外源性硫化氢对心肺复苏后脑线粒体的作用和其机制

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作者签名：导师签名：年月日年月日目录中文摘要---------------------------------------------------------------------------1 英文摘要---------------------------------------------------------------------------3 英文缩写注解-----------------------------------------------------------------------5前言---------------------------------------------------------------------------------7 材料与方法------------------------------------------------------------------------91 试剂和仪器------------------------------------------------------------------92 药品的配制-----------------------------------------------------------------103 实验方法---------------------------------------------------------------------11 结果---------------------------------------------------------------------------------19 讨论---------------------------------------------------------------------------------28 结论---------------------------------------------------------------------------------32 参考文献---------------------------------------------------------------------------33 综述---------------------------------------------------------------------------------40 硕士期间发表的论文-----------------------------------------------------------54 致谢--------------------------------------------------------------------------------55硫化氢对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究生：刘剑锋指导教师：汤永红教授中文摘要目的：观察外源性硫化氢（hydrogen sulfide, H2S）对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用并探讨其可能的机制。

复旦大学上海医学院朱依纯教授领衔的科研团队，联合复旦大学基础医学院、药学院和生物医学研究院等，经长达8年的科研攻关，终于发现硫化氢“受体”及其分子开关，一举揭开体内硫化氢“保护作用”形成的新机制，对我国研制治疗心血管疾病和代谢综合征自主知识产权的新药有重要意义。

近日，该成果已在线发表在权威期刊《抗氧化与还原信号》（《Antioxidants & Redox Signaling》）上，引起世界关注。

硫化氢是生命起源前就存在于地球的古老分子，其气味像臭鸡蛋，是一种有刺激性气味的有毒气体，同时又是人体氨基酸代谢的废物，如大量吸入可抑制人体神经系统，甚至导致死亡。

但近年来医学界逐渐认识到，由人体内一种特殊的酶催化后自身产生的硫化氢则是一种有益气体，如适量产生和“激活”可有效调节心血管活动，促进缺血区血管新生，保护缺血心肌，调控心肌离子通道，对有效预防心脏病、老年性痴呆、抗炎等有重要作用。

然而，硫化氢作为一种气体小分子，它在人体内是通过何种途径、何种机制产生如此众多和重要的“保护”作用的，一直是世界医学界的“难解之谜”。

为揭开这一谜团，朱依纯率领博士后陶蓓蓓、蔡文杰博士等研究人员展开攻关。

首先，为了进一步探索心肌缺血等严重缺血性疾病的非手术治疗方法，课题组创建了硫化氢促血管新生模型，通过筛选体内大量在硫化氢作用下发生变化的信号分子，终于找到了硫化氢的一个“受体”，即蛋白质VEGFR2.进而发现，VEGFR2受体中有一个医学界至今未知的名叫“Cys1024-Cys1045二硫键”的新分子结构，而Cys1024-Cys1045二硫键正是一个控制VEGFR2受体的“保险开关”。

也就是说，只有通过硫化氢才能打开这一开关，当该开关打开后，VEGFR2受体才能被激活，激活后的受体才能表现出天然的活性。

但是，硫化氢是“凭什么本事”打开这“保险开关”的呢？课题组更进一步研究发现，原来Cys1024-Cys1045二硫键是人体内专起抑制作用的活跃分子结构，而硫化氢则利用它的“活跃”和它分子开关的外层电子轨道的相互作用，完成了自己的“使命”。

气体信号分子硫化氢的心脏保护作用研究进展【摘要】气体信号分子家族由一氧化氮、一氧化碳和硫化氢等内源性气体小分子组成，发挥重要的生物学效应。

已经证实硫化氢在多个系统中有重要的生理调节作用，本文重点综述其在心血管系统中的心脏保护作用，包括抑制心脏缺血再灌注损伤、负性调节心脏代谢消耗和抗心脏氧化应激等。

【关键词】气体；硫化氢；心脏1 内源性气体信号分子——硫化氢硫化氢（hydrogensulfide，H2S）是一种无色，有很强的臭鸡蛋气味的有毒气体。

人类认识并研究其毒性作用已有300多年的历史，然而H2S的生理作用直到上世纪90年代才被逐渐认识。

H2S在生物体内可由内源性酶催化生成，受体内代谢途径的调控，生理浓度下有特定生理功能，已经证实其在神经、心血管、内分泌、消化等多个系统中具有特定的生理调节作用。

H2S的体内浓度远远低于其产生毒性的浓度，它和一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）一并称为气体信号分子，组成气体信号分子家族［1，2］。

