山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的制备与鉴定

【 要 】本研 究 旨在 探 索乳 腺 上 皮 细 胞 单 细胞 克 隆制 备 的 实 际操 作 的 可 能 性 ， 对 其 生 物 学 特 性 进 行 鉴 定 。本 摘 并 试验 从 泌 乳 中期 的徐 淮 山羊 乳 腺 提 取 乳腺 上 皮 细胞 ， 纯化 传 至 第 ３代 ， 用 三 种 不 同 的 方 法 （ 采 口吸 管 法 、 细胞 稀 释 法 以及 克隆 环 法 ） 细 胞接 种 至 ９ 将 ６孔 板 ， 用细 胞 形 态 学 与免 疫 组 化 鉴 定 。 结 果显 示 ： 采 口吸 管 法 克 隆形 成率 为 ０ 克 隆 ，
将 剪 碎 的 组 织 块 置 于 锥 形 瓶 中 ， 人 Ｉ型 胶 原 酶 ／ 明 加 透 质酸 酶 的 消 化 液 ， １ｇ组 织 加 ５ｍｌ 化 液 ，７ ℃ 旋 转 消 化 。 消 ３ １ｈ后 收 集 消 化 液 ， ０ ０ ｒ ｒ ｎ离心 ７ ｍｉ， Ｄ—Ｈａ ｋ Ｓ １ ０ ／ ｉ ａ ｎ用 ｎ ’ 洗 涤三 遍 ， 次 悬 浮 细 胞 ， 数 ， 释 细 胞 浓 度 至 ５× １ 再 计 稀 ０ ｃｌ ／ ， 到铺 有 胶 原 的 培 养 瓶 中 ， Ｃ ＇培 养 箱 ， ７℃ 、 ｅ ｓｍｌ种 ｌ 置 Ｏ ３ ５ ｃ ＇饱 和 湿 度 下 静 置 培 养 。 未 消 化 的 组 织 块 加 人 消 化 ％ Ｏ、 液 继续 消 化 ， 复 以 上步 骤 。 重 １ ４ ２ 山羊 乳 腺 上 皮 细 胞 的纯 化 ．． 乳腺 上 皮 细 胞 的纯 化 方 法 有 刮 除 法 【 、 ４ 相差 消化 法 和 相 ］ 差 贴 壁法 。刮 除法 是 将 培 养 瓶 放 在 倒 置相 差 显 微镜 下 观 察 ， 用 标 记 笔 勾 画 出 上 皮 细 胞 集 落 。在 超 净 台 上 ， 细 胞 刮 子 用
（ ｉｃ Ｒ ） Ｅ Ｔ Ｇ ｂ ｏＢ Ｌ ． Ｄ Ａ一２ ａ 上 海 生 工 ） 青 链 霉 素 （ ｍｒ ｃ ） Ｎ （ ， Ａ ｅｏ， ｓ 胰 岛 素 （ｉ ）氢 化 可 的松 （ｉｍ ）催 乳 素 （ｉ ）克 隆 环 Ｓｇ ｍａ ， Ｓｇ ａ ， Ｓｇ ｍａ ， （ ｃ一２ ５ ，ｉ ）细 胞 角 蛋 白 ｌ ０ ９ Ｓｇ ｍａ ， ８单 克隆 抗 体 ，Ａ Ｃ免疫 组 ＳＢ 化 试 剂盒 ， Ａ Ｄ Ｂ显 色 试剂 盒 购 自武 汉 博 士德 公 司 。
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《 海 畜牧 兽 医通讯 》 ２ ０ 上 ０ ８年 第 ４期
山 羊乳腺 上皮 细胞 单 细胞 克隆 的制备 与鉴 定
邵桃 玉 韩 庆广 李 融 赵 国琦 （扬州 大学动 物科学 与技术 学 院 江 苏 扬 州 ２ ５ ０ ２ ０ ９）
环 法 克 隆 形 成 率 为 ５ ９％ ， 胞 稀 释 法 克 隆 形 成 率 为 ３ ５ 。 克 隆 环 法 细 胞 克 隆 率 最 高 ， 是 操 作 很 难 熟 练 进 行 ， 细 ．％ 但 易
