DNA合成常见问题解答

分子实验中核算DNA提取常见问题及分析一、基因组DNA提取常见问题分析1．样品材料老化或反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C低温保存，以免DNA 降解。

2．样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放：动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方式协助破壁。

3．样品量过多导致细胞裂解不充分：加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。

不同来源样品的加样量不同。

4．DNA吸附不充分：如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。

5．DNA洗脱不适当：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH 值在7.0-8.5之间。

洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。

同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。

洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率,加大DNA产量。

二、提取的基因组DNA有降解，如何解决?1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。

2．未能有效抑制内源核酸酶作用：某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。

DNA合成常见问题解答Q：如何保存引物或探针产品？A：干粉的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年左右,4℃可以保存6个月左右；溶解好的引物在-20℃下可以保存半年左右,4℃可以保存1个月左右。

荧光标记的探针请避光保存。

Q：引物在常温下运输，会降解吗？A：不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。

而一般的运输时间通常都在1-3天左右，所以您收到的引物不会降解。

Q：如何计算Oligo DNA溶液的浓度？A：基本参数及计算公式：MW(分子量)=(A碱基数x313.21)+(G碱基数x329.21)+(C碱基数x289.18)+(T碱基数x304.2)+(Mix碱基数x324.5)+(I碱基数x314.19)+(U碱基数x290.17)-61.96Mix为兼并碱基；I为2'脱氧尿嘧啶；U为2'脱氧尿嘧啶兼并碱基代码：R=(A/g)、M=(A/C)、W=(A/T)、S=(C/g)、Y=(C/T)、K=(g/T)、H=(A/T/C)、B=(g/T/C)、D=(g/A/T)、V=(A/C/g)、N=(A/C/g/T)平均分子量：Oligo DNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5，则一条Oligo DNA的平均分子量=碱基数x324.5.1 OD的Oligo DNA约为33ug举例：您得到一管标为2 OD 20merOligo DNA，无兼并碱基、I和U，序列为：CTGGAGAGAGGTTTGTCTGG分子量=(3x313.21)+(9x329.21)+(2x289.18)+(6x304.2)+(0x324.5)+(0x314.19)+(0x290.17)-61.96=6244.10质量数=2x33=66μg摩尔数=66/6244.10=0.011μmol=11nmole若加双蒸水200μl溶解，则浓度为11nmole/200μl=0.055μMQ：如何测定引物的OD值？A：用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。

DNA合成常见问题解答1.DNA合成粗产物中含有什么杂质DNA合成仪合成的粗产物经过浓氨水氨解以后，其中除了含有所需的目的DNA片段(n)以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段(n-1,n-2,…)以及脱保护基团产生的铵盐。

需要通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。

2.如何进行合成产物的纯化目前公认和大多采用的DNA粗产物后处理方式有4种：A) C18柱脱盐，这是一种活性炭柱子，有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。

但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。

实际上，它是一种脱盐的作用。

这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5' 端一个或两个或多个碱基的产物，却一般不会对普通PCR反应产生影响。

但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别，以免后患无穷。

B) OPC柱纯化，OPC柱中装有对Dmt具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5'端最后一个碱基上的Dmt，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有Dmt 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有Dmt的片段吸附能力弱，被洗脱。

然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去Dmt基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA这种方法的优点是快速，简易。

但是其专一性吸附Dmt能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。

特别是对长于25 碱基以上的片段纯化效果不好。

C) HPLC纯化，这是国外厂家常常使用的办法。

它是依据不同大小的片段带有的净电荷多少来分离产物的。

合成粗产物中不同长度的DNA片段决定了它带有不同的净电荷，较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢。

先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。

它的优点是自动化程度高、省人力；缺点是纯化量小、不能纯化长片段（对于长于40 碱基的片段，无法纯化）。

D）PAGE屯化，几乎所有专业书籍上介绍的最佳纯化方法。

第十六章DNA的生物合成一、名词解释1.冈崎片段：DNA复制中，滞后链的合成是先合成许多小片段，再连接成一条链，这些小片段起初是由冈崎发现的，所以称为冈崎片段。

2.半保留复制：DNA的复制时，每一子代DNA分子由一条亲代链和一条新合成的链组成，这种复制方式称为半保留复制。

3.半不连续复制：DNA复制中，一条链是连续合成的，为前导链，另一条链先合成岗崎片断，再连接成新链，合成是不连续的，为滞后链，这种复制方式称为半不连续复制。

4．光复活：受紫外线照射而引起损伤的细胞用可见光照射，大部分损伤细胞可以恢复，这种修复过程叫做光复活。

二、填充题1．DNA复制的方向是从__5’__端到___3’__端展开。

2.__ DNA聚合酶Ⅰ___和DNA连接酶_的缺乏可导致大肠杆菌体内冈崎片段的堆积。

3．体内DNA复制主要使用_RNA___作为引物，而在体外进行PCR扩增时使用_人工合成的DNA____作为引物。

4．使用_胰蛋白___酶可将大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ水解成大小两个片段，其中大片段被称为__Klenow___酶，它保留__3’→5’核酸外切酶__和_DNA聚合__酶的活性，小片段则保留了_5’→_3’核酸外切_____酶的活性。