2 硫化氢在体内的合成调节H2S是一种弱酸，在体内1/3以气体H2S形式存在，2/3以硫氢化钠（NaHS）形式存在，H2S与NaHS存在动态平衡，这样既保证了H2S在体内的稳定，又不改变内环境的pH值。

H2S在脂溶性溶剂中的溶解度为水中的5倍，故可自由通过细胞膜［1］。

内源性H2S的生成可以通过酶促反应途径也可以通过非酶促途径。

在哺乳动物体内主要是酶促反应途径，以L－半胱氨酸为底物，由磷酸吡哆醛－5′－磷酸依赖性酶，主要是胱硫醚γ裂解酶（cystathionineγlyase，CSE）和胱硫醚β合成酶（cystathionineβsynthase，CBS）催化而成，其两个终产物是铵和丙酮酸盐。

研究发现CSE和CBS这两种酶的分布具有组织特异性，在心血管系统中CBS表达很少［3］，CBS是主要的硫化氢合成酶。

研究发现心脏高表达CSE，高于主动脉，而低于脑组织，其内源性H2S的生成量为（50.2±2.1）μmol/mg蛋白，生成率为（18.64±4.49）nmol/min·g蛋白，表明心脏也是内源性H2S的主要生成来源［4］，另外心梗组织中CSE也有表达［5］。

外源性硫化氢对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响及机制探讨摘要：硫化氢（H2S）是一种具有强烈活性的气体信号分子，在多种生理和病理过程中发挥重要作用。

本研究旨在探讨外源性硫化氢对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响及其可能的作用机制。

通过大鼠脊髓缺血再灌注模型，观察不同浓度硫化氢处理后对脊髓功能的影响，同时探讨其可能的作用机制。

结果显示，外源性硫化氢可以显著改善大鼠脊髓缺血再灌注损伤，提高神经功能恢复，减少炎症反应，降低氧化应激水平，并减少细胞凋亡。

上述结果表明，外源性硫化氢可能通过抑制炎症反应和氧化应激、减少细胞凋亡等途径保护脊髓免受缺血再灌注损伤。

关键词：硫化氢；脊髓；缺血再灌注；损伤；机制二、材料与方法1. 实验动物使用健康雄性SD大鼠，体重250-300g，购自实验动物中心。

2. 建立大鼠脊髓缺血再灌注模型将大鼠随机均分为三组：假手术组（正常对照组）、缺血再灌注组（I/R组）、硫化氢处理组（H2S组）。

对I/R组和H2S组大鼠进行脊髓缺血再灌注操作：将大鼠固定在手术台上，取下肩胛下动脉-静脉，结扎5分钟后放开，再次结扎5分钟后放开即完成术前处理。

H2S组在再灌注时给予H2S供体NaHS（10μmol/kg）腹腔注射。

假手术组则进行同样的手术操作但不进行结扎。

3. 观察指标记录每组大鼠术前、术后1h、6h、24h的脊髓功能恢复情况：包括腿活动情况、疼痛反应等。

同时取脊髓组织标本，进行HE染色观察脊髓组织形态学变化，同时测定脊髓组织中炎性细胞浸润情况和氧化应激水平。

4. 统计分析使用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据以x¯±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

三、结果1. H2S改善大鼠脊髓功能对比发现，在缺血再灌注后，H2S组大鼠腿活动轻微减弱，疼痛反应明显减弱，明显优于I/R组（P < 0.05）。

2. H2S减少炎症反应HE染色结果显示，I/R组大鼠脊髓组织有明显炎性细胞浸润，而H2S组炎性细胞浸润明显减少。

硫化氢在心搏骤停后的脑保护作用心搏骤停是最危急的临床疾病，发生率和病死率很高。

随着院前急救水平和生命支持技术的进步，心搏骤停患者的自主循环恢复率有了明显的提高，但是出院存活率并未得到明显的改善。

其主要原因在于心搏骤停后机体经历了完全的缺血，导致全身多个脏器功能严重受损，自主循环恢复后机体又发生了严重的再灌注损伤，进一步加重了脏器功能损害，这一病理生理过程被命名为心搏骤停后综合征[1]。