导 致 克隆 细 胞 的 不 纯 。 细胞 稀 释 法 操 作 简 单 易行 ， 细 胞伤 害 小 ， 隆率 较 高 。细 胞 形 态学 与 细胞 角蛋 白 １ 对 克 ８鉴 定 为 乳 腺腺 泡上 皮 细 胞 。
胞克隆的研究 ， 为建立山羊 乳腺上皮单 细胞克隆和探１ 材 料 与 方 法
１ １ 主 要 试 剂 ． Ｄ Ｍ ／ １ （ ｉ ｏＢ ） 胎 牛 血 清 （ 州 四季 青 ）胰 蛋 ＭＥ Ｆ ２ Ｇｂ ＲＬ ， ｃ 杭 ， 白 酶 （ ｉ ｏＢ ） 胶 原 酶 Ｉ Ｗｏｔｉｇｏ ） 透 明 质 酸 酶 Ｇｂ ＲＬ ， ｃ （ ｒｈ ｔｎ ， ｎ
（ 用 灭 过 菌 的 枪 头 ） 不 要 的 大 部 分 为 成 纤 维 细 胞 区域 刮 可 将 除 。 洗 涤 、 化 再 培 养 。 相差 消化 法 是 根 据 上 皮 细 胞 与 成 纤 消 维 细 胞 对 胰 蛋 白 酶 消化 敏 感 性 不 同 ， 混 合 生 长 的原 代 或 传 在 代 细 胞 培 养 物 中 ， 加 人 ０ ０ ％ Ｔｒｐｉ 化 液 ， 察 ， 成 先 ．５ ｙｓ ｎ消 观 待 纤 维 细 胞 脱 离瓶 壁 时 ， 人 Ｄ—Ｈ ｎ ’ 液 轻 轻 吹 打 培 养 瓶 ， 加 ａｋＳ 弃 去 消 化 液 ， 人 ０ ０ ％ Ｔｒｐｉ 加 ．５ ｙｓ ｎ一０ ０ ％ Ｅ Ｔ 消 化 液 ， ．４ ＤＡ ３ ℃ 继续 消化 ５ ｎ 待 上皮 细 胞 胞 质 回缩 细 胞 间 隙增 大 ７ ～６ｍｉ， 并 脱 离 瓶 底 后 ， 止 消 化 。所 得 的 细 胞 离 心 、 种 于 其 它 培 终 接 养瓶 中培 养 。相 差 贴 壁法 是 利 用 成 纤 维 细 胞 与 乳 腺 上 皮 细
关键 词 ：山 羊乳 腺 上 皮 细 胞 ； 细 胞 克 隆 单 乳 腺 是复 管 泡 状皮 肤 腺 ， 腺 细 胞 具 有 特 殊 的 乳 汁 分 泌 乳 功能 ， 汁 的 许多 成 分 只 有 乳 腺 上 皮 细 胞 才 能 够 合 成 ， 究 乳 研 乳 腺 细 胞 具有 特 殊 的 重 要 性 。 而 转 基 因 和 克 隆 技 术 的 发 展 使 乳 腺 生 物反 应 器 成 为 ２ 世 纪 研 究 的 热 点 ，因此 人 们 更 加 １ 意识 到动 物乳 腺 上 皮 细 胞 培 养 的重 要 性 。 体 外培 养 的 乳 腺 上 皮 细 胞 系 往 往 含 有 不 同 细 胞 类 型 ， １７ ９ ２年 Ｂ ｅ ｒ ｇ 证 明 人 乳 中 含 不 同 的 细 胞 类 型 。Ｓｏ ｅ ｕｈ ｉ … ｎ ｔ ｒ ｋ 等 、 ｒｕｔｒ 等 也 对 乳腺 细 胞 的类 型 及 其 演 化 规 律 进 Ｗａｂｒ ｒ ｏ 行 了详 细研 究 ， 在 国 内 对 乳 腺 细 胞 类 型 的 研 究 还 很 少 ， 而 特 别 是 进行 单 细胞 克 隆 的 细 胞 类 型 的 研 究 未 见 报 道 。 本 文 使 用胶 原 酶 消化 获取 的 山 羊 乳 腺 上 皮 细 胞 进 行 不 同 方 法 单 细