5．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是一种多功能酶，其具有DNA聚合酶、 _3’→5’核酸外切酶和 5’→_3’核酸外切酶的活性。

6．维持DNA复制的高度忠实性的机制主要有_DNA聚合酶的高度选择性__、__DNA聚合酶的自我校对___和__错配修复___。

7．DNA连接酶催化的连接反应需要能量，大肠杆菌由NAD+ 供能，T4噬菌体由ATP供能，动物细胞由 ATP 供能。

8.以RNA为模板合成DNA称为反转录，由反转录酶催化。

9. DNA复制时前导链的合成是连续的，其合成方向与复制叉移动方向相同；随后链的合成是不连续的，其合成方向与复制叉移动方向相反。

10．细菌的环状DNA通常在一个复制位点开始复制，而真核生物染色体中的线形DNA可以在多位点起始复制。

DNA重组常见问题TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些？参考见解： TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。

NEB公司的酶的活性很高，切出两条小带可能是因为出现星活性，可以试试把酶量减半。

NEB的酶很多都是克隆的，所以纯度比较高。

应用磁性微球提取人全血基因组DNA，将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应，应用Taq1酶，但发现酶切后产生的是smier片断，即切碎的状态。

不知原因是什么？在做这类实验时，一般是将PCR产物进行酶切，这与实验结果有联系吗？是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增，才能应用酶切？参考见解：1. 为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.关于文库建立园内资料很多.lyz703lyz战友感兴趣的话可以自己搜索下.2. 电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点,由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.3. 一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一,在了解了被切DNA上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切(Alu1酶)后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了,回收还是达不到浓度(大约只有0.06微克\微升),又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。

请教该怎么办？参考见解：回收酶切产物浓度低的原因可能是：苯酚/氯仿抽提时损失太多。

说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次，这样经过四次抽提DNA损失得非常多，解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水，然后再抽提，损失会减少很多；另外乙醇沉淀时可以延长，低温沉淀会提高得率；还有用80％乙醇洗涤沉淀弃上清时，要轻轻用移液枪吸出，防止将沉淀随上清倒出。

引物合成常见问题Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

(1)去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，获得游离的5'- OH；(2)耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-OH发生耦合反应；(3)封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；(4)氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。

Q2.引物合成如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。

常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。

断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。

纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。

常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。

储存：分装抽干。

Q3.合成的引物5’端是否有磷酸化？合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。

如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5’端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5’或3’端进行磷酸化，需要另外收费。

Q4.需要什么级别的引物？根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。

应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增< 60base HEPD>60 base PAGE诊断PCR扩增< 40base HEPD, PAGEDNA测序20base左右HEPD亚克隆，点突变等根据实验要求定HEPD, PAGE，HPLC基因构建（全基因合成）根据实验要求定HEPD PAGE反义核酸根据实验要求定HEPD PAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLCQ5.需要合成多少OD数？根据实验目的确定。

细胞生物学中的DNA合成DNA是构成生物遗传信息的核心分子，它通过DNA合成来实现遗传信息的分离和复制。

DNA合成是细胞生物学中的一个重要过程，本文将从DNA的结构、DNA合成的步骤以及DNA合成时可能遇到的问题等方面展开，探讨DNA合成的相关知识。

一、DNA的结构DNA（脱氧核糖核酸）是由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳟氨酸）、脱氧核糖糖份和磷酸组成的双螺旋结构分子。

其中，碱基是遗传信息的基本单位，脱氧核糖糖份是连接碱基的背骨，磷酸是连接脱氧核糖糖份的“线”。

DNA的双螺旋结构由两个互相螺旋的链组成，每个链上的碱基通过氢键连接起来，而两个链则通过碱基之间的氢键相互连接。

两个链中的碱基按照一定规则配对，腺嘌呤配对胸腺嘧啶，鸟嘌呤配对鳟氨酸，这种配对关系称为碱基互补配对。

由于碱基互补配对的存在，当一条链被提取后，可以通过其碱基的互补配对五定位恢复另一条链的序列。

二、DNA合成的步骤DNA合成是细胞增殖时的基本过程，首先我们需要了解DNA合成的步骤。

DNA的合成是由DNA聚合酶（DNA polymerase）酶催化的，它使新的碱基按照一定序列加入到父链的3'-OH端。

DNA合成始于DNA解旋酶（helicase）对DNA的双链鱼片进行解旋，形成两个单链鱼片模板，然后单链鱼片模板上的DNA聚合酶开始工作。

在DNA聚合过程中，DNA聚合酶主要有三个步骤：装载、延长和校对。

1. 装载：DNA聚合酶需要与助酶一起结合，才能进行DNA合成。

助酶通常被称为PCNA（增殖细胞核抗原），它们形成一个叫做滑动环（sliding clamp）的结构，可以夹住DNA，使得DNA合成酶在DNA的长度方向上能够连续工作。

