生物工艺学第七章 发酵工艺控制(3-4节)

引言；
发酵过程技术原理；
发酵过程参数的检测； 发酵条件的影响及其控制 温度；
pH值；
溶解氧；
二氧化碳和泡沫；
补料。

发酵终点的判断。

第三节发酵过程参数的检测
黑箱检测方法：分光光度法；
检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等检测代谢中间物，分析代谢流向、RNA检测等。

⎯⎯→⎯参数检测灰箱
生化反应过程的基本特征
过程属于开放系统：细胞不断从外界获得生存所需能量，同时将代谢产物或废物排除体外；
检测参数的多样性和综合性：
过程检测只能是环境中的状态或操作量的变化值，这种变化与细胞代谢的关联；
参数的综合性反映了参数在不同水平上的相关性，要用系统思维方式反映参数的多样性和综合性。

计算机数据检测和控制系统分为： 信号检测；
计算机控制；
与工艺研究结合的软件部分。

原理：化学或物理信号电信号
放大记录显示仪
控制器（与设定参数比较）
发出调节信号控制器动作
带计算机数据采集与控制的生物反应系统（P188图7-33）
参数检测的复杂性
化学成分分析是重要的检测内容，电信号转换困难，原因：
①传感器要经受高温灭菌；
②菌体以及其它固体物质附在表面，使一些传感
器的使用性能受到影响；
③罐内气泡影响，带来对测量干扰；
④传感器结构必须防止杂菌进入和避免产生灭菌
死角，因而使传感器结构复杂或性能变化。

发酵工程所用传感器的特殊要求
①经受高压蒸汽灭菌；
②传感器及其二次仪表具有长期稳定性；
③最好能在过程中随时校正；
④探头材料不易老化、使用寿命长；
⑤探头安装、使用、维修方便；
⑥解决探头敏感部位被物料（反应液）粘住、
堵塞问题；
⑦价格合理、便于推广。

为克服传感器受高温破坏所采用的措施
①用化学试剂对传感器灭菌；
②采用连续取样或罐外循化；
③用微孔氟塑料管扩散导气法，对培养液中
的挥发性成分进行测量；
④利用培养液连续透析器法，防止杂菌返回
罐内。

生物传感器
测量系统分类
就地信号系统：如pH、DO、罐压等；
在线测量系统：用连续的取样系统与有关的分析仪器连接，取得测量信号，如FIA；
离线测量：离散取样后在反应器外进行化学分析或仪器分析。

一般要测量的发酵反应过程的参数：
1、物理参数：
发酵罐温度（T ）发酵罐压力（P ）
发酵液体积（V ）空气流量（F A ）
冷却水流量（F W ）冷却水温度（T 入、T 出）
搅拌转速（RMP ）搅拌马达电流（I ）
泡沫高度（H ）培养液体积（V ）都可用自动测量仪自动测量
2、化学参数：
pH 值;
溶解氧浓度（DO ）;
氧化还原电势;
粘度;
尾气成分（CO 2，O 2等）
滤速；
成分浓度（糖、氮、前体、诱导物、产物）。

3、间接参数：
OUR、CER、RQ、μ、Yx/s、细胞浓度、细胞量、氧利用率、代谢产物浓度及产物生成速率、发酵热等。

温度测量
温度是一个重要的检测参数和控制参数，温度检测系统主要由以下几部分组成：
感温元件：普遍用的是热电阻检测器（铂和铜电阻）。

感温元件一般装置在金属套管内，再插入发酵液中或沿发酵罐罐壁固定安装。

二次仪表：
选择二次仪表考虑的因素：
温度范围
型号匹配
搅拌转速的测量
发酵罐最好配用变速电机或机械变速装置，以满足不同搅拌转速的需要。

搅拌转速的检测：
1、应用测速发电机；
2、应用磁感应式检测器；
3、应用光感应式检测器。

搅拌功率的测量
研究搅拌功率的意义：
搅拌功率反映了“三传”的强化程度；
研究反应器形式时主要的测量参数；
判断发酵工艺是否正常。

搅拌功率的测定 （多数通过力矩测定）
1、电机反转矩测定法、轴功率和应变片法。

2、功率表。

通气量的测量
通气量的大小直接影响发酵液中氧的传递速率，从而影响菌体的代谢途径；
根据作用原理，流量计可分为两大类型： 体积流量型（据动能转换及流动类型的改变而设计的）；
质量流量型。

