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乳酸菌的分离及酸奶的制作一、乳酸细菌简介广义的乳酸菌是指一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。
乳酸细菌不是一个分类学名称，在分类上乳酸细菌涉及的有关属在二十个属以上，常见的有：属于革兰氏阳性无芽孢杆菌的乳杆菌属（如德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌）；属于革兰氏阳性球菌的链球菌属（如嗜热链球菌）、乳球菌属（如乳酸乳球菌）、肠球菌属（如粪肠球菌【粪链球菌】）、明串珠菌属（如肠膜明串珠菌）；属于不规则形的革兰氏阳性专性厌氧的双歧杆菌属（如两歧双歧杆菌）；属于能形成内生孢子的芽孢杆菌属（如凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌）等。
随着对细菌分类研究的不断深入，乳酸细菌的属种变动较大，而且新属、新种也不断涌现。
乳酸细菌分布广泛，在土壤、水体、植物（根际、果蔬表面等）、人和动物（肠道、口腔、呼吸道、生殖道等）、食品（乳品、发酵食品等）、动物饲料、粪便、污泥、临床样品中都有存在。
乳酸细菌与工业、农业、医药等领域关系密切，许多种类对人体和动物的健康有益，但也有相当一部分乳酸菌能使人畜致病。
二、制作酸奶中常用的乳酸菌及其生物学特性乳酸菌在食品工业中被广泛应用，使用的乳酸菌均对人体有益，常用于发酵乳制品、果蔬汁乳酸菌发酵饮料、泡菜和酸菜、微生态制剂（益生菌剂）等生产。
制作酸奶中常用的乳酸菌有保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌等。
多数为同型乳酸发酵，少数为异型乳酸发酵（如两歧双歧杆菌）。
1、双歧杆菌(Bifidobacterium)细胞呈Y字形、v字形、弯曲状、勺形等多样形态，典形形态为分叉杆菌，革兰氏染色阳性，亚甲基蓝染色菌体着色不规则，无芽孢和鞭毛，不运动。
化能异养型，对营养要求苛刻，生长繁殖需要多种双歧因子，能利用葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖，通过果糖-6-磷酸支路生成摩尔比2：3的乳酸和乙酸及少量的甲酸和琥珀酸，蛋白质分解力微弱，能利用铵盐作为氮源，不还原硝酸盐，不水解精氨酸，不液化明胶，不产生吲哚，联苯胺反应阴性。
发酵工程学实验报告实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作学院生命科学学院专业应用生物教育班级12应生A班姓名李顺昌学号124120218实验课程乳酸菌的分离和酸奶的制作指导教师许波开课学期2014—2015学年下学期实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作小组合作：是小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤一、实验目的1.掌握分离纯化微生物的基本方法2.掌握酸奶制作的基本原理3.学会酸奶的制作方法二、实验设备与材料1、仪器设备：三角瓶、平皿、试管、移液管、玻璃涂布棒、灭菌锅、超净工作台、培养箱、恒温摇床、冰箱等。
2、材料：市售酸奶、奶粉、白糖、棉花、酸奶瓶（自备，1个/人）等。
3、培养基：乳酸菌分离用乳酸菌分离用培养基：牛肉膏：0.5％；酵母膏：0.5％；蛋白胨：1％；葡萄糖：1％；乳糖：0.5％；NaCl：0.5％；琼脂：2.5％；pH6.8。
配制250mL/组，装于2个三角瓶三、实验原理1、酸奶制作的基本原理（1）酸奶：以牛奶为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种乳制品饮料。
（2）生理生化原理牛奶（乳糖）→接种乳酸菌→β-D-半乳糖苷酶→乳糖（半乳糖和葡萄糖）→乳酸发酵（葡萄糖）→乳酸→破坏钙-酪蛋白-磷酸复合物的稳定性→蛋白质凝结→酸奶2、提供适宜的生长条件、采用一定的微生物分离纯化方法，就能够从酸奶中分离出乳酸菌。
3、酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对人体的肠胃消化道疾病有良好的治疗效果。