DNA合成酶和PCNA结合后，就可以开始进行DNA聚合的第二个步骤——延长。

2. 延长：DNA合成酶的聚合反应是以父链作为模板进行的，将新进来的核苷酸加入到父链的3'端。

这里需要解释一下，DNA是单向生长的，也就是新的碱基只能在链的3'端加入，而不能在5'端进行。

D N A合成常见问题解答1．DNA合成粗产物中含有什么杂质DNA合成仪合成的粗产物经过浓氨水氨解以后;其中除了含有所需的目的DNA片段n以外;还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段n-1;n-2;…以及脱保护基团产生的铵盐..需要通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分..2．如何进行合成产物的纯化目前公认和大多采用的DNA粗产物后处理方式有4种：AC18柱脱盐;这是一种活性炭柱子;有人称其为简易反相柱;它对DNA有特异性的吸附;可以被有机溶解洗脱;但不会被水洗脱;所以能有效地去除盐分..但是它不能有效去除比目的片段短的小片段..实际上;它是一种脱盐的作用..这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5'端一个或两个或多个碱基的产物;却一般不会对普通PCR反应产生影响..但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别;以免后患无穷..BOPC柱纯化;OPC柱中装有对Dmt具有亲和力的树脂;合成DNA片段时保留5'端最后一个碱基上的Dmt;所有合成产物吸附在OPC柱上以后;用稀的有机溶剂洗柱;带有Dmt的片段吸附能力强;不易被洗脱;不带有Dmt的片段吸附能力弱;被洗脱..然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去Dmt基团;再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA..这种方法的优点是快速;简易..但是其专一性吸附Dmt能力有限;不免仍然有短片段带入的可能;而且负载量小..特别是对长于25碱基以上的片段纯化效果不好..CHPLC纯化;这是国外厂家常常使用的办法..它是依据不同大小的片段带有的净电荷多少来分离产物的..合成粗产物中不同长度的DNA片段决定了它带有不同的净电荷;较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢..先将粗产物检测主峰位置;再增加加样量;回收主峰位置的部分..它的优点是自动化程度高、省人力；缺点是纯化量小、不能纯化长片段对于长于40碱基的片段;无法纯化..DPAGE纯化;几乎所有专业书籍上介绍的最佳纯化方法..它是依据DNA片段在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时的迁移率不同来分离大小片段的..由于各分子所带电荷和大小不同;综合影响其在凝胶中的迁移速度;大片段迁移得慢;经过一定时间的电泳;大小片段会分开;然后停止电泳;剥离凝胶;置于荧光TLC板上在紫外灯下切割目的条带;浸泡碎胶;并从泡胶的盐溶液中回收目的DNA..优点是纯化效果很好、尤其是纯化长链效果更好、而且是可以直观看见DNA片段合成情况的质控环节..通常认为的缺点是实验室水平的PAGE纯化实验步骤多费人工、电泳及后处理过程样品损失量大、电泳装置局限或电泳时间如果不够会影响纯化效果..但这些缺点完全可以克服..我们通过扩大规模流水作业使实验过程便于掌握和节省人力；在粗样品中加入尿素饱和液增加样品比重减少电泳上样的损失；改用C18柱回收产物;使得回收效率大大提高；通过特制电泳装置;增加凝胶厚度和长度来增加负载量和分离效果等等..所以我们一直使用PAGE纯化方式保证合成产物的纯度..为了保障您的后续实验;请您选用PAGE纯化的产品;特别是现在DNA合成不同纯化方式的价格相差不多的情况下..3．如何测定引物的OD值用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量..请注意紫外分光光度计的使用;测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-0.8之间..DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后;取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度;即为所测体积的OD值;进而可以计算出母液的OD值..举例：您拿到一管干粉的DNA;用1ml水溶解成母液;取该母液50微升稀释成1ml并在1ml 标准比色杯中测定的光密度为0.25;说明该50微升中含有0.25OD的DNA;也即说明原来1ml 母液中含有5OD的DNA..4．如何检测引物的纯度实验室方便的作法是用PAGE方法..使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳..取0.2-0.5OD的引物;用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和;上样前加热变性95oC;2mins..加入尿素的目的一是变性;二是增加样品比重;容易加样..600V电压进行电泳;一定时间后约2-3小时;剥胶;用荧光TLC板在紫外灯下检测带型;在主带之下没有杂带;说明纯度是好的..有时由于变性不充分;主带之上可能会有条带;乃是引物二级结构条带..5．怎样按照使用浓度溶解引物记住几个参数：1OD引物干粉约为33微克；碱基的平均分子量为324.5；引物的分子量=碱基数x碱基的平均分子量；引物的摩尔数=质量数/引物分子量举例：如果您拿到一管标明为2OD的20碱基的引物;分子量=20x324.5=6490质量数=2x33=66μg摩尔数=66/6490=0.010μmol=10nmol若您需要溶解为10μM=10pmol/μl的溶液;只需加1mlddH2O充分溶解即可..同时请您注意：真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部;开启瓶盖时小心不要丢失；请加入足量的水充分振荡溶解..6．如何保存引物我们提供的干粉DNA从有机溶剂中干燥出来;无菌;无核酸酶..可以室温或-20oC密闭长期保存；溶解以后的DNA最好保存在-20oC;溶解引物的水的PH要求大于7;并且无菌..带有荧光标记的引物请注意避光保存..7．已经溶解的引物;为什么原先使用正常;而过一段时间再使用就不好了如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶;会使引物降解..我们发现不少实验室用的双蒸水PH<6;请您也查查..使用时没有充分解冻振荡混合;液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确..8．为什么公司可以提供较多产物与所有化学制备反应一样;最终产物的多少取决于起始反应物的量以及合成效率..我们使用的仪器和生产规程使我们可以调整合成的起始量;而且合成的高效率使我们可以得到较多粗产物..我们的改良的PAGE纯化与C18柱回收结合的方法使得我们得到的最终产物能够满足您的要求..9．为什么说用EB染色合成DNA片段来定量是不正确的通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量如质粒DNA;是因为EB可以嵌合到双链DNA 中..而合成的单链DNA;由于碱基组成不同;形成二级结构的可能性不同;EB的染色程度也会不同;比如OligodT等不形成二级结构;EB根本无法染色..所以不要用EB染色的方法来定量;而用紫外分光光度计检测..同样道理;用EB染色来照片不适合所有引物..10．PCR扩增没有成功;怀疑是引物不好;怎么办PCR扩增不成功的因素很多;需要您耐心地分析;最好在实验时设置对照来判定原因..如果您怀疑引物的问题;请您首先测定您溶解的引物的OD值;看实验时加入的引物量是否正确..如果量是正常的;请您告诉博亚公司您的引物编号;我们会复查留存样品..如不明原因;我们免费为您重新合成一次..如果仍然不能扩增;请您查找其它原因..也可以将引物和模板寄给我们帮助您进行PCR..11．引物不纯会造成什么后果引物不纯可能会导致：1非特异性扩增；2无法用预先设计在引物5'端酶切位点的酶切开;特别是没有保护碱基的引物；3用于测序出现双峰或乱峰..12．普通合成的DNA片段5'末端是磷酸基团吗普通合成的DNA片段5'末端与3'末端都是羟基;可直接用于PCR..如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化;或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化;需要另外收费参见价目表..13．PCR产物经过克隆以后测序发现引物区与合成序列不相符合;怎么办我们认为这多数是PCR过程和克隆过程中引入的错误..遇到这种情况;请您：1可以要求我们重新免费合成引物..2重新挑取克隆测序;会有找到正确克隆的可能；3要求我们免费为您做点突变予以改正..14．公司可以合成多长的序列由于用户和基因拼接的要求;我们很好地合成过不少100碱基左右长度的长片段..因为我们可以提高起始合成数量、加大合成用的试剂量、用PAGE纯化..如果您的实验需要;我们愿意接受110碱基以下的订单..15．我订购了两条可以退火的引物;您可以帮助退火吗可以..您也可以自己退火..用退火缓冲液10mMTris;pH7.5-8.0;50mMNaCl;1mMEDTA溶解引物;将要退火的引物等摩尔数混合;总体积不要超过500微升;加热到95oC2mins;然后缓慢冷却至室温低于30oC即可..退火的产物可以放在4oC待用..16．公司帮助设计引物吗我们可以帮助您设计引物;需要您按照要求提供具体资料..但是由于您提供资料的准确信以及我们水平的限制;我们不能保证每一个设计的引物一定工作..我们不承担设计引物失败的责任..您如果信任我们;我们愿意帮助设计..17．各种标记的荧光染料的名称、吸收波长和发射波长、可见光中颜色是怎样的。