体积流量型流量计
同心孔板压差式流量：
原理：由节流产生压差，用差压变送器加以检测，再转
换成信号；
应用：工业和中试规模的大中型发酵罐上使用。

转子流量计：
原理：
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优点：由于使用简便、结构简单，流体压降损失小,具有线性刻度，价格便宜等优点被广泛应用；
缺点：引起流体能量的不同程度的损失，测量受温度、
压力的影响，使用中一般需要经常校正。

罐压测量
发酵罐保持一定的罐压力的目的：
防染菌；
提高氧和二氧化碳的溶解度。

罐压测量：
就地指示；
转换为电信号：电阻式、电感式、电容式。

选择测压点和控制点时考虑的因素：
采用与发酵罐隔离的硅油不锈钢膜片传压系统，避免死角；
测压点与控制点远离发酵罐（无硅油隔离装置)；
注意气源波动对压力的影响。

发酵液粘度测定
至今无一个可行有效的测发酵液粘度的通用方法，原因：
1、无菌操作的限制；
2、发酵液多属非牛顿流体。

粘度计的主要形式：
毛细管粘度计；
回转式粘度计；
蜗轮流转粘度计；
工业现场测试：由于测定发酵液流变特性必须在脱气之后才能进行，因此尽管已经出现了可以现场测定非牛顿型流体料液的流变特性仪器，但目前还没有成功的报道；
工业生产测试：取样后实验室测试滤速。

pH值测量
pH试纸；
pH电极。

pH试纸：
优点：方便，易操作，曾是一种广泛采用的方法；
缺点：主观性较强，存在质量差异，不同厂家不同批号的pH试纸测出的pH值会有较大的差别，有时甚至达0.5～1；
对于一些要求较高的场合不适用。

pH电极测量系统：
测量时，pH受温度的影响；
在等电点附近测量时，精度可提高。

发酵用复合电极(指示和参比电极合为一体） pH测量仪表：
具有自动或手动的温度补偿功能.
pH测量成功的关键在于pH电极和仪表的日常正常使用和维护。

溶解氧（DO）的测量
DO的测定不仅可以给出微生物生理生化的动态信息，而且是发酵罐传质能力、设计放大和中间控制等研究的基础。

DO电极测量系统的基本组成：
具备指示电极和参比电极之间形成的电位差；
使电极表面与液流主体间有一个稳定的氧扩散梯度。

溶解二氧化碳的测量
可用电极测定。

发酵尾气在线分析
常用的尾气二氧化碳测定仪是不分光红外线二氧化
碳测定仪（简称IR），其精度高，可达±0.5%，量程的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞
培养时常被采用。

常用的尾气氧的仪器采用热磁氧分析仪。

原理是在
磁场中，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混
合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。

细胞浓度的测定方法
光电比浊法；
称重法；
显微镜直接计数法（染色）；
平板菌落计数法；
细胞蛋白质测定法、核酸测定法、ATP测定法；
荧光法；
电容测定法（把每个细胞当作低容值的电容器）；
恒电位电极法（测定一定电压下电流与菌量的关系）； 粘度法（粘度测量值与生长或形态变化的关系）；
热量衡算法（利用生物热与菌量成比例计算）；
酶电极法（测定与菌体生长量成比例的某代谢物）。

基质中糖浓度的测定
根据物理性质：折光率、波美比重计、旋光仪 根据化学性质：比色法、滴定法
快速微量的方法：氧电极、酶电极、生化分析
仪、HPLC
常用的比色法测糖：
DNS试剂法；
蒽酮法；
苯酚硫酸法；
费林氏试剂法；
碘量法。

蛋白质含量的测定
利用物理性质：利用折射率、比重、紫外吸收
利用化学性质：
凯氏定氮法
双缩脲法
Folin-酚测定法
紫外吸收法
染色法
氨氮浓度的测定
比色法；
电极法。

几个重要的且易控制的参数对发酵的影响及控制： 温度；
pH值；
DO；
泡沫；
基质浓度。

第四节温度对发酵的影响及其控制一温度对微生物生长的影响
不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0～26 ℃生长，嗜温菌适应于15～45 ℃生长，嗜热菌适应于45～65 ℃生长，嗜高温菌适应于65 ℃以上生长。

每种微生物对温度的要求可用：最适温度、最高温度、最低温度来表征。

不同温度与菌体生长的关系？
微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。

这就是菌种保藏的原理。

发酵过程，微生物生长速率变化
dX/dt= μX-αX
μ: 比生长速率
α：比死亡速率
当处于生长状态时，μ>>α, α可忽略。