大脑是体内对缺血缺氧最敏感的脏器，相当一部分心搏骤停患者在自主循环恢复后会遗留永久性的神经功能障碍。

因此，减轻心搏骤停后的脑损伤，最大程度地恢复脑功能一直是复苏领域研究的热点。

尽管关于改善心搏骤停后脑功能的研究很多，但目前公认的有效方法只有亚低温治疗[2]。

传统观点认为硫化氢（hydRogen sulfide，H2S）是一种剧毒气体，随着研究的深入，研究人员发现哺乳动物体内存在H2S及其合成酶的表达，并发挥着重要的生理作用。

目前认为H2S是继一氧化氮和一氧化碳之后机体内存在的第三种气体信号分子[3]。

已有的研究证实了H2S对多个脏器的缺血-再灌注损伤具有保护作用[4]。

由于大脑是心搏骤停后受损最严重的脏器，因此，研究人员对于H2S能否减轻心搏骤停后大脑的缺血性损伤，改善脑功能产生了浓厚的兴趣。

近年来国内外关于H2S在心搏骤停后脑保护作用的研究逐渐增多，并取得了一些进展。

1 H2S的理化性质，合成和代谢途径H2S是一种无色、有臭鸡蛋味的气体，分子质量为34，076，相对空气密度1，19，易溶于水和乙醇。

H2S的脂溶性比水溶性高5倍，能够自由透过细胞膜[5]。

内源性H2S的合成底物主要为含硫氨基酸，如半胱氨酸和甲硫氨酸。

有多种酶参与了内源性H2S的合成，其中最重要的两种酶是胱硫醚-β-合酶（cystathionine β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CSE）。

硫化氢中毒机理简介硫化氢（H2S）是一种有毒气体，它具有剧烈的毒性，当被人体吸入后，会对呼吸系统、神经系统和心血管系统造成严重伤害。

本文将详细探讨硫化氢中毒的机理。

一、硫化氢的来源与危害1.硫化氢的来源硫化氢主要由以下几种途径产生：•化学工业过程中的硫化物反应•石油开采与炼油过程中的含硫气体释放•生物体内的代谢产物2.硫化氢的危害硫化氢是一种有颜色、有刺激气味的气体。

高浓度的硫化氢能够迅速引起以下危害：•对呼吸系统的刺激，导致呼吸困难、喉头水肿等•对神经系统的毒性，引起头痛、晕眩、昏迷等•对心血管系统的损害，导致心律不齐、心肌缺血等二、硫化氢中毒的机理1.硫化氢与呼吸系统的作用机制硫化氢进入呼吸系统后，会发生以下作用：•气道刺激：硫化氢激活了气道感受器，引起咳嗽、呼吸急促等症状。

