不同植物总DNA的提取及亲缘关系的研究(合肥工业大学)
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不同物种的DNA提取方法
不同物种的DNA提取方法摘要DNA作为遗传微粒，为生物体的遗传信息复制和传递做出了巨大的贡献，而1953年J.Watson和F.Crick提出的双螺旋结构模型不仅解释了有关DNA 的性质，而且也清楚地解释了DNA的各种生物功能，进而使DNA的研究进入到了分子水平。
然而DNA是如何具体在生物体内发挥其作用的，到现在还是一个热门课题，为了研究其作用，就需要从各种物种中提取DNA，由于不同物种结构的复杂性不同，导致提取DNA的方法也是各不相同，为此，我整理了一些物种的DNA提取方法。
关键词：物种、DNA提取1、月季DNA的提取方法：之所以提取高质量的月季DNA有难度，是因为其体内富含多糖及多酚类的物质，在一般的DNA提取方法中，很难被分离，这就严重干扰了提取月季DNA的纯度以及完整性。
为了解决这个问题，北京市园林科学研究所采取五种提取方法，在其最后的实验结果表明：Draper法提取月季DNA的纯度最高，完整性最好。
2、大麦小孢子DNA的提取方法：要想分离提取小孢子的DNA，就需要降解小孢子壁，而小孢子壁由外壁和内壁组成，内壁主要由纤维素和果胶组成，这类物质能够被相应的酶所水解，而外壁的主要成分是类胡萝卜素和类胡萝卜酯的氧化多聚化的衍生物，化学物质非常稳定，到目前为止，还没有相应的酶可以水解。
因此外壁便成为提取高质量的大麦小孢子DNA的一个“拦路虎”。
对此，莱阳农学院展开了研究，他们通过“收集大麦的花药”、“分离小孢子”、“分离小孢子”。
最后“DNA的提取”等一系列的步骤，在最后的统计结果中，发现CTAB法和微量快速提取法取得不错的效果，而且DNA的得率和质量几乎一样。
这也证明了上述两种方法是有效而可行的，当然在这个研究过程，首次采用超声波法进行破壁，收到出乎意料的效果，也为CTAB法和微量快速提取法提供了必要的条件。
所谓的CTAB，其中文名是十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
合肥工业大学 生化综合实验报告
生物化学综合实验黄豆芽总DNA的提取及亲缘关系的研究姓名：逯玉东学号:20106441班级：生物学院食品10-2班实验时间：2012.7.2—2012.7.3实验目的：1、学会和掌握核酸制备的一些基本操作和方法，并通过分光光度法和电泳等实验技术研究核酸的性质；2、学习用紫外分光光度计和水平琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度、浓度的原理与方法。
3、掌握利用限制性内切酶酶切DNA的原理和方法,培养学生利用限制性内切酶位点图谱进行实验设计的能力；4、学会通过琼脂糖凝胶电泳法分析不同材料之间DNA的亲缘关系。
关键词：核酸制备，CTAB法，限制性内切酶，分光光度法，电泳Abstract：1.The extraction of plant DNA.2.Determination of plant DNA purity and concentration.3.Plant DNA restriction endonuclease enzymatic.4.DNA agarose gel electrophoresis to separate DNA fragments.5.Studies on the relationships of plant DNA.Key words:Nucleic acid preparation,CTAB,Restriction endonuclease, Spectrophotometry,Electrophoesis.一．黄豆芽DNA的提取1.材料：正在生长的黄豆芽2.主要仪器和用具：高速冷冻离心机（16000r/min）;恒温水溶；紫外可见光分光光度计；电泳仪及微型电泳槽；电冰箱；凝胶成像系统或手提式紫外检测仪；微波炉；电子天平；纯水系统；1.5mL离心管及离心架；微量移液管10uL、200uL、1000uL各1支及各量程吸头；常用玻璃仪器及滴管等；一次性塑料手套。
3.试剂（1）0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液（0.607gTris碱溶于40ml灭菌双蒸水。
安徽桑树品种全基因组DNA提取方法研究
[7] 李军集,廖和发,刘海龙.药用植物六角莲基因组DNA提取方法[J].广西林业科学,2016,362:8992.
[8] 戴瑞强.华桑遗传多样性分析及核心种质构建[D].镇江:江苏科技大学,2016.