四、实验方法步骤（一）乳酸菌的分离纯化——稀释涂布平板法1、倒平板（约6块/100ml）2、制备酸奶稀释液（1）将0.5mL酸奶吸入4.5mL无菌水（自备）中，摇动5min；（2）用无菌吸管吸出0.5mL酸奶悬液，加入盛有4.5mL无菌水的试管中，充分混匀，制备得到10-2稀释液；（3）再从中吸出0.5mL加入盛有4.5mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3稀释液；（4）以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6酸奶稀释液。
乳酸菌乳饮料的生产工艺简述随着当前食品工艺技术的不断开发，乳酸菌乳饮料，作为一种以酸奶为原料，借助于牛奶中的蛋白质与果汁的芳香色泽以及其他矿物质成分，经过严格的配制、发酵和均质等程序加工，含有一定数量的活性乳酸菌,具有独特的口感风味,对于增强人体健康极为有益，是现代生活中重要的营养型饮用品。
针对乳酸菌乳饮料生产技术进行分析，既促进了乳品消费的多样化选择，更有助于促进乳品加工技术的进一步开发，保障人类饮食健康。
1、乳酸菌乳饮料的特点乳酸菌乳饮料是以酸奶、乳粉、植物蛋白乳等为原料，加入一定量的水分、蔗糖、果汁、香料、稳定剂等辅料，经灭菌、冷却、配制、接种乳酸菌发酵剂进行发酵,调配均质后制成。
酸奶是以鲜乳或乳粉为原料，发酵后再加入其他辅料加工制得的具有丰富营养价值和独特风味的发酵型含乳饮料。
乳酸菌乳饮料通常分为活性和非活性两大类。
活性乳酸菌乳饮料在发酵后不再杀菌，含有多种维生素、酶类和一定数量的活性乳酸菌，有利于调节人体肠道微生态的平衡，保质时间较短。
非活性乳酸菌乳饮料在发酵后必须再次杀菌，常温下保存时间较长.乳酸菌乳饮料具有清凉爽口、稀稠适中,营养全面的特点.乳酸菌乳饮料内含有少量对人体有益的乳酸菌等微生物，具有鲜奶和果汁的口感风味，以及多种营养物质.由于乳酸菌的发酵作用使乳液中的乳糖被分解成半乳糖和乳酸，部分蛋白质分解成小的肽链和氨基酸,从而使乳液的营养成分更易消化和吸收，适合乳糖不耐症患者的饮用，还能提高钙、磷等在人体中利用率。
2、乳酸菌乳饮料的生产技术工艺2。
1 发酵酸乳制作(1）鲜奶采集:鲜奶是从动物身上直接挤出的未经任何加工的乳液，乳糖含量较高，营养价值很大，可以补充人体需要的蛋白质、脂肪和钙质。
采集原生鲜奶时要针对产乳动物进行检疫，严格消毒产乳乳头，包括对原生鲜牛奶的过滤、冷却等技术预处理.（2)净化脱气：原生鲜奶中含有少量非结合分散性气体，对鲜奶的加工有破坏作用,影响鲜奶分离效率，促使脂肪球聚合，导致发酵乳中乳清析出等，需要将乳液预热至68℃,使用真空脱气罐除去细小分散气泡，去除空气及异味气体。
乳酸菌饮料生产工艺流程
乳酸菌饮料是一种以优质鲜奶为原料，经过乳酸发酵后制成的饮料。
下面是乳酸菌饮料的生产工艺流程。
1. 原料准备：选用新鲜牛奶作为原料，过程中需要加入乳酸菌种，以及其他辅料如糖、风味剂等。
同时，对牛奶进行预处理，如透过滤、杀菌等。
2. 配制发酵液：将乳酸菌种和辅料加入预处理后的牛奶中，按照一定比例进行混合，形成发酵液。
混合后的发酵液需要经过均质处理，以确保复合物的均匀分布。
3. 发酵：将配制好的发酵液装入发酵罐中，进行发酵。
发酵罐内需要控制适宜的温度和湿度，以利于乳酸菌的生长和发酵。
发酵时间一般为6-12小时，发酵过程中会产生乳酸和其他有
益物质。
4. 过滤：发酵结束后，将发酵液进行过滤，去除固体物质和杂质。
过滤可以采用物理过滤方法如膜过滤或离心过滤。
5. 调整口感：对过滤后的液体进行调味，可以加入糖、果汁等，以调整口感和风味。
6. 杀菌：调整好口感后的液体需要进行杀菌处理，以杀死其中的有害微生物，延长产品的保质期。
常见的杀菌方法包括热处理、高压处理等。
7. 填充和包装：杀菌后的液体进入自动灌装机进行灌装，灌装成瓶或袋装。
然后对容器进行密封和包装，以确保产品的质量和安全性。
8. 成品检验：对包装好的成品进行质量检验，包括外观、口感、酸度、菌落总数等指标的检测。
检验合格后，产品可以正常上市销售。
乳酸菌饮料生产工艺需要严格控制各个环节的工艺参数，以确保产品质量的稳定性和卫生安全。
生产工艺流程的具体细节可能会因生产厂家和产品差异而有所不同，但以上所述是乳酸菌饮料生产的一般流程。
酸奶中乳酸菌的检测与酸奶的制作综合性实验报告组员：摘要：以奶粉为原料，蒙牛酸奶为接种剂自制酸奶并进行感官评价。
