor cells in vitro. Using the different dose and different effect time of LBP,APS.LLPS act on K562. Inhibition rate of cell proliferation were studied by MTT assay. The results indicate that three Chinese medicine polysaccharides could inhibit cancer cells. In a certain range, the inhibition of cell character depended on dose. LLPS in 48h owns the higher significant inhibitory effect of tumor on K562 than LBP and APS.【期刊名称】《陕西师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)006【总页数】4页(P77-80)【关键词】枸杞多糖;当归多糖;女贞子多糖;抗肿瘤【作者】马秀梓;孙润广;李佳媚;李哲涛;乔进京【作者单位】陕西师范大学物理学与信息技术学院,陕西西安710062;陕西师范大学物理学与信息技术学院,陕西西安710062;陕西师范大学物理学与信息技术学院,陕西西安710062;陕西师范大学物理学与信息技术学院,陕西西安710062;陕西师范大学物理学与信息技术学院,陕西西安710062【正文语种】中文【中图分类】R273中药多糖以其抗肿瘤活性、无毒副作用等优点备受关注.到目前为止，已发现100多种中药中的多糖化合物具有免疫促进作用，如香菇多糖、枸杞多糖、茯苓多糖、黄芪多糖等［1］.本实验的研究材料枸杞系落叶灌木，果实枸杞子味甘、性平，有滋肾补髓、养肝明目和祛风的作用，是传统滋补中药［2］.研究表明，枸杞多糖（Lycium barbarum Polysaccharide，LBP）可抑制人肝癌［3］、宫颈癌［4］和白血病［6］等多种肿瘤细胞的生长.女贞子是木犀科植物女贞子的干燥成熟果实，性味甘、微苦、凉，归肝、肾经，具有滋补肝肾、明目乌发等功能［6］.有研究表明女贞子多糖（Ligustrum lucidum Polysaccharide，LLPS）具有提高机体免疫能力，调节机体阴阳平衡的作用［7］.当归为伞形科植物当归的干燥根，味甘、辛、性温，有补血活血、调经止痛、通肠通便之效，用于血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调、肠燥便秘等症状［8］，当归多糖（Angelica Polysaccharide，APS）能抑制肿瘤增殖，是诱导肿瘤细胞凋亡或分化的天然诱导剂［9－11］.四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法简单、快速，便于大规模进行药物敏感试验，人为误差较小而且较精确，没有放射性污染，广泛用于临床前抗癌药物筛选研究，并已开始用于肿瘤细胞的药物敏感性检测［12］.本文将枸杞多糖、当归多糖、女贞子多糖的体外抑瘤活性采用MTT方法进行分析研究，旨在为中药多糖的进一步有效抗癌提供理论和实验依据.枸杞多糖（LBP）、当归多糖（APS）、女贞子多糖（LLPS）以水提醇沉法提取制备.二甲基亚砜（DMSO）为国产分析纯，实验用水均为三次蒸馏水，K562细胞陕西师范大学生命科学学院，RPMI1640培养基美国GIBCO公司，新生小牛血清杭州四季青生物工程有限公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）美国Amresco公司. HH·CP－01W型二氧化碳细胞培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂，TH4－200倒置显微镜日本奥林巴斯有限公司，DG5032型酶联免疫检测仪南京华东电子集团医疗设备有限公司，TDL80－2B小型离心机上海安亭科学仪器厂，CF16RX高速冷冻离心机日本日立公司.1.3.1 细胞培养 K562细胞培养于RPMI1640＋10%（体积分数）新生小牛血清和双抗（青、链霉素，100U／mL）的完全培养基中.