[9] White T J, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and directsequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenctics[M].California: Academic Press,1990选取5 种安徽桑树地方品种样本采自安徽省农业科学院蚕桑研究所桑树品种选育中心。以桑嫩叶为实验材料，品种分别为 金寨九龙桑、皖桑1 、红星5 、皖花桑、7707。
1.2 DNA提取方法
桑树基因组DNA提取采用CTAB法，参照赵卫国[2]的方法，稍加改进。
①取0.1~0.2 g 嫩叶剪碎，在液氮条件下磨碎成粉末，转入经55℃预热的600 L 的CTAB 提取缓冲液0.1 molLTrisHCl，pH 8.0，0.02 molL EDTA，1.4 molLNaCl，2% CTAB，1% PVP，0.04 molL 巯基乙醇中 ②混匀后在65℃水浴裂解30min，期间轻摇数次以混匀，室温冷却，12016 rmin 离心15 min ③加入500 L氯仿:异戊醇24:1，抽提细胞残渣和叶绿体，轻轻颠倒混匀至乳白色 常温13000 rmin离心10 min ④转移上清液到新离心管中，加入等体积的预冷的异丙醇混匀，室温静置3~5 min ⑤常温下，10000 rmin 高速离心5 min，弃上清后倒置干燥，加500 L ddH2O溶解 加入2 L RNase10mgmL，37℃水浴1 h ⑥加等体积酚抽提1 次，酚:氯仿:异戊醇25:24:1抽提1 次，氯仿:异戊醇24:1抽提1次 ⑦加2倍体积无水乙醇沉淀DNA，轻轻混匀，20℃过夜 ⑧13000 rmin离心10 min，弃上清，用70%无水乙醇洗涤DNA2次，每次8000 rmin离心10 min 倒置干燥后加入200 L 的TE 缓冲液10 mmolL TrisHCl pH 8.0，1 mmolL EDTA pH 8.0溶解DNA，样品保存于4℃或20℃。
[8] 戴瑞强.华桑遗传多样性分析及核心种质构建[D].镇江:江苏科技大学,2016.
[9] White T J, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and directsequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenctics[M].California: Academic Press,1990选取5 种安徽桑树地方品种样本采自安徽省农业科学院蚕桑研究所桑树品种选育中心。以桑嫩叶为实验材料，品种分别为 金寨九龙桑、皖桑1 、红星5 、皖花桑、7707。
1.2 DNA提取方法
桑树基因组DNA提取采用CTAB法，参照赵卫国[2]的方法，稍加改进。
①取0.1~0.2 g 嫩叶剪碎，在液氮条件下磨碎成粉末，转入经55℃预热的600 L 的CTAB 提取缓冲液0.1 molLTrisHCl，pH 8.0，0.02 molL EDTA，1.4 molLNaCl，2% CTAB，1% PVP，0.04 molL 巯基乙醇中 ②混匀后在65℃水浴裂解30min，期间轻摇数次以混匀，室温冷却，12016 rmin 离心15 min ③加入500 L氯仿:异戊醇24:1，抽提细胞残渣和叶绿体，轻轻颠倒混匀至乳白色 常温13000 rmin离心10 min ④转移上清液到新离心管中，加入等体积的预冷的异丙醇混匀，室温静置3~5 min ⑤常温下，10000 rmin 高速离心5 min，弃上清后倒置干燥，加500 L ddH2O溶解 加入2 L RNase10mgmL，37℃水浴1 h ⑥加等体积酚抽提1 次，酚:氯仿:异戊醇25:24:1抽提1 次，氯仿:异戊醇24:1抽提1次 ⑦加2倍体积无水乙醇沉淀DNA，轻轻混匀，20℃过夜 ⑧13000 rmin离心10 min，弃上清，用70%无水乙醇洗涤DNA2次，每次8000 rmin离心10 min 倒置干燥后加入200 L 的TE 缓冲液10 mmolL TrisHCl pH 8.0，1 mmolL EDTA pH 8.0溶解DNA，样品保存于4℃或20℃。
植物DNA的提取
植物DNA的提取（CTAB法）2010-03-07 14:01:59 来源：易生物实验浏览次数：8813 网友评论0 条CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法：先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。
关键词：植物植物DNA提取CTAB法DNA提取SDS法定磷法紫外光吸收法实验内容采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析和琼脂糖凝胶电泳。
目的要求掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