用稀释倒平皿法和划线分离法分离出蒙牛酸奶中的乳酸菌。
分别用改良MC培养基和改良TJA培养基培养一段时间后观察菌落形态并进行菌落计数。
再挑取少许不同培养基上的菌落用革兰氏染色法染色，观察乳酸菌的个体形态。
关键词：酸奶制作、乳酸菌菌落形态及总数、MC培养基、TJA培养基、革兰氏染色、乳酸菌个体形态1 前言酸奶是以新鲜的牛奶为原料经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加有益菌（发酵剂），经发醇后，再冷却灌装的一种牛奶制品。
按是否加糖，酸奶可分为淡酸奶和加糖酸奶两种，我国常见的酸奶制品是加糖酸奶，即在制作酸奶的原料乳中加入一定量的白糖进行发酵得到的酸奶产品。
酸奶营养丰富，其蛋白质和钙质较鲜乳更易消化吸收，抑制腐败细菌的繁殖，降低肠道内毒素浓度。
酸奶内含乳酸菌并在发酵过程中产生乳酸及族维生素等,能增强消化，促进肠道蠕动和机体物质的代谢，提高人的免疫力, 长期饮用即可保证钙质的需求, 又可健肠胃, 是一种对人体肠胃非常有益的保健食品。
2 材料与方法2.1 仪器与器材温箱：47℃、冰箱： 4℃、电磁炉、锅吸管：容量为1，10和25mL、广口瓶或三角瓶：容量为500mL、平皿：直径为9cm、试管（带试管塞）：18×180mm、显微镜、带玻璃珠的三角瓶、移液枪、移液管、恒温箱、电磁炉、平底锅、2个奶瓶、保鲜膜、接种环、酒精灯。
2.2 培养基和试剂培养基：改良MC 培养基,改良TJA培养基。
材料：番茄汁、革兰氏染色液、蒙牛酸奶、脱脂奶粉、白砂糖。
2.3 方法2.3.1 无菌水和培养基的制备(1)无菌水：将20支试管分别用移液枪注入9ml的自来水，塞上试管塞，分10支捆成一扎并用牛皮纸包好。
将2个三角瓶分别注入150ml的自来水，塞上瓶塞，分别用牛皮纸封好。
将上述的试管以及三角瓶一起高压蒸汽灭菌。
(2)培养基：MC培养基:称取16g改良MC培养基粉末加200mL水置于电炉上小火加热溶解；TJA培养基:称取12g改良TJA培养基粉末加10mL茄汁和200mL水置于电炉上小火加热溶解，分别制得。
制作酸奶的微生物原理
制作酸奶的微生物原理如下：
1. 使用乳酸杆菌：酸奶的发酵主要依靠乳酸杆菌，如乳酸杆菌属中的拉氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）和嗜热乳杆菌（Streptococcus thermophilus）。
这些乳酸杆菌能够将乳糖转化为乳酸，从而导致酸奶的酸味。
2. 乳糖的发酵：乳糖是牛奶中的主要糖类，乳酸杆菌通过发酵作用将乳糖分解成乳酸。
乳酸的产生会降低酸奶的pH值，从而抑制其他有害细菌的生长。
3. 产生酸奶特有的口感和香味：除了乳酸的产生外，乳酸杆菌还会产生一些其他的化合物，如乙醇、二氧化碳、醚等，这些物质赋予了酸奶特有的口感和香味。
4. 温度控制：制作酸奶需要在一定的温度范围内进行发酵，通常为摄氏43-46度。
在这个温度下，乳酸杆菌能够更好地生长和繁殖，加速乳糖的发酵过程。
综上所述，制作酸奶的微生物原理主要涉及乳酸杆菌的发酵作用，通过将乳糖转化为乳酸，产生酸奶的酸味和口感。
同时，乳酸杆菌还会产生一些其他化合物，为酸奶赋予特有的香味和口感。
乳酸菌的分离及酸奶的制作乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，常见于发酵食品中，特别是酸奶中。
乳酸菌通过产酸作用，可以改变食品的酸碱度，增强味道和保存食品的能力。
因此乳酸菌的分离和酸奶的制作具有重要的实际意义。
1.选择合适的发酵食品作为样品，如酸奶或发酵乳。
2.将样品进行稀释，然后分别接种在适宜的培养基上，如牛乳琼脂培养基或MRS培养基。
3.培养基应保持在适宜的温度，通常是37°C，促使细菌的生长。
4.观察培养基上的菌落形态，标记明显异于其他菌落的菌落。
5.使用无菌技术，将单独的菌落分离到新的培养基上。
6.对新培养的乳酸菌菌株进行纯化和鉴定，如形态学观察、生理生化特性检测等。
酸奶的制作主要是通过乳酸菌进行发酵来实现的，以下是一种常见的酸奶制作方法：1.选择新鲜的牛乳作为原料，最好使用全脂牛乳，因为全脂牛乳中的脂肪能够提供乳酸菌生长所需的营养。
2.将牛乳煮沸并冷却至40-45°C，这是乳酸菌生长的最适温度。