在5%CO2、37℃培养箱及饱和水蒸气条件下常规培养及传代，使用对数期细胞进行实验［2］.1.3.2 细胞增殖实验（1）K562细胞的增殖实验：取对数生长期的K562细胞，调节细胞密度为1×105个／mL.分为空白组、对照组和实验组.每组设6个复孔.接种于96孔板，每孔加100μL细胞，空白组加等体积完全培养基.培养24h后，实验组分别加入 800、400、200、100、50、25μg／mL 的LBP100μL；空白组和对照组加同体积1640培养基.培养24h、48h、72h后加入 MTT（5mg／mL）20μL／孔，37℃孵育4h后离心弃上清.加DMSO 200μL／孔，避光振荡10min，使结晶物充分溶解，用酶联免疫检测仪在波长492nm处测量各孔的吸光度（OD 值），实验重复3次，计算细胞相对生长抑制率：（2）K562细胞的增殖实验：按（1）方法检测APS对K562细胞的生长抑制作用，浓度范围0～800μg／mL.按（1）方法检测LLPS对K562细胞的生长抑制作用，浓度范围0～800μg／mL.1.3.3 统计分析方法所得数据用统计软件SPSS进行F检验.LBP对K562细胞的增殖抑制作用结果见表1和图1，LBP对人白血病K562细胞有明显的抑制作用.在0～200μg／mL范围内，呈现时间－计量依赖方式抑制白血病细胞的生长（P＜0.05或P＜0.01）；在200～800μg／mL的范围内，随LBP质量浓度的增大，细胞生长抑制程度逐渐减小.APS对K562细胞的增殖抑制作用结果见图2和表2，APS对人白血病K562细胞有明显的抑制作用.在0～400μg／mL范围内，LBP质量浓度越大对细胞生长的抑制程度越大；在400～800μg／mL的范围内，随APS质量浓度的增大，细胞生长抑制程度逐渐减小（P＜0.05或P＜0.01）；随着作用时间的增长，APS对细胞的抑制效果依次是：抑制率48h＞抑制率24h＞抑制率72h（P＜0.05或P＜0.01）.LLPS对K562细胞的增殖抑制作用结果见图3和表3，LLPS对人白血病K562细胞有明显的抑制作用.LLPS质量浓度越大对细胞生长的抑制程度越大，呈现计量依赖方式抑制白血病细胞的生长（P＜0.05或P＜0.01）；随着作用时间的增长，LLPS对细胞的抑制效果依次是抑制率48h＞抑制率24h＞抑制率72h（P＜0.05或P＜0.01）.对于3种多糖作用于K562细胞的实验发现，LBP在0～200μg／mL浓度范围内，随浓度的增大细胞抑制率逐渐增大，随作用时间的延长细胞抑制率增大，抑制率72h＞抑制率48h＞抑制率24h；APS在0～400μg／mL浓度范围内，随浓度的增大细胞抑制率逐渐增大，作用48h时抑制率最大，抑制率48h＞抑制率24h＞抑制率72h；LLPS随浓度的增大一直呈计量依赖型抑制细胞生长，作用48h时抑制率最大，抑制率48h＞抑制率24h＞抑制率72h.LLPS对K562的抑制效果明显强于LBP和APS.单铁英研究表明肿瘤细胞都有其自身的生长规律，一般G0／G1期时间最长，故G0／G1期细胞比率最高，而G2／M期时间较短，处于G2／M期细胞比率最低.LBP作用的肿瘤细胞被阻止于G2／M期，更多的细胞损伤过重，超过了自身修复能力，难以通过G2期限制点而发生凋亡［16］.华自森研究APS对K562细胞的作用，流式细胞术显示处于细胞静止期（G0／G1期）的肿瘤的一般治疗手段就是放疗、手术和化疗，但放化疗的毒副作用及手术治疗的费用昂贵，使得肿瘤治疗效果并不理想［3，14］.因此，从具有滋补功效的中草药中开发具有抗肿瘤作用的活性成分已成为目前抗肿瘤研究的热点［18］.枸杞具有益气养血扶正之力，当归具有补血通经活络之气，女贞子具有滋阴降火解毒之效.有研究表明，临床上女贞子常与其他中药配伍，用于治疗肿瘤及改善化疗后的白细胞减少等症状［19］.本实验通过MTT法对LBP、APS、LLPS作用后的K562进行了研究，发现这3种多糖对肿瘤细胞均表现出较强的抑制活性，这为今后多种中药多糖在保健或药物方面的开发提供一定的参考价值.3种中药多糖联合作用于同类细胞的作用机制及有效成分的筛选还有待于进一步研究.【相关文献】［1］吴晓忠，罗素琴，刘乐乐，等.中药多糖抗肿瘤作用的研究进展［J］.内蒙古医学院学报，2009，31（1）：81-83.［2］刘锡建，肖稳发，曹俭，等.