实验原理1、原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。
核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中,前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。
在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。
因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。
用两倍体积95％乙醇溶液将DNA 钠盐沉淀出来。
如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。
②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。
③用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相，或存在于中间残留物中，蛋白变性后则停留在酚层内。
吸出上面水层，将其注入两倍体积的95％乙醇溶液中，得到白色纤维状DNA 沉淀。
实验六植物基因组DNA提取(与“提取”相关文档)共7张PPT
第3页，共7页。
Note:
1）提取植物基因组DNA的常用方法：CTAB法、SDS法、尿素法等
2）CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（＞）浓度下可溶，并稳定 存在，但在低盐浓度（）下因溶解度降低而沉淀，而此时大部分蛋白质及多 糖等仍溶解于溶液中。经离心沉淀后得到的CTAB-复合物用70%~75%的酒精 浸泡可洗脱掉CTAB。氯仿/异戊醇（24：1）抽提可去除蛋白质、多糖、色素 等，异戊醇或乙醇可用来沉淀DNA。
第7页，共7页。
7）加200~500μL TE溶ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱDNA，溶解后在4℃保存备用。
8）在0.8%的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）上稳压电泳 (电压<5V/cm)检测基因组DNA。
第6页，共7页。
作
业
1 将你提取DNA的电泳图片附在实验结果里，并根据电泳图片分 析你所提的DNA质量如何。
2 DNA提取液中去污剂和螯合剂（如EDTA）的作用？
机械剪切 加经氯2）7离仿06心 /%5异〈℃沉乙戊水2淀醇〉浴后洗（3尽得0涤2m4到量2：i次n的，1减（）C其T每抽少A间次B提温对-8复可m和溶合去i摇n物除）液荡用蛋,去离中7白7心00质D%管%~、N乙27-多A5醇3%次糖的，的，、鼓酒水色风精浴素或浸后等室泡取，温可出异下洗室戊干脱温醇破燥掉冷或DC坏却乙NTAA5醇。；mB可。in用；来沉淀DNA。
实验 六
▪ 植物基因组DNA提取
第1页，共7页。
▪ 一、实验目的
1、掌握提取DNA的方法，该方法提取的DNA可用作PCR模板、限制性酶切反 应和Southern印迹分析。
2、提取银杏叶片总DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析检测所提取DNA的纯 度和完整性。
▪ 二、材料、试剂和仪器
Note:
1）提取植物基因组DNA的常用方法：CTAB法、SDS法、尿素法等
2）CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（＞）浓度下可溶，并稳定 存在，但在低盐浓度（）下因溶解度降低而沉淀，而此时大部分蛋白质及多 糖等仍溶解于溶液中。经离心沉淀后得到的CTAB-复合物用70%~75%的酒精 浸泡可洗脱掉CTAB。氯仿/异戊醇（24：1）抽提可去除蛋白质、多糖、色素 等，异戊醇或乙醇可用来沉淀DNA。
第7页，共7页。
7）加200~500μL TE溶ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱDNA，溶解后在4℃保存备用。
8）在0.8%的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）上稳压电泳 (电压<5V/cm)检测基因组DNA。
第6页，共7页。
作
业
1 将你提取DNA的电泳图片附在实验结果里，并根据电泳图片分 析你所提的DNA质量如何。
2 DNA提取液中去污剂和螯合剂（如EDTA）的作用？
机械剪切 加经氯2）7离仿06心 /%5异〈℃沉乙戊水2淀醇〉浴后洗（3尽得0涤2m4到量2：i次n的，1减（）C其T每抽少A间次B提温对-8复可m和溶合去i摇n物除）液荡用蛋,去离中7白7心00质D%管%~、N乙27-多A5醇3%次糖的，的，、鼓酒水色风精浴素或浸后等室泡取，温可出异下洗室戊干脱温醇破燥掉冷或DC坏却乙NTAA5醇。；mB可。in用；来沉淀DNA。
