western blot 相关试剂及步骤
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Western Blot蛋白测定步骤
三蒸水制备后需要高压消毒
一、组织的采集
(一)器材和试剂准备:
镊子、眼科剪、70%乙醇(三蒸水配制)、1.5mL离心管、液氮
(二)步骤(以心脏为例):
1、脱颈椎处死小鼠,读取小鼠编号
2、乙醇消毒胸部,剪开胸腔,剪下心脏(一颗心脏约100mg),排除血液,放入离心管,投入液氮中
3、组织于-80摄氏度冻存
二、组织蛋白的提取:
(一)器材和试剂准备:
4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、RIPA蛋白裂解液(Radio Immunoprecipitation Assay,详见下载的网页)(碧云天公司)、PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride,苯甲基磺酰氟,详见下载的网页prod号36978,Thermo Scientific)、70%乙醇、三蒸水
(二)步骤
1、准备好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水;取出RIPA和PMSF解冻
2、按照1mLPIRA :10uLPMSF :100mg组织的比例,加试剂和组织于4mL离心管
3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头(每管5秒),再研磨组织,上下且圆周运动离心管。每管研磨的转速和时间保持一致。当出现大量泡沫时即可停止
4、静置于冰盒30分钟
5、12000rpm,4摄氏度,30分钟
6、先取100uL上清于离心管,再取300uL上清于离心管。前者用于测试,后者备用。-80摄氏度冻存。
注意:购置的RIPA不宜反复冻融,需分装-80摄氏度保存;PMSF为晶体状,购置后按照说明书溶于异丙醇,分装-80摄氏度保存
三、蛋白上样量定量
采用BCA法测蛋白(BCA protein assay kit,Prod号23225,详见下载的网页,Thermo Scientific):
(一)器材和试剂准备:
1.5mL离心管、BCA测试试剂盒、提蛋白剩余的RIPA蛋白裂解液
(二)步骤
1、详见BCA Protein Assay Kit.pdf 使用说明书,配制溶液,制作标准曲线,测定蛋白浓度。(加好各试剂,混合于37摄氏度放置30分钟)
2、使用Amersham Biosciences GeneQuant Pro分光光度计的562nm测试,读数三次,取平均值(ug/mL)
四、SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制(各浓度的配制见配方表)
SDS-PAGE试剂配制
1) 30%丙烯酰胺溶液:
丙烯酰胺(Acrylamide) 29.0g
亚甲双丙烯酰胺(Bis-Acrylamide) 1.0g
dddH2O,37℃溶解,定容至100ml,棕色瓶存于4℃。
2) 分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris-Hcl ( PH 8.8)
Tris 18.15g
1mol/L HCL 调节PH(可以使用分析纯级别的浓盐酸,下同)
dddH2O 定容至100mL,4℃保存
3) 浓缩胶缓冲液1.0mol/L Tris-Hcl (PH 6. 8):
Tris 12.1g
1mol/L HCL 调节PH
dddH2O 定容至100mL,4℃保存
4) 10% SDS溶液:
SDS 10.0g
dddH2O定容至100ml,室温保存
5) 10%过硫酸铵(AP):
过硫酸铵 0.1g
dddH2O定容至1.0ml,4℃保存,要在一周内使用,最好新鲜配制6)TEMED 遮光保存,分装于EP管冻存
五、电泳
(一)器材和试剂准备:
电泳仪、电磁锅、浮板、离心机、1.5mL离心管、Marker、5×上样缓冲液(loading buffer)、生理盐水、电泳液
5×SDS-PAGE Loading Buffer配制方法(20mL体系总体积):
DTT(DL-Dithiothreitol,二硫苏糖醇)(0.1M) 1.54g
SDS(sodium dodecyl sulfate) 2.0g
1M Tris-CL(pH6.8) 8.0mL
溶解后加入10mL甘油及少量溴酚蓝定容至20mL
(二)步骤
1、电泳上样体系总25uL(即每孔加25uL):(下表的列表示凝胶孔一个孔所加的试剂)
Marker管(泳道)蛋白样品管(泳道)空白管(泳道)
蛋白无?无
5×loading buffer 5uL 5uL 5uL
Marker 7uL 无无
生理盐水13uL 补齐至25uL 20uL
体系总体积25uL 25uL 25uL
Marker条带依次是170、130、95、72(red)、55、43、34、26、17、10(green)KD 大小的梯度。
蛋白样品管的上样量的计算:40ug(这个值不一定的,可以根据算出的体积来改变。比如超过20uL则需要减少上样量。而且如果内参不齐时也需要调整)除以依据分光光度计的读数算出的蛋白浓度ug/mL(根据说明书蛋白以1:20被稀释),再转换成uL的单位。
空白管的设置是因为,当蛋白样品少于9个样品时,空出的孔需要加入物质,以免蛋白跑偏。
2、根据上表加好各试剂后,于270摄氏度水浴5分钟,离心,再上样,倒入电泳液
3、上层胶80V跑,下层胶120V跑(一般至少1个半小时)
六、转膜
(一)器材和试剂准备:
电转仪、电转液、冰块
(二)步骤
1、准备夹板、滤纸、NC膜(浸泡于电转液)
2、取出凝胶切下蛋白和marker所在的凝胶,制成由下到上依次是:滤纸、凝胶、NC膜、滤纸的夹板。放置各层时注意要加电转液湿润并排出气泡,以免干扰电转效果。
3.放入电转仪,加入冰块和电转液,300mA恒流电转1小时。
七、封闭
(一)器材和试剂准备:
丽春红染料、脱脂牛奶、TBST、塑料盒、镊子、剪刀、摇床
(二)步骤
1、取出夹板,用镊子夹出NC膜置于丽春红染料中3-5分钟
2、取出NC膜可以观察一下条带是否均匀、有无跑偏,用剪刀剪去周围空白,并在左下角剪一斜角。用蒸馏水洗去丽春染料。
3.TBST配置5%脱脂牛奶,放入NC膜于摇床上慢摇1小时
八、一抗孵育
(一)器材和试剂准备:
塑料膜、封塑机、一抗、TBST
(二)步骤
1、根据NC膜的大小剪出一张双层的塑料膜,取出NC膜置于塑料膜中,封闭塑料膜的三边,制成一个袋子
2、按照一定比例稀释一抗后,加入塑料膜袋,排气泡,封闭塑料膜开口
3、NC膜正面朝下,放置于慢摇的摇床30分钟,再放入4摄氏度的慢摇摇床过夜
九、二抗孵育
(一)器材和试剂准备: