代谢工程(幻灯片)

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(2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因， 从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物 和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌 能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗 的底物。 (3)转移或构建新的代谢途 通过转移代谢途径、构建新的代谢途 径等方法来实现。
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三、代谢工程发展趋势
传统的代谢工程是以代谢网络理论为 基础，以代谢分析和代谢改造为主要手段。 代谢途径的复杂性给检测分析带来不少麻 年代末兴起的逆世纪烦，在某种程度上阻 碍了它的应用。 逆代谢工程
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细胞对于基质的吸收与产物的释放模型 及分析也是代谢工程的重要组成部分。 它包括物质转运过程的生化基础(如转运 蛋白机制、转运动力学、载体介导转运 中的能量偶连以及细胞转运活性的调节 等)、研究方法、过程控制(如生物工艺过 程中营养和吸收的关系、生物工艺过程 中产物的分泌控制、干扰代谢流的结合 以及转运过程的建模)等。
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(2)基因操作 利用代谢工程战略修饰改造细胞代谢网络 的核心是在分子水平对基因簇进行遗传操作， 其中最典型的形式包括对靶基因或基因簇的克 隆、表达、修饰、敲除、调控、构建特殊的基 因转移系统以及重组基因在目的细胞染色体上 的稳定整合。 在代谢工程的一些应用实例中，代谢流的 控制和分析也可绕过基因操作，直接通过发酵 和细胞培养的工艺和过程参数控制提高细胞代 谢流，并强制使代谢流流向期望的目标产物。
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(2) 分析技术 在获得大量生化反应基本数据的基 础上，采用化学计量学、分子反应动力学 和化学 程学的研究方法并结合先进的计算 机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的 动态特征与控制机理，以确定代谢改造的 思路。这些分析手段包括能准确测定细胞 内代谢网络流的稳态法、展示代谢流控制 过程的扰动法、简化复杂代等提出的的组 合法以及代谢网络优化技术等。
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节点：网络分流处的代谢产物称为节点。 柔性节点：是指由节点流向各分支的代谢流量分割 率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈 抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。 强刚性节点：是指由节点流向某一分支或某些分支 的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的 反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用 所致。 弱刚性节点：是指介于前两者之间，由该节点流向 各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶 活较高或对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑 制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物 的产率。 柔性及弱刚性节点是代谢设计的主要对象
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如果代谢网络中各节点同等重要，即对产物 的产量具有相近的影响，则这类代谢网络称 为依赖型代谢网络。依赖型代谢网络的存在 会给代谢工程的实施带来很大的困难。 如果代谢网络的主节点不集中，则可以通过 对代谢的修饰影响目的产物的产量，这类网 络为独立型网络。
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2 代谢分析
代谢分析是代谢工程的重要组成部分。它 涉及代谢流的定量和定向、研究细胞内代 谢物浓度的反应工程方法以及细胞内稳态 流分析等。 代谢流分析是代谢分析的一个重要手段。 它假定细胞内的物质、能量处于拟稳态， 通过测定胞外物质浓度，再根据物料平衡 计算细胞内的代谢流。
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代谢中间产物作为生物合成的前体及 能量供应者，转向终产物的碳流的大小将 最终决定终产物的产率。中间代谢产物的 代谢流改变会受到细胞的抑制，并引起胞 内功能的严重改变。传统的代谢工程对中 间产物的生理作用考虑较少，从而使产率 远远达不到所计算的理论最大产率。
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弹性系数和流量控制系数是代谢控制分 析研究的两个主要指标。 弹性系数揭示代谢物浓度变化对反应速 率的影响程度。 而流量控制系数则为单位酶变化量引起 的某分支稳态代谢流量的变化，用来衡 量某一步酶反应对整个反应体系的控制 程度。 这两个系数相互关联，可直接或间接测定。
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放射性标记、同位素示踪等技术的应用使代谢流 分析更简单、方便。通过对细胞在不同情况(如改 变培养环境、去除抑制、增加或减少酶活等)的代 谢流分析，便可确定节点类型、确定最优途径、 估算基因改造的结果、计算最大理论产率等。对 于简单的反应系统，通过对所有的代谢网络的精 准分析及平衡计算就可以得到满意的结果。 但是，对于比较复杂的代谢系统，代谢流分 析就显得棘手。
限制活性 的因素 鉴别表型 基因 菌种改造
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第二章 代谢工程基本理论
1 有关术语
(1) 生物基质要素:构成生物基质大分子池的一类物 质，包括RNA、DNA、 蛋白质、脂质和碳水化合 物等。 (2)途径是指催化总的代谢物的转化、信息传递和其 他细胞功能的酶促反应的集合。 (3)代谢网络:分解代谢途径、合成代谢途径和膜输送 体系的有序组合构成代谢网络。广义的代谢网络包 括物质代谢网络和能量代谢网络。 (4) 通量: 物质或信息通过途径被加工的速率。
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5 代谢改造思路
代谢工程研究的重点在于改造代谢网络， 以便生产特定目的代谢产物或具有过量生 产能力的工程菌应用于工业生产。根据微 生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、 扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方 法。
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(1)改变代谢途径方法 加速限速反应 增加限速酶的表达量，来提高产物 产率。然而限速酶反应的改变可能会给 整个代谢网络带来负面影响。 改变分支代谢途径流向 提高代谢分支点某一分支代谢途径 酶活力，使其在与其它的分支代谢途径 的竞争中占据优势，从而提高目的代谢 产物的产量。
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(3) 基因操作技术
在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可 以归结为基因水平上的操作。这个过程涉及几 乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术， 如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA 的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化， 基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。 代谢工程技术得以广泛应用的一个重要前 提就是外源基因在所有生物物种（包括人体） 中转化和表达的可行性，而这种可行性又在很 大程度上依赖于各种载体和基因表达调控元件 的开发。
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(3) 效果分析 很多研究结果表明，一次性的代谢设 计和基因操作往往并不能达到实际生产所 要求的产量、速率或浓度，因为大部分实 验涉及的只是与单一代谢途径有关的基因、 操纵子或基因簇的改变。然而通过对新途 径进行全面的效果分析，根据由初步代谢 操作所构建出来的细胞所表现出的限制与 缺陷，可以作为新一轮实验的改进目标， 如此反复进行遗传操作即可获得优良物种。
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1 代谢网络理论
代谢网络理论把细胞的生化反应以网络 整体而不是孤立地考虑。细胞代谢的网 络由上万种酶催化的系列反应系统、膜 传递系统、信号传递系统组成，并且既 受精密调节，又彼此互相协调。 各种代谢都不是孤立进行的，而是相互 作用、相互转化、相互制约的一套完整、 统一、灵敏的调节系统。
代谢工程
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一、代谢工程概述
细胞的生命活动是通过活细胞和细胞 群的代谢网络进行的，而代谢网络是由一 系列酶的级联化学反应以特异性的膜转化 系统构成。 对人类的应用而言，活细胞自身固有 的代谢网络的遗传特性并不是最佳的，为 了积累大量的某种代谢产物，就必须要打 破并重建细胞的代谢平衡。
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代谢工程概念演变 代谢工程又称途径工程，最早由美国加 州理工学院化学工程系教授Baily J.E. 于1991 年提出的。 随后Stephanopoulos 认为，代谢工程是一 种提高菌体生物量功代谢物产量的理性化方 法。 Cameron 认为代谢工程是动用重组DNA 技术有目的地改造中间代谢的方法。 现在的定义：通过某些特定生化反应的 修饰来定向改善细胞的特性功运用重组DNA 技术来创造新的化合物。
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③要系统分析代谢流扰动的结果。如果某 个代谢流的扰动对下游代谢流并未能造 成可观察的影响，那么就可以认为该处 的节点对上游的扰动是刚性的，相反则 成为柔性的。一般地，在刚性节点处， 不能通过改变上游酶活性来影响下游代 谢流。
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二、代谢工程的研究内容
代谢工程涉及的主要内容包括：
①生物合成相关代谢调控和代谢网络理论； ②代谢流的定量分析； ③代谢网络的重新设计； ④中心代谢作用机理及相关代谢分析； ⑤基因操作。
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代谢工程研究思路
解析反应体系，找到能反映细胞生理状态的主要 参数； 如何利用这些信息组织一个代谢网络的控制设计， 并确定合理靶点以修饰构建特定的物种； 怎样正确评估基因或酶的真实修饰效果，以实施 新一轮的代谢网络修饰直到确立最佳状态，从而取代 普通的定向靶点筛选程序； 代谢工程关注的是代谢途径的组合而单一的反应， 因此必须考察完整的生化反应网络，重视代谢网络和 目标产物的热力学可行性，代谢流及其控制。 代谢工程最为突出的特征是强调生化反应途径与 代谢流及其体内条件的控制相关联。
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代谢工程的首要工作就是利用在广泛而 深入的研究中获得的技术信息进行组合 设计。 将代谢流的定量分析方法与代谢流控制 的分子生物学技术结合在一起，系统、 合理地修饰生物细胞的遗传性状，是代 谢工程的基础。
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系统研究代谢流及其控制机制包括以下三 大基本步骤 ①建立一种能尽可能多的观察代谢网络并测 定其流量的方法。 为了做到这一点，通常从测定细胞外代谢 产物的浓度入手进行简单的物料平衡。由于一 个代谢途径的代谢流并不等于该途径中一个或 多个酶的活性，所以酶法分析并不能提供代谢 网络真正的代谢流信息，除非相应的酶在体外 分析条件下存在并具有活性。因此，在代谢分 析中，酶法分析常会错误地显示相似数量级的 代谢流，从而导致产生不正确的结论。
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②在代谢网络中施加一个已知的扰动，以 确定在系统松散之后达到新的稳态时的 代谢流。 常用的扰动方式包括启动子的诱导、 底物流加、特定碳源消除或物理因素变 化等。虽然任何有效的扰动对代谢流的 作用都是可以接受的，但扰动必须定位 于近邻途径节点的酶分子上。一种扰动 往往能提供多个节点上的相关信息，这 对于精确描述代谢网络控制结构所必需 的最小实验量是至关重要的。
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代谢工程要解决的问题 目前代谢工程要解决的主要问题是改变某 些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质在不 同途径中的流量分布。 典型目标是修饰初级次级代谢，将碳架物 质流导入目的产物的理想载流途径以获得产物 的最大转化率。