实验 六
▪ 植物基因组DNA提取
第1页，共7页。
▪ 一、实验目的
1、掌握提取DNA的方法，该方法提取的DNA可用作PCR模板、限制性酶切反 应和Southern印迹分析。
2、提取银杏叶片总DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析检测所提取DNA的纯 度和完整性。
▪ 二、材料、试剂和仪器
合肥工业大学基因工程期末考试题库及答案
合肥工业大学基因工程期末考试题库及答案一、填空题1．基因工程是年代发展起来的遗传学的一个分支学科。
基因工程技术的诞生，使人们从简单地利用现存的生物资源进行诸如发酵、酿酒、制醋和酱油等传统的生物技术时代，走向的时代。
2．随着基因工程技术的诞生和发展，人类可以通过、和等三种主要生产方式，大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白，用于研究或治病。
3．Cohen 等在年构建了第一个有功能的重组DNA 分子。
4．基因工程的两个基本特点是： (1) ，(2) 。
5．基因克隆中三个基本要点是：；和。
6．年，美国斯坦福大学等在上发表了题为：“将新的遗传信息插入SV40 病毒DNA 的生物化学方法：含有λ噬菌体基因和E．coli 半乳糖操纵子的环状SV40 DNA”的论文，标志着基因工程技术的诞生。
这一工作具有划时代的意义，但是他们并没有。
7．克隆基因的主要目的有四：(1) ；(2) ；(3) ； (4) 。
填空题答案1． 70；按人们的需要而定向地改造和创造具有新的遗传性品种。
2．细菌发酵；真核细胞培养；乳腺生物反应器。
3． 1973 4． (1)分子水平上的操作；(2)细胞水平上的表达。
5．克隆基因的类型；受体的选择；载体的选择6． 1972；P．Berg；Proc．Natl．Acad．Sci．USA；证明体外重组的 DNA 分子具有生物学功能7． (1)扩增 DNA； (2)获得基因产物；(3)研究基因表达调控；(4)改良生物的遗传性二、选择题(单选或多选)1．因研究重组DNA 技术而获得诺贝尔奖的科学家是( )(a)A．Komberg (b)W．Gilbert (c)P．Berg (d) B．McClintock2．第一个作为重组DNA 载体的质粒是( )(a) pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl83．第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是( )(a)EcoRI (b)EcoB (c)EcoC (d)EcoRⅡ4．P Berg 构建SV40 二聚体时用了几种不同的酶，其中( )的作用是制造隐蔽的5’端。
最新实验 植物DNA提取及检测
植物总DNA的提取 及琼脂糖凝胶电泳检测
植物基因组 DNA的提取
琼脂糖凝胶电泳检测
一 、实验目的
学习提取和纯化高等植物总 DNA的方法，理解其原理。
二、实验原理
• •
脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) 与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。 在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋 白释放出来。 植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存 在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性 复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和 叶绿体DNA(ctDNA)。
琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
琼脂糖浓度(%)
0.3
线型DNA分子的分离范围 (Kb)
5～60
0.6
0.7 0.9
1～20
0.8～10 0.5～7
1.2
1.5 12.0
0.9～6
0.2～3 0.1～2
三、实验仪器和试剂
仪器
– 电泳仪 – 电泳槽 – 灌胶模具等
•
基本过程 细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸
细胞破碎
①机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法；
②化学试剂法：用SDS处理细胞；
③酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。
DNA提取