枸杞多糖的研究进展［J］.上海工程技术大学学报，2008，22（4）：299-302.［3］黄霞，肖丙秀，赵军伟，等.枸杞多糖对人肝癌 HepG2生长的影响及其分子机制［J］.中草药，2010，41（9）：1501-1503.［4］梁淑轩，马二红，许成燕，等.枸杞多糖的硒化及其对人宫颈癌细胞的抑制作用［J］.食品科学，2010，31（9）：243-246.［5］崔涛，李梅君，赵艳春.枸杞多糖对K562白血病细胞抑制作用及凋亡的研究［J］.锦州医学院学报，2006，27（1）：30-34.［6］李璘，邱荣丽，程革，等.女贞子多糖抗肿瘤作用研究［J］.中国药理学通报，2008，24（12）：1619-1622.［7］阮红，吕志良.女贞子多糖免疫调节作用研究［J］.中国中药杂志，1999，24（11）：691-693.［8］韦玮，龚晓苏，张铁军，等.当归多糖类成分及其药理作用研究进展［J］.药物评价研究，2009，32（2）：130-134.K562细胞数量增加，增殖活跃的细胞数量减少，表明APS能阻止K562细胞由 G0／G1 向S，G2＋M 移行［9］.卢晓沅对LLPS的抗肿瘤研究表明可能的机理是对G0G1期细胞起细胞毒作用，在G2M期抑制细胞增殖［17］.本实验研究发现，在一定的浓度下，APS和LLPS在作用48h后细胞的抑制率最大，而LBP在作用72h后细胞的抑制率最大，这可能与3种中药多糖关于细胞周期的抗癌机制有关.［9］华自森，王建伟，宋姝丹，等.当归多糖对K562白血病细胞JAK2，STAT3表达和活化的影响［J］.解剖杂志学，2009，32（1）：8-11.［10］曾炜炜，钱江潮，周海霞，等.当归多糖诱导K562白血病细胞凋亡的实验研究［J］.现代中西医结合杂志，2007，16（2）：165-167.［11］宋姝丹，王建伟，王亚平，等.当归多糖对K562细胞增殖抑制及定向红系细胞分化的实验研究［J］.重庆医科大学学报，2008，33（1）：1-5.［12］司徒镇强.细胞培养［M］.北京：世界图书出版公司，2007：1-362.［13］齐浩，艾霞.AFM观察稳恒磁场对细胞表面精细结构的影响［J］.电子显微学报，2009，28（2）：150-156.［14］郝玉栓，袁征，单铁英，等.枸杞多糖对实验性食管癌大鼠食管癌细胞的生长抑制作用［J］.职业与健康，2010，26（22）：2601-2602.［15］蒋艳，姜孝新.枸杞多糖对肝癌Hca-F荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及研究［J］.肿瘤药学，2011，1（4）：391-394.［16］单铁英，赵如同，杨书良，等.枸杞多糖对人肝癌细胞Bel-7402的抑制作用及凋亡的研究［J］.时珍国医国药，2010，21（8）：1928-1929.［17］卢晓沅，陈志良，王春霞.女贞子化学成分及其药理作用研究概况［J］.中药材，2006，29（6）：625-629.［18］黄文书，杨海燕，武运，等.枸杞多糖的提取及体外抗肿瘤作用的研究［J］.中国食品与营养，2008（5）：38-40.［19］万年青.贞灵饮对肿瘤化疗患者生活质量及免疫功能的影响［J］.浙江中医杂志，2007，42（5）：292-293.［20］吕金超，宋慧，苏玲，等.4种真菌粗多糖提问抗肿瘤作用研究［J］.安徽农业科学，2010，38（13）：7170-7161.［21］朱彩平，张声华，肖军霞.枸杞多糖诱导人宫颈癌 Hela细胞凋亡的形态学研究［J］.食品科学，2010，31（19）：329-334.［22］崔晓燕，罗琼，杨明亮，等.枸杞多糖对人宫颈癌细胞生长及细胞凋亡影响［J］.中国公共卫生，2006，22（12）：1411-1412.［23］季宇彬.中药多糖的化学与药理［M］.北京：人民卫生出版社，2005. ［24］徐小平，李新民.中药方剂药理学［M］.北京：军事医学科学出版社，2010.。
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方法 用黄芪多糖作用于体外培养的大鼠胶质瘤细胞株C6,MTT 法观察黄芪多糖作用后胶质瘤细胞存活率的变化,并用流式细胞分析技术检测肿瘤细胞的凋亡情况。
通过W est 2ern 印迹和半定量RT 2PCR 了解ST AT3基因在不同水平的表达。