3.加入适量的酸奶发酵剂，这可以是商业化的酸奶菌干粉或者是之前分离得到的纯化乳酸菌菌株。
4.用搅拌器均匀地搅拌牛乳，以确保发酵剂充分混合。
5.将搅拌均匀的牛乳倒入适宜的容器中，并加盖保温。
可以使用保温箱或温暖的地方来保持发酵温度。
6.将容器放置在温暖的地方，保持温度在37-43°C之间，使乳酸菌进行发酵。
发酵时间通常为6-8小时，但可以根据个人口味和偏好进行调整。
7.发酵完成后，将酸奶放入冰箱冷藏，以停止乳酸菌的发酵过程。
8.酸奶制作完成后，可以根据个人口味添加适量的糖、水果、坚果等作为调味品。
通过乳酸菌的分离和酸奶的制作，我们可以获得高质量的酸奶产品，并且能够自己调整酸奶口味和营养成分。
此外，乳酸菌的分离和酸奶制作对于学术研究和食品工业也具有重要意义，可以深入了解乳酸菌的功能和应用，以及改善食品的质量和口感。
酸奶中优势微生物的分离及乳酸菌饮料的制作滕小艳生命科学学院生物科学专业2006级1班指导老师：宋波摘要：为了解我们日常饮用的酸奶中益生菌的基本情况，本次实验通过酸奶的制作，菌种的活化，传代，分离鉴定和平板划线等方法，对其中的2种菌进行镜检和革兰氏染色以确定其类型，；然后用1种或2种等量混合的方法，发酵制成的产品，比较其发酵性能。
结论：在琼脂培养基上，圆形稍扁平的黄色菌落，及其周围培养基变为黄色者，即为乳酸菌。
乳酸菌根据细胞为球状或杆状，可分为两大类，即为乳酸链球菌和乳酸杆菌族。
嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵的酸奶风味明显优于嗜酸乳杆菌单独发酵。
凝乳时间也大为缩短。
关键字：保加利亚乳杆菌嗜酸乳杆菌嗜热链球菌革兰氏染色混合发酵Yogurt microorganisms and lactobacillus drink productionTengXiaoYanLife science college of biological science class 1 grade 2006 ，instructor: song boAbstract: in order to understand our everyday drinkable probiotic yogurt, the basic condition of this experiment through, yogurt, strains of activation, separation and identification of flat nestin crossed, the method of the two kinds of bacteria for gram's staining and to determine the types. Then use one or two equal mixing method, fermented product, compares the performance of fermentation.Conclusion: in AGAR medium, circular slightly flat yellow, and its surrounding medium colony, to become yellow lactobacillus. According to the cells to aspen, globular or can be divided into two categories, namely, streptococcus and lactobacillus to lactic acid. Acidophilus andKey words：Bulgaria lactobacillus acidophilus streptococcus thermophilus cultured mixed fermentation gram's staining.嗜酸乳杆菌存在于人类和一些动物的小肠内，它在代谢过程中产生能产生乳酸﹑过氧化氢﹑乳酸杀菌素和类细菌素，从而抑制肠道内有害菌的生长，调整胃肠环境，同时嗜酸乳杆菌还有防治结肠癌和降低体内胆固醇的作用。
由于嗜酸乳杆菌优良的保健功能及耐酸和耐胆汁的特点，因而被称为第三代乳酸发酵剂，发展前景十分广阔，但嗜酸乳杆菌的生产特性差，凝乳时间长，风味口感不好，本研究利用球菌和杆菌之间相互促进的共生作用，将嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合培养，以求得最佳的生产效果，从实验结果可以看出：两种菌混合的产酸能力要高于单独培养。
影响凝乳时间各个因素的主次顺序为：其中接种量对对凝乳时间的影响要远远大于其它三个因素。
影响产品感官评定指标各个因素的主次顺序为：其中加糖量对感官评定指标的影响最大，其次为接种量和培养温度，菌种配比的影响最小。
综合考虑各因素对凝乳时间和感官评定的影响后得出和混合发酵生产酸奶的最佳工艺参数：接种量，加糖量，培养温度。
1．材料和方法1.1材料1.1.1培养基BCG牛乳培养基：A溶液—脱脂乳粉100g，水500ml,加入溴甲酚绿（BCG）乙醇溶液1ml,80℃灭菌20min,B溶液—酵母膏10g，水500ml,琼脂20g,PH6.8,121℃湿热灭菌20min,以无菌操作趁热将A﹑B溶液混合后倒平板。
细菌培养基—1.成分：牛肉膏0.5g,蛋白胨1.0g,NACL0.5g,蒸馏水100ml,PH7.2~7.5。
2.制法：加热溶解，调PH值，分装于三角瓶中121℃,20min高压灭菌。
脱脂乳试管—直接选用脱脂乳液或脱脂乳粉与5%蔗糖水为1：10的比例配制，装量以试管的1|3为宜，115℃灭菌15min。
1.1.2原料，脱脂乳粉，全脂灭菌的纯牛奶1L，蔗糖。
1.1.3仪器及用具：恒温水浴锅，酸度计，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养箱，酸乳瓶（200~300ml），灭菌的平板培养皿，300ml三角瓶，试管，移液管。
1.2方法1.2.1制备平板培养基配BCG溶液，0.8gBCG加入50ml 20%乙醇中，其中20%乙醇由25ml 95%的酒精+75ml 蒸馏水制成，然后配A溶液﹑B溶液，分开灭菌，各500ml,在无菌操作台上趁热将A溶液﹑B溶液混合均匀后，倒平板30个。
1.2.2制备稀释液（无菌操作）将混合菌种在无菌操作台上倒入1L的全脂灭菌的纯牛奶中，盖好盖子，在37℃恒温培养箱中培养6~8h,再取出，用手摇动，感觉是否变稠状。
然后用灭菌的移液管取0.5ml放入4.5ml无菌水的试管中，依次稀释到10-5，取10-4﹑10-5两个稀释度的稀释液各0.1~0.2ml，分别接入BCG牛乳培养基琼脂平板上各5个平板，用无菌涂布器依次涂布;或者直接用接种环蘸取原液平板划线分离，置40℃培养48h,将接种好的培养皿倒置，即平皿盖朝下放置。
用于进一步纯化分离或直接转接斜面，1.2.2 平板划线分离微生物1.2.2.1 倒平板按无菌操作要求，在酒精灯火焰旁边操作，取融化并冷却至不烫手的培养基，倒入无菌培养皿中，倒量以铺满皿底为限，平放桌上待其充分凝固，备用。
1.2.2.2 划线分离使用接种环，分别从10-4﹑10-5两个稀释度所倒的平板培养基中挑取不同的单菌落，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，依次编号为A1-A5，然后将接种好的培养基倒置，于40℃中恒温培养48h。
[1]1.2.3微生物的复筛培养3天后再按照平板划线的方法从A1-A5培养基中挑取单菌落接种到相应的平板培养基，依次编号为B1-B5，然后将接种好的培养基倒置，于40℃中恒温培养48h。
1.2.4微生物的镜检及鉴定1.2.4.1 观察菌落的基本形态从各培养基中选取不同的单菌落，观察其形状及颜色，并记录。
1.2.4.2 观察该菌株的活菌（常用压滴法）首先将洁净无油腻的载片放于自己右边前方，在中央放一小滴无菌水。
将酒精灯放于自己的正前方，点燃。
然后用无菌操作方法挑取少量菌体，与载片上的水滴充分混匀,把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架。
接着用镊子取一洁净的载玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。
如菌液过多，可用吸水纸吸去一部分。
先用低倍镜然后转用高倍镜观察，观察时光线要适当调暗些。
[2]1.2.4.3菌种的鉴定选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8~24h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状（两种形状的菌种均分别选入），革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4~6次，最终选择出在3~6h能凝乳的牛乳管，作菌种待用。