• SDS法 SDS 是有效的阴离子去垢剂 , 细胞中 DNA 与蛋 白质之间 常借静电引力或配位键结合 , SDS 能够 破坏这种价键。 • CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜 与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来， 并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。
核酸染色剂
溴化乙锭（EB）
植物基因组 DNA的提取
琼脂糖凝胶电泳检测
一 、实验目的
学习提取和纯化高等植物总 DNA的方法，理解其原理。
二、实验原理
• •
脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) 与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。 在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋 白释放出来。 植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存 在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性 复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和 叶绿体DNA(ctDNA)。
琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
琼脂糖浓度(%)
0.3
线型DNA分子的分离范围 (Kb)
5～60
0.6
0.7 0.9
1～20
0.8～10 0.5～7
1.2
1.5 12.0
0.9～6
0.2～3 0.1～2
三、实验仪器和试剂
仪器
– 电泳仪 – 电泳槽 – 灌胶模具等
•
基本过程 细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸
细胞破碎
①机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法；
②化学试剂法：用SDS处理细胞；
③酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。
DNA提取
• SDS法 SDS 是有效的阴离子去垢剂 , 细胞中 DNA 与蛋 白质之间 常借静电引力或配位键结合 , SDS 能够 破坏这种价键。 • CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜 与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来， 并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。
核酸染色剂
溴化乙锭（EB）
3种木材DNA提取方法比较研究
基金项目：安徽省国际科技合作计划项目（1704e1002226）；安徽省自然科学基金项目（1908085QC111）。 作者简介：余敏（1985—），男，河南信阳人，讲师，研究方向：木材 DNA 识别。 *通讯作者 收稿日期：2021-01-08
6
安徽农学通报，Anhui Agri，Sci，Bull，2021，27（03）
3 种木材 DNA 提取方法比较研究
余 敏 魏宇创 张 浩 刘盛全*
（安徽农业大学林学与园林学院，安徽合肥 230036“；林木材质改良与高效利用”国家林业和草原局重点实验室，安徽合肥 230036）
摘 要：以微凹黄檀木材标本为研究对象，分别采用 BATB 法、PTB 法和 SDS 法对微凹黄檀不同部位木材进行
DNA 提取试验，并扩增 DNA 条形码序列 ITS2、t檀木材
DNA 提取和 DNA 条形码序列扩增的影响。结果表明：采用 BATB 法从微凹黄檀木材心、边材组织中提取的
DNA 浓度以及 DNA 条形码扩增效率均要高于其他 2 种方法，说明 BATB 法更适合从长期存储木材中提取
1 材料与方法
1.1 试验材料 微凹黄檀木材标本来自安徽农业大学木 材标本馆。由于木材组织疏松多孔，运输和储存过程中 易被其他外源植物组织污染，因此在进行木材DNA提取 试验操作之前，需用无菌刀片去除木材表面部分，并将试 样切成小片放置在全自动冷冻研磨仪（Retsch CryoMill） 中研磨成木粉，避免木材组织在研磨过程中因温度过高 造成DNA二次降解。 1.2 试验方法 1.2.1 木材DNA提取 分别采用BATB法、SDS法和PTB 法对微凹黄檀标本心、边材进行提取。BATB法：向500mg 木 粉 中 加 入 4.5mL BoTab buffer、225μL DTT（1mol / L）、 90μL蛋白酶K（20mg/mL），涡旋混匀；55℃水浴5h，期间颠 倒混匀；加入4.5mL氯仿∶异戊醇（24∶1），涡旋混匀；用旋 转混匀仪室温下混匀10min；12000rpm，4℃离心15min；用 5mL枪头小心吸取上层水相到新50mL离心管中，加入等 体积氯仿∶异戊醇（24∶1），上下颠倒混匀；12000r，4℃离心 5min；移取上层水相，加入2.5倍体积的醋酸钠（3mol/mL，