•气道阻塞：硫化氢导致气道黏膜水肿，引起气道阻塞，严重时可能导致窒息。

•气体交换受阻：硫化氢占据了肺泡表面积，阻碍了氧气和二氧化碳的交换。

这导致了组织缺氧和二氧化碳潴留。

2.硫化氢与神经系统的作用机制硫化氢对神经系统的影响主要包括以下方面：•气体扩散：硫化氢能穿过血脑屏障，直接作用于中枢神经系统。

•神经递质的影响：硫化氢能抑制乙酰胆碱酯酶的活性，增加乙酰胆碱在突触间隙中的浓度，进而引起神经递质紊乱。

•细胞损伤：硫化氢导致细胞内钙离子的增加，进而导致细胞内氧化应激，最终导致细胞损伤和神经元死亡。

3.硫化氢与心血管系统的作用机制硫化氢对心血管系统的影响主要表现在以下几个方面：•促进血管松弛：硫化氢能够提高一氧化氮的产生，从而促进血管松弛。

•影响心肌功能：硫化氢能够抑制心肌细胞的收缩，导致心肌功能受损。

•引起心律不齐：硫化氢影响了心室肌和窦房结的电活动，可能导致心律不齐。

三、硫化氢中毒的临床表现硫化氢中毒的临床表现与暴露浓度、暴露时间和个体体质有关。

以下是硫化氢中毒的一般症状： 1. 低浓度暴露： - 呼吸道刺激症状：咳嗽、喉痛等。

硫化氢对兔心搏骤停复苏后神经功能的影响目的观察硫化氢（H2S）对兔心肺复苏后早期NSE、S100B以及海马神经元凋亡的影响。

方法25只日本大耳白兔随机（随机数字法）分为3组：假手术组（S组）、心搏骤停组（CA组）和H2S处理组（H2S组）。

兔吸入5%氟烷麻醉后，气管切开，右股静脉置管用于给药，右颈动脉穿刺置管用于血压监测和采血。

CA组和H2S组夹闭家兔气管导管8 min制备心搏骤停模型，并分别在恢复自主循环后吸入30% O2或体积分数为80×10—6 H2S。

于夹闭气管导管前（基础值）及恢复自主循环后30 min、60 min采动脉血检测血浆中神经元特异性烯醇化酶（neuron—specific enolase，NSE）和S100B的质量浓度。

恢复自主循环后60 min处死家兔，取脑后分离海马固定于4%多聚甲醛中，待做组织病理学检查。

计量资料以均数±标准差（x±s ）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用SNK— q 检验，以P 0.05），CA组和H2S组家兔的窒息时间、心肺复苏时间、肾上腺素用量差异无统计学意义（P > 0.05）。

见表1。

2.2 各组家兔血浆中NSE和S100B质量浓度与S组比较，CA组和H2S组家兔ROSC后30 min和60 min时NSE和S100B 的质量浓度均显著升高（P <0.05）；与CA组比较，S100B质量浓度于ROSC后60 min显著降低（P <0.05）。

见表2。

2.3 各组家兔海马CA1区存活神经元及活化型caspase—3阳性神经元与S组比较，CA组和H2S组家兔ROSC后60 min时海马CA1区存活神经元数目明显减少（P <0.05），活化型caspase—3阳性神经元明显增多（P <0.05）；与CA组比较，H2S组海马CA1区存活神经元数目增多（P <0.05），活化型caspase—3阳性神经元明显减少（P <0.05）。

H2S后处理对兔CPR后脑氧代谢和脑糖代谢的影响
的开题报告
标题：H2S后处理对兔CPR后脑氧代谢和脑糖代谢的影响
背景：在心脏停跳之后进行心肺复苏（CPR）是目前治疗心脏骤停的主要手段，但CPR本身会导致全身缺血缺氧，特别是脑缺氧缺血，由此产生的一系列生物化学反应和病理生理变化严重影响到患者的预后。

而硫化氢（H2S）是一种重要的内源性气体信使分子，能够发挥抗缺血缺氧的生理作用，因此H2S的后处理在CPR后的心脏保护方面具有良好的临床前景。

但目前对于H2S后处理对CPR后脑氧代谢和脑糖代谢的影响还未有明确的研究结果。

目的：本研究旨在探究H2S后处理对兔CPR后脑氧代谢和脑糖代谢的影响，为H2S后处理在临床上的应用提供实验依据。

方法：选取健康成年家兔，随机将其分为H2S后处理组和对照组。

在建立兔心肺复苏模型后，对H2S后处理组使用硫化氢后处理，对照组则不施加H2S。

在CPR后分别在两组兔子的脑组织中作氧分压、氧气消耗量、糖代谢、ATP含量等指标的测试，并比较两组结果的差异。

预期结果：我们认为，使用H2S后处理能够减轻CPR后兔脑缺氧缺血的状况，从而改善脑氧代谢状态，并进一步提高脑组织中的ATP含量以及糖代谢能力。

如果实验结果和我们的预期结果一致，这将为H2S后处理在CPR后脑保护方面的应用提供实验基础。

结论：本研究预计可以说明H2S后处理在改善CPR后兔脑缺氧缺血状态、提高脑氧代谢能力以及提高糖代谢能力方面具有实验意义。

这些结果将为H2S后处理在CPR后的心脏保护和脑保护方面提供实验依据。

气体信号分子硫化氢的心脏保护作用研究进展【摘要】气体信号分子家族由一氧化氮、一氧化碳和硫化氢等内源性气体小分子组成，发挥重要的生物学效应。

已经证实硫化氢在多个系统中有重要的生理调节作用，本文重点综述其在心血管系统中的心脏保护作用，包括抑制心脏缺血再灌注损伤、负性调节心脏代谢消耗和抗心脏氧化应激等。

【关键词】气体；硫化氢；心脏1 内源性气体信号分子——硫化氢硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是一种无色，有很强的臭鸡蛋气味的有毒气体。