1.2.5 .乳酸菌的饮料的制作1.2.5.1将脱脂乳和水以1：7~10（W/V）的比例，同时加入5%~6%蔗糖，充分混合，于80~85℃灭菌10~15min，然后冷却至35~40℃，作为制作饮料的培养基质。
将纯种嗜热链球菌﹑嗜酸乳杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂[3]，均以2%~5%的接种量分别接入以上培养基基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂。
接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液重复分装3~5瓶，随后将瓶盖拧紧密封。
1.2.5.2把接种后的酸乳瓶置于40~42℃恒温培养箱中培养3~4h。
培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。
然后转入4~5℃的低温下冷藏24h以上。
经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(PH4.0~4.5)，凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。
1.2.5.3以品尝为标准评定酸乳质量采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株酸乳发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。
品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。
比较项目见表—2。
1.2.6微生物的生理生化性质的测定1.2.6.1革兰氏染色首先制片、涂菌，用无菌操作方法分别从试管中沾取菌种一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀，直径约1cm的菌膜，涂菌后接种环火焰灭菌。
干燥于空气中自然干燥.亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥（温度不宜过高）。
固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上,便于颜料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰三次，以热而不烫为宜,防止菌体烧焦、变形，此制片可用于染色。
初染于制片上滴加结晶紫染液染，1分钟后，用水洗去剩余染料。
媒染滴加卢戈氏碘液，1分钟后水洗。
脱色滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止（根据涂片之厚薄需时30秒至1分钟），水洗。
复染滴加石炭酸复红液复染1分钟，水洗。
用滤纸吸干，油镜镜检。
最后观察并记录结果1.2.7发酵性能的测定[4]将分离得到的4株菌以5%的比例接种于无菌脱脂乳培养基中，37℃恒温培养箱中发酵8h，冷却并在冰箱中冷藏（4℃）10h后定各指标。
滴定酸度的测定：取待测酸乳样品，用浓度为10g|L的氢氧化钠溶液测定滴定酸度；PH值的测定：取待测酸乳样品，用ZD-2型自动电位测定仪测定PH值；黏度的测定：取酸乳样品中用NDJ-8S型数显黏度计测定黏度；保水率的测定：在离心管中各放入质量W为10g的酸乳，于3000r|min离心10min。
2.结果与分析2.1酸奶中微生物的的稀释分离恒温箱培养后1-5号培养基上面都有菌落长成，根据菌落形态初步判断有乳酸菌。
2.2平板划线分离微生物划线分离后恒温培养结果：各培养基上均有单菌落生成。
2.3微生物的复筛各培养基上长出的菌落形态颜色较为均一，可以作为下一步实验的对象，其他培养基上的菌落差异较大。
2.4微生物的镜检及鉴定（1）保加利亚杆菌细胞形态长杆状，两端钝圆。
固体培养基生长的菌落呈棉花状。
易于其他乳酸菌区别。
能利用葡萄糖﹑果糖﹑乳糖进行同型乳酸发酵产生D型乳酸（又酸涩味，适口性差），不能利用蔗糖[3]。