实验8植物组织总DNA的提取
04 结果与数据分析
DNA的检测与鉴定
检测方法
使用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，通过观察DNA在260nm和280nm 处的吸光度值，判断DNA的含量和蛋白质污染程度。
鉴定结果
提取得到的DNA样品在紫外分光光度计下显示出明显的吸收峰，说明成功提取出 了DNA。
DNA质量的评估
完整性评估
02
植物基因组DNA相对较大，由多个重复序列和基因组成。
03
通过破碎植物细胞，释放出细胞核中的DNA，再经过一系列的沉淀、洗涤和纯化 步骤，可以获得较纯的植物基因组DNA。
实验步骤概览
1. 准备实验材料和试剂。 2. 选取新鲜的植物组织，清洗并切成小块。 3. 用液氮或预冷的研钵将植物组织研磨成粉末。
干燥
将洗涤干净的DNA沉淀物 进行干燥处理，以便于后 续的溶解与储存。
DNA的溶解与储存
选择合适的溶解方法
根据实验要求选择适当的溶解方法，如水浴溶解、加热溶 解等。
控制溶解条件
确保溶解过程中使用的温度、时间和溶液浓度等条件适宜， 以避免对DNA造成损伤。
储存与保存
将溶解后的DNA溶液进行分装，并选择适当的储存容器和 条件进行保存，确保DNA的稳定性和长期保存。
实验步骤概览
4. 加入缓冲液和酶混合物，破碎细胞 并释放出细胞核。
6. 将上清液转移至新的离心管中，加 入等体积的酚-氯仿混合液，充分混匀。
5. 通过离心分离出细胞核和细胞碎片。
实验步骤概览
7. 通过离心分离出上层水相和 下层有机相。
8. 将上层水相转移至新的离心 管中，加入等体积的异丙醇，
沉淀DNA。
3
释放细胞核
破碎细胞组织后，通过洗涤、离心等方法将细胞 核内的DNA释放出来。
多种.植物总DNA提取方法及详细步骤
植物总DNA提取一、常用方法改良CTAB法（改良自精编分子生物学实验指南，原蓝猪耳实验方案，拟采用）植物基因工程，王关林，2002 SDS法（植物基因工程，王关林，2002）高盐低pH值法（邹喻萍，植物学报，1994）材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。
材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。
材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。
材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。
试剂：(1)2-巯基乙醇（2-ME）(2)CTAB抽提液(3)CTAB/ NaCl溶液(4)24：1（V/V）氯仿/异戊醇(5)CTAB沉淀液(6)高盐TE缓冲液(7)70％乙醇(8)TE缓冲液试剂：(1)2×CTAB提取缓冲液试剂：(1)提取缓冲液：100mmol/LTris·Cl（pH8.0）、50mmol/LEDTA（pH8.0）、500 mmol/LNaCl、10 mmol/L 2-巯基乙醇（2-ME）(2)10% SDS(3)5mol/L KAC试剂：(3)提取缓冲液：100mmol/LNaAC（pH 4.8）、50 mmol/LEDTA（pH 8.0）、500 mmol/LNaCl、1.4％SDS，此种介质刚好为pH 5.5。
(4) 2.5mol/L KAc（pH 4.8）操作：(1)称取样品0.2g，去除表面的DNA污染，置于研钵中与液氮共研成细粉。
(2)将冻粉转入2ml离心管中，立即加入1000µl（980＋20）预热至65℃的CTAB抽提操作：(1)2ml离心管中加入1ml提取缓冲液，65℃预热。
(2)取0.2g新鲜幼嫩叶片，于液氮中迅速研磨成粉。
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不同植物总DNA的提取及亲缘关系的研究班级：生物技术10-1摘要：核酸的分离纯化是核酸制备及分析的前提和基础，在本实验中我们小组成员将学会和掌握核酸制备的一些基本操作和方法，并通过分光光度法和电泳等实验技术研究核酸的性质，同时掌握用限制性内切酶酶解技术分析不同材料之间亲缘关系的方法。