载体构建中常见问题及解决方法重组质粒构建是常用的分子生物学手段，是研究相关分子及蛋白功能的基础，是生化分子实验中最基本的方法，但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。

下面我总结一下自己的经验，以期能为虫友们提供借鉴，希望多少给大家一下借鉴。

所涉及内容如下：1)克隆基因的酶切位点问题2)目的片段的扩增3) 载体酶切的问题4) 连接片段浓度比的问题5）菌液的提取6）酶切鉴定7）表达鉴定一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。

首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。

然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。

双酶切时尽量选择酶切温度相同，buffer一致，双酶切效率高的两个内切酶，二者最好是您实验室常用的酶。

2、保护碱基数目的问题。

在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。

但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。

这种忽视可能会大大影响后续的实验进展。

参考常用的酶切位点保护碱基，选择酶切时间短且酶切效率高的碱基数。

注释：1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。

2．切割率：正确识别并酶切的效率3. 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基二目的片段的扩增目的片段扩增失败的原因和可采取措施：1）无条带：引物设计错误，找人帮忙看看引物设计是否合理；退火温度不合适，设置梯度，选择最合适的退火温度；2）条带不单一：引物不特异，适当增长或引物序列长度；3）出现引物二聚体，适当提高退火温度或者重新设计引物。

三载体酶切的问题酶切效率直接影响后续实验的成功率，酶切过程的注意事项：1）酶切质粒浓度和纯度要好2）酶切温度和时间，如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在用另一个酶切，时间最好过夜切四连接片段浓度比的问题1）连接比例的确定：上一步酶切产物回收后，用琼脂糖凝胶电泳比较载体和目的片段的亮度，确定体积比，一般载体：片段=1:3~1:5；2）连接时间和温度：现在很多连接酶都比较高效了，室温2个小时就可以了，如果后续实验检测阳性克隆较少，可采用16℃过夜连接提高连接成功率；3）未避免后续菌落PCR的假阳性情况，建议连接转化时做对照组：酶切后的载体做自连接对照，如果对照组与实验组长出的克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，建议先不要做后续验证，重新从酶切开始，增加酶量及酶切时间、适当减少所切载体的量、改变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可继续进行后续验证。

影响dna合成的常见因素试题影响DNA合成的常见因素有很多，包括但不限于以下几个方面：
1. 碱基供应，DNA合成的过程中需要足够的碱基供应，包括腺
嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。

