土壤生态学
曹志平胡菊编
2007年10月24日
资源环境学院生态系
实验一、培养计数法测定土壤原生动物数量--------------------1 实验二、土壤中线虫的分离方法及杀死固定--------------------4 实验三、土壤螨类的分离------------------------------------6 实验四、氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳
实验一、培养计数法测定土壤原生动物数量
目前国际上通常采用的有直接计数法和间接计数法两种。直接计数法（direct counting method），顾名思义，就是对土壤中的原生动物不进行培养，而是取一定量的新鲜土壤，加一定量的水或土壤浸出液，摇匀后即进行镜检，得到土壤原生动物丰度（单位重量土壤中的原生动物个数）。间接记数法主要是培养记数法。鉴于土壤这一特定环境，土壤原生动物种类都能形成胞囊，以渡过土壤干旱环境。风干后土壤原生动物形成的胞囊，用培养的方法诱导脱开胞囊，以推知其种类和数量分布。在培养过程中一切器皿、培养基均经高压灭菌，接种时也应避免尘埃落入，以确保培养不受污染。本实验主要采用Singh（1995）和Stout（1962）的“3级10倍”环式稀释法。
仪器、设备和材料
烘箱、培养箱、灭菌锅、培养箱、镊子、玻璃环、三角瓶、烧杯等。
方法与步骤
1土样采集
土壤原生动物很难直接从土壤、水体中采集，要通过室内培养。土壤原生动物在土壤环境干旱时，都能形成胞囊，以等待土壤水分来临后再脱胞囊而活动。所以土壤原生动物的采集，实际上是采集土壤样品，带回实验室进行培养而取得标本。
由于原生动物在土壤中的分布是不均匀的，因此在一个采样区内，需采集10个采样点。用圆形采样器取土样，把土样放入铝盒带回室内。在培养之前，需测定土样含水量。
2 稀释土样
2克风干土样（如有条件，也可以直接用湿土）加18毫升无菌水，充分振荡，可用超声波仪粉碎土壤，使之与水充分混合，这时的稀释度为10；然后用定量吸管吸取2毫升102的土壤悬浮液，加入18毫升无菌水，充分摇匀，此时稀释度为103。依此法逐级稀释，即可得到103、104、105、106……的稀释液。根据原生动物的丰富度选择土壤的稀释度，但每一定量土样均要选择连续的3个稀释度，，即“3级10倍”之意（图1）。
3培养基制备
0.5克氯化钠加1.2克琼脂加98毫升蒸馏水（如用量较多，可按此比例增加），搅拌后在高压灭菌锅中加热灭菌，然后趁热到入培养皿，在凝固之前插入5个内径为1.8厘米、高为0.6厘米的玻璃环。每个土样需6个培养皿30个玻璃环。
4接种、培养和镜检
取其中的连续3级悬浮液，摇匀后每级稀释液各取1ml接种于各自的玻璃杯内，即1、2号培养皿的10个玻璃杯内各滴入1ml第一级稀释液，同样3、4号和5、6号培养皿的10个玻璃杯内分别滴入第二级和第三级稀释液（第一、二、三级稀释液的稀释度是多少，则取决于研究的土壤中原生动物数目的多寡，如采用104-106稀释度系列，则第一级稀释液为104，第二级为105，第三级为106），置于光照培养箱25℃以下培养(图1)。分别在第4、7、11天时在低倍镜下观察每个环中有无原生动物，按肉足虫、鞭毛虫、纤毛虫分别记录。低倍镜下可分清此三大类，但无法鉴定种类。可在实验结束时，再吸出在高倍镜或油镜下鉴定种类。
图1 土壤原生动物定量培养法的稀释和接种示意图
5 结果统计
根据未出现环数，查Stout“3级10倍稀释法”（表1）原生动物密度换算表得知每克土壤中的原生动物数量，即密度。例如，已知鞭毛虫在30个环中有5环中未出现，则查表得λ=69.5，若稀释度为104-106，则鞭毛虫的密度为695000个/克土壤。肉足虫和纤毛虫的密度也同此法求得，三大类密度之和即为总的原生动物密度。这是根据微生物数量统计法的原理从没有原生动物和土壤稀释度求出最或然数（MPN），以此推断每克风干土壤中原生动物数量。将表上查得的数量乘以土壤湿度，即为每克湿土中原生动物数量。