关键词：核酸提取分光光度法电泳限制性内切酶酶解技术Absract:The nucleic acid separation purification is the premise which and the foundation the calculation prepares and analyzes, our panel members will learn and grasp the nucleic acid preparation in this experiment some elementary operation eos and the method, and through experiment engineering research nucleic acid's and so on spectrophotometric method and electrophoresis nature, simultaneously grasps with the restrictive interior contact enzyme enzymolysis technical analysis different material between the sibship method.Key words: nleic acid extractioucn spectrophotometry electrophoresis Restriction endonuclease enzyme of Enzymatic Hydrolysis technology1.绪论DNA是遗传的物质基础，分离纯化DNA是研究基因结构与功能的首要前提。
细胞内DNA是与蛋白质结合存在的。
在提取DNA的过程中必须将其中的蛋白质降解除去，同时需要尽可能保证其DNA分子的完整性，因此，必须在温和的条件下进行提取，注意避免核酸内切菌引起DNA的降解。
1.1植物组织中制备基因组DNA一般有下列几个策略：1.1.1细胞壁的破碎。
通常将植物组织放在研钵中与液氯或干冰粉末(用于冰时先将干冰碾成粉末)。
1.1.2细胞膜的破坏常用去污剂(如SDS或CTAB)。
1.1.3保护DNA免受内源核随菌的破坏，这包括多方面的措施。
去污剂的加入和EDTA 的存在都能破坏或抑制酶的活性，因EDTA是种整合剂，它能结合大多数核酸酶的辅因子Mg2+。
此外，用氮仿和苯酚乳化州A提取液时，同时也使蛋白质变性，分离蛋白质和DNA。
1.1.4尽量减少DNA的断裂。
即使溶液的振荡也会使DNA断裂，在操作中不特别小心的话，获得的DNA是50一100 kb。
1.1.5研磨植物组织时尽量保持在冰冻状态(掖氯或于冰中)，直至与提取经冲浪混合，以避免DNA的降解。
1.1.6高等植物材料往往含有多糖，面多糖常常是某些限制酶或连接菌的抑制剂，用CTAB的核酸提取法可得到纯的高相对分子质量的DNA，它利用核随和多糖在cTAB存在时溶解度不同面分离。
1.1.7在用异丙醉或乙醇沉淀植物组织DNA时，能观察到白色的纫纤丝及纤维团，若用钩子将所有的DNA都轻轻绕在钩子上取出并洗涤，这样得到的DNA与用离心沉淀法取得的DNA相比，前者的纯度更高些。
不同植物，不同组织，不同年龄的材料制备所得DNA 的产率也不同。
植物幼苗或嫩叶制备DNA容易且产率高。
1.2通常，利用质粒的大小和限制性酶切位点来鉴定质粒。
具体做法是：首先，选用一种或两种限制性核酸内切酶切割质粒；然后，进行琼脂糖凝胶电泳；最后，根据质粒的电泳迁移率和酶切图谱对质粒进行鉴定。
1.2.1限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某一特定核昔酸序列，并由此切割DNA双链结构的特殊核酸内切酶。
1.2.2琼脂糖凝胶电泳是鉴定质粒，特别是重组DNA分子的重要技术手段，同时，也被广泛用来分离、纯化特定的DNA片段。
琼脂糖凝胶电泳的分辨率取决于凝胶的浓度，浓度越高，凝胶的空隙越小，其分辨率也就越高；反之，浓度降低，空隙就增大，其分辨率也就随之降低。
1.2.3核酸分子带有许多负电荷，当它被放置在电场中时，会向正极移动。
在一定电场强度下，DNA分子移率的大小取决于其本身的大小和构型。
分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子更容易通过凝胶介质，故其迁移率较大，跑在前面。
所提取的质粒往往有三种构型：超螺旋、开环和线性。
电泳时，由于三者的紧密程度不同，所以，它们的迁移率并不相同。
一般情况下，具有超螺旋构型的质粒，由于其结构最为紧密，所以它的迁移率也就最大，跑在最前面；其次为具有线性构型的质粒；具有开环构型的质粒跑在最后。
质粒经限制性核酸内切酶切割后，其构型均为线性。
2．方法2.1实验仪器与试剂主要仪器器材：研钵、高速离心机、紫外分光光度计、水浴锅、微量加样器、电泳仪、紫外透射反射分析仪、试管、烧杯、试剂瓶、冰箱。
主要试剂：(1)提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(pH值为8.0);20mmol/L EDTA；1.4mo1／L氯化钠；2％CTAB。
(2)TE缓冲液：10 mmol／L Tris—HCl(pH值为8.0);1mmo1／L EDTA。
(3)氯仿：异戊醇(24：1)。
(4)异丙醇。
(5)70％乙醇。
(6)TAE电泳缓冲液；40mmol/L Tris；20mmol/L HAC;lmmol/L EDTA。
（7）上样缓冲液：3.72克EDTA，20克Ficoll，0.25克溴酚蓝，溶解后定容至100ml 以上试剂均需用蒸馏水配制；缓冲液高压灭菌后于4摄氏度保存。
琉基乙醇在其他溶液组分灭菌后，使用之前加入。