如果缺
乏任何一种碱基，都会影响DNA的合成过程。

2. 酶的活性，DNA合成需要多种酶的参与，如DNA聚合酶、DNA连接酶等。

这些酶的活性受到细胞内环境的影响，如pH值、温
度等，如果这些条件不适宜，会影响酶的活性，进而影响DNA的合成。

3. 能量供应，DNA合成需要消耗大量的能量，主要依赖于细胞
内的三磷酸腺苷（ATP）。

如果细胞内ATP供应不足，会限制DNA的
合成过程。

4. 细胞周期，在细胞分裂期间，DNA合成是一个重要的活动。

因此，细胞周期的调控对DNA合成起着重要的影响。

5. 毒物和放射线，一些化学物质和放射线能够直接损伤DNA分
子，影响DNA的合成过程。

6. 遗传因素，个体的遗传背景也会影响DNA合成的效率和准确性。

综上所述，影响DNA合成的因素是多方面的，包括基础物质供应、酶的活性、能量供应、细胞周期、外部环境等多个方面。

对这些因素的综合考虑和研究，有助于我们更好地理解DNA合成的机制和调控。

DNA结构与功能常见问题总结DNA（脱氧核糖核酸）是构成生物遗传信息的核酸分子。

在科学研究和生物学领域中，人们对DNA的结构和功能有着广泛的兴趣和研究。

本文将总结一些关于DNA结构与功能的常见问题，并对其进行解答。

1. DNA是什么？它的结构是怎样的？DNA是生物体内负责存储遗传信息的分子。

其结构由两根互补的链组成，形成了双螺旋结构。

每一条链由糖基和磷酸基团交替排列而成，两条链通过碱基间的氢键相互连接。

这些碱基包括腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。

2. DNA的功能是什么？DNA的主要功能是存储和传递遗传信息。

它包含了生物体的所有遗传指令，可以决定细胞的形态、结构和功能。

DNA通过转录过程生成RNA，然后通过翻译过程将RNA转化为蛋白质。

蛋白质是细胞的主要组成部分之一，也是控制细胞代谢和生物化学反应的主要调节因子。

3. DNA复制是什么意思？DNA复制是指在细胞分裂过程中产生两条完全相同的DNA分子的过程。

复制过程发生在S期（DNA合成期），在细胞分裂之前完成。

复制过程由酶（例如DNA聚合酶）和其他蛋白质协同完成，确保DNA的准确复制。

4. DNA突变是什么？有哪些原因导致DNA突变？DNA突变是指DNA序列发生的任何改变。

突变可以由多种因素引起，包括自然突变、化学物质、辐射以及基因突变。

自然突变是指基因组中随机发生的变异，可能由错误的DNA复制或DNA损伤修复过程中的错误引起。

化学物质和辐射可以引起DNA的物理或化学损害，导致碱基的改变或DNA链的断裂。

基因突变是指由于某些基因的改变导致的突变，可能会影响蛋白质的产生和功能。

5. DNA修复是什么？有哪些常见的DNA修复机制？DNA修复是细胞利用不同的机制修复受损的DNA。

常见的DNA 修复机制包括：a. 直接修复：某些损伤可以通过直接修复机制修复，例如光反应损伤。

b. 错配修复：当DNA复制出现错误配对时，错配修复机制能够检测和修复这些错误。

基因合成常见问题与解答1、金开瑞可以合成一些难度较大的基因，如高GC、重复序列吗？答：完全可以！我们拥有领先的基因合成技术平台，目前已经成功合成多例高GC，低GC含量，正向或反向重复序列等。

同时，我们会仔细评估您的每一条难度序列，向您提供专业的技术支持，为您的项目量身打造专业的实验方案。

2、除了合成每个碱基对的费用外，有没有其他额外的费用？答：可能会有。

我们会根据序列分析结果和基因合成收费标准，为您提供合理的报价。

合成常规基因，我们将按碱基单价和序列长度作为收费标准，给予最终报价；合成难度基因，我们会给出难度报告且列出除基因合成以外的收费明细，同时给予最终报价。

3、金开瑞提供密码子优化服务吗？密码子优化对基因表达有怎样的影响？答：我们拥有专业的非常专业的密码子优化软件，向您提供免费的密码子优化服务。

密码子优化平台拥有上千种优化宿主和选择参数，我们可以根据您的不同需求，选择不同的宿主和参数进行优化。

主要参数如下：1）密码子偏爱性；2）GC含量；3）mRNA二级结构；4）用户自定义参数选择；5）重复序列（正向重复，反向重复，回文序列）；6）酶切位点（删除或插入）；7）poly结构。

4、金开瑞提供的载体的是什么？我们免费提供pUC19-Amp以及改造的pUC19-Kana载体，无须拼接的全基因将被克隆至pUC19-Amp载体；需要拼接的基因将被克隆至改造的pUC19-Kana载体，所有基因均通过酶切进行QC鉴定，DNA测序验证确保每一条序列的正确性。

5、金开瑞提供的改造的pUC19-Kana载体是什么样的结构？我们以pUC19-Amp为骨架，将Amp抗性换成了Kana抗性，去除了MCS和MCS上下游的部分序列。