人类认识并研究其毒性作用已有300 多年的历史，然而H2S的生理作用直到上世纪90年代才被逐渐认识。

H2S在生物体内可由内源性酶催化生成，受体内代谢途径的调控，生理浓度下有特定生理功能，已经证实其在神经、心血管、内分泌、消化等多个系统中具有特定的生理调节作用。

H2S的体内浓度远远低于其产生毒性的浓度，它和一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）一并称为气体信号分子，组成气体信号分子家族［1，2］。

2 硫化氢在体内的合成调节H2S 是一种弱酸，在体内1/3 以气体H2S形式存在，2/3以硫氢化钠（NaHS）形式存在，H2S与NaHS 存在动态平衡，这样既保证了H2S 在体内的稳定，又不改变内环境的pH 值。

H2S在脂溶性溶剂中的溶解度为水中的5 倍，故可自由通过细胞膜［1］。

内源性H2S的生成可以通过酶促反应途径也可以通过非酶促途径。

在哺乳动物体内主要是酶促反应途径，以L－半胱氨酸为底物，由磷酸吡哆醛－5′－磷酸依赖性酶，主要是胱硫醚γ裂解酶（cystathionineγlyase，CSE）和胱硫醚β合成酶（cystathionine βsynthase，CBS）催化而成，其两个终产物是铵和丙酮酸盐。

研究发现CSE和CBS 这两种酶的分布具有组织特异性，在心血管系统中CBS表达很少［3］，CBS是主要的硫化氢合成酶。

研究发现心脏高表达CSE，高于主动脉，而低于脑组织，其内源性H2S的生成量为（50.2±2.1）μmol/mg蛋白，生成率为（18.64±4.49）nmol/min·g蛋白，表明心脏也是内源性H2S的主要生成来源［4］，另外心梗组织中CSE也有表达［5］。

硫化氢对心血管系统疾病影响的研究进展硫化氢（H2S）是新近确认的，除一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）以外的第三种具有血管活性的气体信号分子。

H2S一直作为一种毒性气体被环境医学和毒理学所重视。

然而，最近的研究显示，内源性H2S能通过调节血管舒缩、炎症反应、细胞凋亡等多种方式发挥生理作用，并参与中枢神经系统、呼吸系统等多系统疾病的发生和发展。

更重要的是，目前的证据表明，H2S对各种心血管疾病的发病具有调节作用，如高血压，肺动脉高压和心肌损伤等。

本文将就H2S 的心血管系统的作用进行综述。

标签：硫化氢；作用机制；心血管系统硫化氢（H2S）是一种无色，有很强刺激性臭鸡蛋味的气体，水溶性和亲脂性均较强。

自1713年首次报道的毒性以来，近300年内人们主要致力于其毒理研究，对生物学功能的研究非常少。

上个世纪90年代中后期，随着内源性H2S 在鼠脑和人脑的相继发现，以及其参与的酶促反应的机制被揭示，内源性H2S 对机体生理功能的影响和疾病状态下H2S的生成变化及对疾病的病理生理联系，展开了广泛研究。

本文主要叙述H2S在生物体生理及病理过程中，尤其在高血压、动脉粥样硬化和心肌缺血等心血管疾病中发挥的重要作用。

随着H2S的生理作用被揭示，其对血流动力学的影响及在心血管系统疾病中的调节作用被广泛研究。

大量的研究表明，H2S与高血压、心肌缺血/再灌注损伤、休克等疾病的发生发展有关，并证实H2S可发挥心脏保护作用[1]。

1 高血压研究表明，左旋硝基精氨酸甲酯能够抑制NO合成酶，从而减少NO的产生，引起血压升高，在左旋硝基精氨酸甲酯高盐致高血压小鼠模型中，外源性H2S 能够降低血压，提示H2S在维持血压方面可能发挥作用。

另外，与血压正常的健康人相比，自发性高血压的发生可能与大动脉重塑、胶原蛋白堆积、血管舒张功能障碍有关，研究者证实H2S可通过抑制VSMCs增殖，促进内皮细胞增殖而降低自发性高血压小鼠的血压并减弱血管重塑，此作用可能与下调Bcl-2和活化核因子（NF-kB）表达有关[2]。