结果 黄芪多糖作用胶质瘤细胞株后肿瘤细胞存活率明显下降,肿瘤细胞凋亡比例升高。
黄芪多糖对C6细胞存活率和凋亡的影响与黄芪多糖的浓度和作用时间有关。
可使细胞内ST AT3表达下降,同时mRNA 水平也有所下降。
结论 黄芪多糖可以降低ST AT3的表达,进而抑制大鼠C6细胞的生长、增殖及诱导细胞的凋亡。
〔关键词〕 黄芪多糖;C6细胞;ST AT3〔中图分类号〕 R739141;R730152 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 100529202(2009)0120041203基金项目:吉林省教育厅资助课题(2006191)1 吉林省兽药饲料监察所2 吉林大学白求恩医学部生物化学与分子生物学教研室通讯作者:洪 敏(19452),男,教授,博士生导师,主要从事基因组学与蛋白质组学研究。
第一作者:孙 聪(19702),女,副教授,博士,主要从事基因与中药抗肿瘤研究。
研究发现在神经胶质瘤发生发展的过程中多个环节不同基因的功能异常使胶质瘤细胞出现恶性增殖、凋亡抑制、血管新生以及侵袭性生长等一系列特征〔1～4〕。
JAK 2ST AT (Janus ki 2nase 2signal transducers and activat ors of transcri p ti on )通路是一条参与细胞多种重要生命活动的信号转导途径,涉及细胞生长、分化、凋亡等。
信号转导子与转录活化子家族(ST ATs )的重要成员ST AT3在多种人类恶性肿瘤如淋巴瘤、膀胱癌、神经胶质瘤中高表达〔5,6〕,并参与肿瘤发生发展的病理机制。
多种与肿瘤增殖凋亡相关的细胞因子如:生长激素(GH )、干扰素(I F N )、白细胞介素(I L )22、26等都通过JAK 2ST AT 通路最终影响ST AT3基因的转录调节〔7〕。
黄芪多糖(polysaccharides )对多种实验型肿瘤有明显的抑制作用。
动物实验表明,黄芪多糖与I L 22/LAK 抗肿瘤作用相似,并对I L 22/LAK 抗肿瘤效应有明显的增强作用,二者配伍应用可明显提高LAK 细胞对靶细胞的杀伤力。
二者合并进行动态细胞免疫功能观察,提示二者均具有抵抗鼠脾NK 细胞活性和I L 22产生能力下降的作用,说明黄芪多糖的抗肿瘤作用与增强机体免疫功能的作用有关。
由此考虑黄芪多糖的抗肿瘤效应是否与JAK 2ST AT 通路有关呢?1 材料与方法111 主要材料 大鼠神经胶质瘤C6细胞,由吉林大学白求恩医学部生物化学与分子生物学洪敏教授实验室提供。
以含5%胎牛血清(F BS,杭州四季青公司)的DM E M 培养液(吉诺生物医药技术有限公司)在37℃5%CO 2的条件下培养。
黄芪多糖由黄芪粉碎后经80℃水浴提取、乙醇分级沉淀、Sevag 试剂(正丁醇∶氯仿=1∶5)除蛋白及流水透析后真空干燥制得初品,经Sephadex 2G100柱层析纯化。
使用前用生理盐水配制成所需浓度,并经过滤除菌。
112 主要试剂 四甲基偶氮唑蓝(MTT )购于美国Sig ma 公司。
兔抗人ST AT3多克隆抗体购于武汉博士德公司,辣根过氧化物酶结合的二抗购于美国的Cell Signaling 。
W I P 细胞裂解液、BC A 蛋白检测试剂盒购于北京博奥森生物技术有限公司。
RT 2PCR 有关试剂购于TaKaRa 生物技术公司。
113 细胞生长抑制实验 C6细胞接种96孔板,24h 贴壁后加入黄芪多糖稀释液使终浓度分别达到011mg/m l 、1mg/m l 、10mg/m l,以不加药为对照组。
每组设8个复孔。
继续用5%血清DME M 培养,分别在加药前、作用24、48和72h 后用M TT 法检测肿瘤细胞的存活情况。
按操作说明MTT 显色,酶标仪(B i o 2RAD 550,美国)570n m 测各孔的吸光度A 值,记录结果。
细胞存活率=实验组A 均值/空白对照组A 均值×100%。
114 流式细胞仪检测细胞凋亡 将各实验组细胞3次给药培养72h 后,分别制成单细胞悬液。
0℃800r/m in 离心5m in,弃上清,P BS 洗2次,弃上清,留大约015m l P BS,再加415m l 80%乙醇固定,4℃保存过夜,离心弃上清,P BS 洗3・14・孙 聪等 黄芪多糖抑制大鼠神经胶质瘤细胞增殖的实验研究 第1期次,每管加1m l P I(碘化丙啶50mg/L)染色1h,经细胞过滤上机检测,混匀后上流式细胞仪做单参数分析,每份样品检测1×104个细胞。