6、金开瑞最终交付的产品和发货文件包括什么？我们提供：1）5-10 µg含有目的片段的高纯度冻干质粒DNA和含有重组质粒的穿刺菌。

2）发货文件主要包括如下内容；标准序列；测序结果；QC报告。

基因工程技术实验中常见问题的解答及解决思路基因工程技术在生物科学领域中发挥着重要的作用。

然而，这项技术在实验过程中常常面临一些问题。

本文将回答基因工程技术实验中常见问题并提供相应的解决思路。

1. 实验中基因测序结果不准确或存在错误。

基因测序是基因工程技术实验的重要步骤之一。

若结果不准确或存在错误，可能会导致后续实验的失败。

出现这种情况时，可以采取以下措施：1）重新校正仪器：检查测序仪器及相关试剂的质量，确保仪器的准确性和稳定性。

2）检查操作流程：仔细检查实验操作流程是否按照标准程序进行，排除操作失误。

3）重复实验：确保实验结果的准确性，可以进行重复实验，验证测序结果的一致性。

2. 载体转染效率低或不稳定。

载体转染是将目标基因导入宿主细胞中的重要步骤。

若转染效率低或不稳定，可能会影响后续实验的进行。

以下是解决思路：1）优化转染条件：调整转染条件，包括转染试剂、转染时间和细胞密度等因素，优化转染效果。

2）选择合适的载体：确保选择的载体具有高转染效率和稳定性，避免低效率和不稳定性的问题。

3）筛选转染细胞：对转染后的细胞进行筛选，选择表达目标基因较高且稳定的细胞株。

3. 基因编辑效率低或无法完全实现预期修饰。

基因编辑是基因工程技术中的重要环节。

如果编辑效率低或无法完全实现预期修饰，可能会导致结果不准确或无法达到预期目标。

以下是解决思路：1）优化编辑工具：选择适当的基因编辑工具，如CRISPR-Cas9系统，并进行技术优化，提高编辑效率。

2）优化编辑条件：调整编辑条件，例如优化转染系统、优化编辑剂量和编辑时间等，提高编辑效率。

3）优化细胞系选择：选择易于编辑的细胞系，如某些细胞系对编辑更加敏感，对特定基因修饰效率更高。

4. 目标基因表达量低或不稳定。

目标基因表达是基因工程技术实验的重要结果之一。

若表达量低或不稳定，可能会影响实验效果和结果解读。

以下是解决思路：1）优化启动子：选择适当的启动子，确保其能够驱动目标基因的高表达，并确保启动子的稳定性。

分子生物学简答题汇总
本文档汇总了一些分子生物学的简答题，旨在帮助读者更好地理解和复分子生物学的基础知识。

以下是一些常见的问题及其简洁的答案：
1. DNA是什么？DNA是什么？
DNA（脱氧核糖核酸）是一种双链螺旋结构的分子，它携带了细胞内遗传信息的蓝图。

2. DNA的组成单位是什么？DNA的组成单位是什么？
DNA的组成单位是核苷酸，每个核苷酸由一个磷酸、一个脱氧核糖和一个氮碱基组成。

3. DNA复制是什么过程？DNA复制是什么过程？
DNA复制是指在细胞分裂过程中，DNA双链被解开，然后通过配对规则合成两个全新的DNA分子的过程。

4. 什么是基因？什么是基因？
基因是DNA上的一段特定序列，它携带了编码特定蛋白质的信息。

5. 什么是转录？什么是转录？
转录是指在细胞中，DNA的信息被转录成RNA的过程。

RNA 分子可以携带基因的信息进入细胞质。

6. 什么是翻译？什么是翻译？
翻译是指在细胞中，RNA的信息被翻译成蛋白质的过程。

蛋白质是细胞中许多生化反应和功能的关键组成部分。

7. RNA和DNA有什么区别？RNA和DNA有什么区别？
DNA是双链螺旋结构，而RNA是单链结构。

此外，DNA中的碱基酸配对规则是A对T，C对G，而RNA中是A对U，C对G。

8. 什么是突变？什么是突变？
突变是指DNA序列的改变，可能会导致基因表达的变化或功能异常。

以上是一些分子生物学的简洁答案，希望对您的学习和复习有所帮助。

如果您有更多问题或需要深入了解，请随时告诉我。

DNA合成常见问题解答Q1. 如何保存寡核苷酸？通常，寡核苷酸应该-20℃保存，该温度下能稳定保存一年以上。

寡核苷酸在溶液中较为稳定，但易被污染的核酸酶降解，因此我们建议应干燥储存。

若要以溶液形式储存，最好将其分装在几管中分别保存，反复冻融会使寡核苷酸降解。

另外，酸性条件下，DNA会因为脱嘌呤作用而降解；碱性条件会使磷酸二酯键水解断裂。

Q2. 如何重悬寡核苷酸？为便于长期保存，我们建议使用TE缓冲液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTApH8.0)，而不用无菌水来溶解寡核苷酸。

重悬后，寡核苷酸应该在-20癈保存以长期使用。

寡核苷酸在无菌水中很难溶解，加一定量的NaOH有助于寡核苷酸在水中溶解。

Q3. 如果寡核苷酸在室温中放置超过一星期，还可以使用吗？脱水的寡核苷酸是长期稳定的。

即使在溶液状态寡核苷酸也相当稳定，通常情况(没有引入使寡核苷酸降解的污染物)即使在室温中放置超过一星期也能使用。

Q4. 荧光染料标记的寡核苷酸，在储存和使用过程中必须特殊处理吗？如果暴露在光线下，荧光染料标记的寡核苷酸比未标记的寡核苷酸更易降解，荧光强度会逐渐降低。

为了保持其荧光效能，荧光染料标记的核苷酸应避光-20℃保存。

由于Cy3和Cy5在pH大于9时易被降解，所以Cy3和Cy5修饰Q5. 如何定量合成的寡核苷酸?合成的寡核苷酸的量非常少，不能直接称重来定量。

通常通过测量紫外吸光度值(OD值)来定量。

Q6. 如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸？寡核苷酸的量经常用OD值来描述。

1个OD值是体积1ml寡核苷酸溶液，在内径1cm的比色杯中的吸光度值，约为33 mg寡核苷酸，序列不同的寡核苷酸OD值有所不同。

因为在260nm处单个碱基的吸光度值是已知的，所以序列已知的寡核苷酸的浓度就可以测定。

dT: 8.8 ml/µmoldG: 11.7 ml/µmoldC: 7.3 ml/µmoldA: 15.4 ml/µmol对于一段寡核苷酸，它的吸光度等于每个碱基的数目乘以它的吸光系数，然后将4种碱基的结果加起来就是整个寡核苷酸的吸光度。