2.2操作步骤2.2.1植物组织中DNA的分离(1)取新鲜植物嫩叶组织或芽1g，用蒸馏水冲洗干净后，置液氮中冷冻20一30 min，将冻结组织放入研钵中加液氮悬浮，研磨使其充分粉碎成细粉末。
倒入离心管中。
(2)加入4mL 60℃保温的提取缓冲液，50微升硫基乙醇，恒温水浴锅中60℃保温45min，其问缓慢颠倒4次。
(3)取出后，放入冰浴中，加400 微升0.015mol/l 乙酸钾，颠倒混匀，放置20 min。
不时摇动。
(4)4℃，8000 r／min离心15min，吸出含DNA的水相，放人另一离心管中。
(5)加入等体积的氯仿：异戊醇溶液，缓慢倒转混匀呈乳状，冰浴中放置20min。
(6)4℃，1000r／min离心15min。
上清吸入另一离心管中。
(7)加入0．6倍体积的预冷异丙醇，20℃放置10 min。
(8)用玻璃棒轻轻搅动两相界面，挑出白色沉淀，70％乙醇冲洗两次。
(9)风干，加入200微升TE溶解。
2.2.2 DNA合量和纯度检测(1)取两只0．5cm厚的石英比色杯。
加入3mL TE。
(2)一只作为对照杯，一只再加入7．5微升DNA样品作为检测管。
(3)读取OD280，OD260值和比值。
计算样品含量和纯度。
DNA含量(微升／mL)＝OD260／0.02×稀释倍数2.2.3限制性内切酶性质研究表2-33-1 （单位：uL）小青菜质粒DNA 10x酶缓冲液限制性内切酶双蒸水有酶切实验组 6 2 1 11无酶切对照组 6 2 —12混匀，37摄氏度水浴1—2小时。
日2.2.4 1.0%琼脂糖凝胶板制备(1)用配套挡板将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或水平工作台面上，将样品槽模板插进长边上的凹槽内（距一边约1.5cm），梳齿底边与托盘表面保持0.5-1mm的间隙，安置好后保持静止状态。
（2）称取0.3克琼脂糖至于小锥形瓶中，加入30mlTAE稀释缓冲液，在电炉上加热融化，一定要煮沸两次排尽气泡。
（3）待琼脂糖冷却至约60摄氏度后，滴一滴gold view,然后将琼脂糖溶液在靠近挡板一侧连续地倒入托盘内，使凝胶缓慢而连续地展开直至托盘形成一层3mm厚均匀胶层。
胶内不要存有气泡，室温下静置约20分钟。
（4）待凝胶完全后，用小滴管在梳齿附近加入少量TAE稀释液润湿凝胶，用双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板，则在胶板上形成相互隔开的样品槽。
（5）取下封边的挡板，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台，倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm，要防止样品槽内窝存气泡，可以用微量注射器挑除。
2.2.5 加样用微量注射器将经酶切的样品液和未经酶切的样品液（要加2微升的酶反应终止液）分别加入到凝胶板的不同加样槽内，每个槽加样不超过15微升。
加样时针头穿过缓冲液小心靠近加样槽底部，但不要损坏胶槽，然后缓慢将样品推进槽内，让其集中于槽底部。
2.2.6 电泳5V／cm电泳，当染料带移动到距离凝胶前约1cm时，停止电泳。
2.2.7 观察小心取出凝胶至托盘上，将胶板推置预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长为245nm紫外灯下进行观察。
DNA存在的位置成绿色荧光，可观察到清晰条带。
3．结果3.1OD280（小青菜）=0.007OD260（小青菜）=0.0093.2 DNA条带观察如下图.4．讨论OD260（小青菜）/OD280（小青菜）=1.29 <1.8由结果得知，4.1小青菜DNA样品属于蛋白质污染。
分析原因：a.由于设备问题，没有在低温（4摄氏度）下进行低温离心，影响了离心效果；b.在加异丙醇之后，会存在一层蛋白质沉淀；c.在将DNA沉淀挑出的过程中，会带上部分蛋白质沉淀。
d.试验中没有使用高效的蛋白质去除剂。
4.2稀释倍数：3000／7.5 =400DNA含量[小青菜](微升／mL)＝OD260／0.02×稀释倍数=0.009／0.02×400=180(微升／mL)分析原因：a.操作问题，没有捣碎充分b.由于设备问题，没有在低温（4摄氏度）下进行低温离心，会引起DNA降解c.在加入异丙醇之后，摇晃过于剧烈，使得DNA降解。
d.在提取离心过程中，次数过多，将DNA洗去。
e. 缓冲液PH值不合适。
4.3 DNA条带模糊。
分析原因：a.在操作过程中由于试剂和仪器以及操作方法的问题，使得DNA降解，导致DNA分解成很多碎片，不能够集中跑电泳。
b.试验中使用的是gold view显色剂，显色效果较EB差。
c. 提取不干净，自配缓冲液PH不合适。
d. 与内切酶的反应时间过短（用了2个小时）5．参考资料石庆华.生物化学实验指导[M].北京：中国农业大学出版社，20069：162-168.邓天龙.生物化学实验[M].四川：电子科技大学出版社，20069:43-45。