表1 “3级10倍”环式稀释法原生动物密度换算表（Stout，1962）
实验二、土壤中线虫的分离方法及杀死固定
分离线虫方法多种多样，主要根据分离线虫的种类和数量、寄主植物种类、标本的固有属性、采集时间和所分离线虫的用途而定。本文介绍传统的贝曼漏斗法和经改良后的淘洗—过筛—离心法。
（一）贝曼漏斗法
贝曼漏斗法是Baermann于1917年提出来。其本原理是：线虫是喜水动物，遇水便会从土壤或植物组织内游出，同时由于地心引力及线虫自身的重量，便会下沉至漏斗的管内集中。这种方法仅限分离活动性的蠕虫型线虫，对死虫、不活动的线虫和虫态（如胞囊线虫和根结线虫的雌虫）则是无效的。
仪器、设备和材料
贝曼漏斗：试验装置如图2。常用的是直径为8-10厘米的玻璃漏斗，漏斗管连在一段乳胶管，以止水夹（弹簧夹）控制胶管的开闭，漏斗放在或铁架台上或自制的木制漏斗架的圆环内。
图2 贝曼漏斗法（Baermann funnel）分离线虫示意图(刘维志，1995)
方法与步骤
取土样或含线虫的植物材料（如根系）切成大约0.5厘米-1厘米长的小段，用四层纱布或二层高级卫生纸（棉质）包住土样或根样，轻轻放入盛水的漏斗内，令水漫过、浸透，如水量不足，轻轻加水，防止冲出泥浆，经48小时，用空烧杯接在漏斗的胶管内，轻轻松开止水夹，从漏斗流出水，内含大量线虫。关闭胶管，向漏斗轻轻补充清水，可以再次收集线
虫。
（二）淘洗—过筛—离心法
淘洗—过筛—离心法是在几种最基本的分离方法上，为适应大量快速分离线虫的要求而改进的一种方法。其基本原理是根据虫体大小及线虫的密度比水轻或与水的密度接近，线虫在淘洗过程中，可浮在水面或悬浮在水中。在过筛时，依虫体大小可以在不同筛目上收集线虫。过筛时，往往在密筛（如325目）上留有很多泥浆。为了进一步把线虫从泥浆中分离出来，可利用比重差异，应用不同浓度的蔗糖溶液或其他制剂（密度比水大），结合离心的方法，使收集到的线虫更加纯净。
仪器、设备和材料
1.仪器、设备
40、60、325目筛子各一，低速离心机，100ml或大于100ml离心管，天平，250ml烧杯，脸盆，洗瓶，喷头，试管，洗干净的青霉素瓶。
2.材料
TAF固定液(三乙醇胺—福尔马林固定液)：吸取2ml 40%甲醛，7ml 三乙醇胺溶于91ml 蒸馏水。
蔗糖溶液：454克蔗糖溶于1000ml水中(密度1.18g/cm3,浓度为38.5%)。
方法与步骤
1 线虫标本的采集。
挖取植株根系，去掉5cm表土，在根围5-20cm深度取带根土样500cm3左右，放在大塑料袋中，在小塑料袋中放入标签，注明采集寄主、地点、采集人，将小塑料袋放入大塑料袋中，封口后带回实验室。
2 分离过程。
淘洗程序：从40目、60目和325目筛子上过筛，40目筛内收集根系（有根结线虫），编号后存入塑料袋内，60目筛内收集胞囊，亦存入塑料袋内，把325目筛子里的泥浆（内含线虫）洗入烧杯（150ml左右）。
离心程序：
(1) 将烧杯里的泥浆倒入离心管（250ml），称重平衡
(2) 将离心管放入离心机中，1000转/分，离心4-5分钟。
(3) 倾去上清液，加入蔗糖液（38.5%），称重离心，15秒钟，1000转/分离心
(4) 用烧杯收集上清液，加水稀释，防止蔗糖液渗透压过高虫体破裂。
(5) 烧杯中的上清液在325目筛子过筛（筛子倾斜），将325目筛上的线冲洗到烧杯里，再转入试管里将试管垂直放置，过夜（24-48小时，夏天时间短，春、秋季时间长）饥饿，把上清液用长吸管吸掉，试管底部为线虫。
3 杀死.。
向试管加入热水到60℃，将线虫杀死，15分钟。
4固定。
(1) 将下部虫液用吸管吸入青霉素瓶，加入固定液。
(2) 固定一周后，再换洗固定液，永久保存。固定两周后才能进行鉴定。