DNARNA合成常见问题解答处理和储存1. 如何储存寡核苷酸?2. 如何重悬寡核苷酸?3. 假如寡核苷酸在室温中放置超过一星期，还能够使用吗?4. 荧光染料标记的寡核苷酸，在储存和使用过程中必须专门处理吗?纯化和浓缩5. 如何定量合成的寡核苷酸?6. 如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸?7. 如一个18个碱基的寡核苷酸包括3个dG,4个dC,5个dA和6个dT, OD 值是0.7，那么它的量是多少?8. 如何运算寡核苷酸的分子量?9. 如何测定寡核苷酸的质量?10. 如何测定寡核苷酸的质量?11. 如何测定合成的寡核苷酸的Tm值?12. 什么缘故Bioneer提供的Tm值和我们的Tm值不同?13. 用什么方法调整寡核苷酸的浓度?14. 单位换算表合成与订购15. 如何合成寡核苷酸?16. 标准寡核苷酸结构17. Bioneer能合成的最长的寡核苷酸是多长?18. 当我预订50nmol的寡核苷酸，产品却不足50 nmol，什么缘故?19. 能合成出高百分比“G”的寡核苷酸吗?20. 能提供寡核糖核酸(RNA)合成吗?21. 合成的寡核苷酸在3' 或5'位有磷酸基吗?22. 简并引物及通用引物是什么?纯化方法23. 如何样纯化合成的寡核苷酸?24. 用于芯片分析的60 mer寡核苷酸如何被纯化呢?修饰寡核苷酸25. 修饰寡核苷酸26. 作为反义脱氧寡核苷酸的硫磷酰化寡核苷酸实验27. 如何样制备双链DNA?Q1. 如何储存寡核苷酸？↑TOP 通常，寡核苷酸应该-20℃储存，该温度下能稳固储存一年以上。

寡核苷酸在溶液中较为稳固，但易被污染的核酸酶降解，因此我们建议应干燥储存。

若要以溶液形式储存，最好将其分装在几管中分别储存，反复冻融会使寡核苷酸降解。

另外，酸性条件下，DNA会因为脱嘌呤作用而降解；碱性条件会使磷酸二酯键水解断裂。

Q2. 如何重悬寡核苷酸？↑TOP 为便于长期储存，我们建议使用TE缓冲液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA, pH8.0)，而不用无菌水来溶解寡核苷酸。

一些制作模型的材料在长时间使用或暴露 于特定环境中可能会发生颜色变化或褪色 ，导致模型失去原有的视觉效果。这不仅 影响模型的外观，还可能影响使用者对 DNA双螺旋结构的认知。
比例失调
总结词
模型中的各部分比例与实际DNA双螺 旋结构比例不匹配。
详细描述
在制作模型时，由于尺寸控制不精确 或对DNA双螺旋结构理解不足，可能 导致模型的比例失调。这种失调可能 使使用者对DNA双螺旋结构的理解产 生偏差，影响学习效果。
04
应对策略与解决方案
材料优化
总结词
选择合适的材料是制作DNA双螺旋结构模型的关键，直接影响到模型的精度和稳定性 。
详细描述
在制作过程中，应选择高精度、高稳定性的材料，如塑料、金属或木质等，以确保模型 的精确度和持久性。同时，要确保所选材料具有良好的可塑性和耐久性，以便能够准确
地呈现DNA双螺旋结构的细节。
详细描述
在制作过程中，需要仔细研究DNA的 结构特点，并尽可能在模型中呈现这 些特点。例如，A与T配对，G与C配对 的关系需要在模型中明显地展示出来 。
颜色与原型的匹配度
总结词
颜色的准确性对于模型的逼真度和认知度都很重要，特别是 对于DNA这样的生物分子模型。
详细描述
为了使模型的颜色与实际DNA结构相匹配，可以使用天然的 或人工合成的染色剂，根据实际DNA的颜色进行染色。此外 ，还可以使用不同颜色的标记物来区分不同的组成部分，如 碱基、磷酸和糖环。
完成调整后，要将模型保存在干燥、阴凉的地方，避免阳 光直射和潮湿环境。在使用过程中，要小心轻放，避免损 坏模型。
THANKS
谢谢您的观看
选择合适的材料
根据制作目的和预算，选择合适的材 料。例如，塑料、纸板、泡沫塑料等 都是常见的材料，但每种材料都有其 优缺点，需要综合考虑。