实验数据用累积曲线分割法计算各期细胞所占比例。
115 细胞总蛋白提取与蛋白浓度测定 含1%P M SF的W I P 细胞裂解液按每瓶500μl加入培养瓶,置冰上5m in后吸出裂解液,4℃14000r/m in离心10m in,取上清,以BCA法检测蛋白浓度,按说明操作以37℃法行标准曲线和待测样品显色,酶标仪495n m比色,结果用Excel计算样品蛋白浓度。
116 W estern印迹分析 12%S DS丙烯酰胺凝胶电泳,每个浓度上样50μg。
全湿法转到NC膜。
转膜成功后行免疫检测,一抗为兔抗大鼠ST AT3多抗,工作浓度1∶100;二抗为HRP结合的羊抗兔I gG抗体,工作浓度1∶1000。
DAB显色。
117 mRNA半定量分析RT2PCR 遵循PCR引物设计黄金原则,根据Gene Bank大鼠ST AT3基因的c DNA序列,设计两条引物,由南京金斯特科技有限公司合成。
序列如下:上游引物:5′2 aaggacatcagtggcaaga23′;下游引物:5′2catcggcaggtcaatggta23′;PCR 反应条件:94℃,30s;56℃,60s;72℃,60s;30个循环后,72℃延伸10m in;取PCR产物上样于115%琼脂糖电泳,结果用VDS I m age Master检测样品条带和β2actin条带的OD值。
118 统计学处理 SPSS1410软件,行常规数据统计、等级资料非参数检验(Nonparametric Test)和多因素方差分析(Univari2ate Analysis of Variance)。
2 结 果211 黄芪多糖对C6细胞的抑制作用 黄芪多糖作用后可明显降低C6细胞的存活率。
黄芪多糖作用24h和48h细胞存活率改变不明显,但72h后存活率显著下降,而且其作用强度随浓度的增高而增强,不同时间组和剂量组之间比较的多因素方差显示,除了24h和48h组之间差异无统计学意义(P>0105)外,其余各剂量组或时间组之间的差异均有统计学意义。
212 黄芪多糖对C6细胞凋亡的诱导作用 C6细胞在不同浓度黄芪多糖培养液中培养72h后出现不同比例的细胞凋亡。
流式细胞检测结果示:不同浓度组C6细胞凋亡的百分比分别为6%,3191%和1119%,不同浓度黄芪多糖作用后肿瘤细胞的凋亡比例均高于对照组,凋亡程度随浓度的增高而升高。
213 黄芪多糖抑制ST AT3蛋白的表达状况 经W estern印迹法检测,通过灰度值与β2actin的灰度值对比分析,与对照组比较,10mg/m l、1mg/m l组ST AT3蛋白表达量显著性降低(P< 0101),011mg/m l组ST AT3蛋白表达量降低(P<0105)。
β2ac2 tin表达量在各组之间无显著性差异(P>0105),见图1。
214 RT2PCR结果 如图2所示,黄芪多糖作用72h后ST AT3 mRNA表达有一定程度的下降。
以β2actin为内参的ST AT3的RT2PCR产物电泳如图3,扩增产物的碱基数为303bp,结果显示,10、1mg/m l组mRNA的表达量明显低于对照组(P< 0101);011mg/m l组mRNA的表达量也低于对照组(P< 0105);β2actin表达量在各组之间无显著性差异(P>0105)。
图1 用药72h后STAT3W estern印迹结果1 DL2000DNA Marker组 2 10mg/m l组3 1mg/m l组 4 011mg/m l组 5 对照组图2 用药72h后STAT3RT2PCR电泳结果3 讨 论 神经胶质瘤的发生就是由于某种特殊的原因导致颅内星型胶质细胞异常增生,随着对病因学及其防治的研究,信号传导途径在肿瘤细胞中抗凋亡和促进分化增殖的作用越来越受到重视。
其中,信号传导转录活化蛋白家族途径的研究尤为突出,目前发现的ST AT家族7个成员中,ST AT1分布最广而ST AT3与肿瘤关系密切〔7〕。
N i w a等〔8〕在复发性喉乳头状瘤标本中观察到肿瘤内部ST AT3的表达明显高于瘤周交界组织或正常组织,而ST AT3蛋白在分裂像细胞和瘤内新生血管内皮中的普遍表达〔6〕则提示ST AT3的作用可能与胶质瘤的异常增殖和侵袭性生长有密切关系。
