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分子生物学实验技术

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DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。

绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。

一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA 片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。

1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μg λ噬菌体DNA所需的酶量。

不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。

但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。

一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。

2.20μl体积反应体系如下：DNA 0.2-1 μg10×酶切buffer 2.0 μl限制性内切酶 1-2 u（单位）加ddH2O 至 20 μl限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化1hr。

3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。

4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。

5.酶切结束时，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。

或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。

6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M 乙酸铵（或1/10体积3M NaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g× 5min。

倾去含大部分蛋白质的上清液。

于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH 7.6）。

7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。

二、电泳检测取质粒酶切产物适量，加适当loading buffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。

三、注意事项1. 浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。

2. 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。

进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。

每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。

加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。

3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。

4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。

在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。

5.注意星号酶切活力。

DNA片段回收与纯化质粒、噬菌体等经酶切，电泳；PCR产物经电泳后，常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。

DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。

一、冻融法1.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心管中；2.加入等体积的Tris-HCl饱和酚（pH 7.6），振荡混匀；3. -20℃放置5-10min；4. 4℃离心10000g×5min，上层液转移置另一离心管中；5.加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；6. -20℃，放置5-10min；7. 4℃离心10000g×5min，合并上清液；8.用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；9.加入1/10体积3M NaAc（pH 5.2）、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀；10. -20℃，静置30min；11. 4℃离心13000g×10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；12.加适量H2O或TE溶解沉淀。

二、DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）1.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。

2.加入Buffer QG（每100mg凝胶加Buffer QG 300μl），置50℃水浴10min。

3.若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝胶加异丙醇100μl），混匀。

4.将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上。

5.4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。

6.加入500μl Buffer QG于柱上，4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。

7.加入750μl Buffer PE于柱上，4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。

8.4℃离心13000g×1min。

弃去收集管。

9.将柱放于一新1.5ml离心管上，加50μl EB于柱上。

放置1min，4℃离心13000g×1min。

10. 取5μl 回收DNA电泳检测。

三、注意事项紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。

mRNA差别显示技术mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse基因功能的鉴定：①knock out②dominant negative mutation③原核系统或真核系统中的表达翻译。

抗体的制备，细胞内的定位，抗体抑活等等。

④one hybrid判断出该基因的“启动”基因。

⑤two hybrid判断出该基因的产物的作用途径。

这里以CLONTECH公司生产的Delta TM Differential Display Kit为例，介绍具体的实验步骤。

该试剂盒中含有10种任意引物和9种Oligo(dT)引物。

二、操作步骤1．总RNA的提取（见Northern 杂交）2．第一链合成：(1)总RNA样品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O补至5μl。

将管标号为1A,2A,PC A等。

PC为阳性对照。

(2)混匀后稍离心。

(3）70℃孵育3min，冰浴2min后稍离心。

(4）准备dNTP mix (以5管为例 )每管 5管5×第一链缓冲液 2μl 10μldNTPmix（各5mM） 2μl 10μlMMLV逆转录酶（200u/μl） 1μl 5μl5μl 25μl (5）每管加入5μl，混匀后稍离心。

(6）42℃孵育1hr。

(7）75℃ 10min终止反应后置冰上，稍离心。

(8)将2μl反应液分别转至新管中（新管标号为1B,2B,PC B等）。

(9) 将78μl ddH2O分别加入B管中,混匀。

(10)将72μl ddH2O分别加入A管中，混匀。

(11）将所有cDNA稀释液 -20℃保存待用。

3．dd-PCR: 以引物P1,T9为例说明（0.5ml PCR管,1代表对照组,2代表实验组）管号 cDNA样品引物(1) 1A P1,T9(2) 1B P1,T9(3) 2A P1,T9(4) 2B P1,T9(5) H2O P1,T9(6) RNA1 P1,T9(7) RNA2 P1,T9以下为阳性对照反应体系(8) PC 1A P10,T8(9) PC 1B P10,T8(10) PC 2A P10,T8(11) PC 2B P10,T810×PCR buffer 5 μl5mM dNTPmix 0.5 μl引物P 2.5 μl引物T 2.5 μlTaq酶 2 μl加ddH2O至总体积为50μl(4)执行PCR程序:93℃3min；93℃1min→60℃1min→68℃2min，20次循环；68℃5min。

(5)取PCR产物10μl 2%琼脂糖电泳检测。

(6)PCR产物乙醇沉淀，10μlddH2O溶解。

6．以PCR产物为探针，标记后进行Northern杂交，证实基因的真实性。

7．PCR产物的TA克隆。

8．DNA序列测定。

9．检索分析。

mRNA的分离与纯化真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。

绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly （A+）表示。

这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。

此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。

寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA一、试剂准备1．3M醋酸钠（pH 5.2）2．0.1M NaOH3．1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。

配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS 至终浓度为0.1%。

4．洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS5．无水乙醇、70%乙醇6．DEPC二、操作步骤1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。

2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。

3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。

4．将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。

当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。

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分子生物学实验技术ppt课件

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分子生物学实验技术全攻略

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分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。

二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。

质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。

特别是常用的大肠杆菌。

大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。

它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。

当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。

然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。

最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。

分子生物学的实验技术与方法

分子生物学的实验技术与方法

分子生物学的实验技术与方法随着科技的不断发展，分子生物学在近年来成为一个极其活跃的领域，也受到越来越多人的关注。

分子生物学是研究生命体系结构、功能、全基因组组成等领域的学科，而分子生物学的实验技术与方法则是研究生命体系结构、功能、全基因组组成等领域的重要支撑。

1. 分子生物学实验技术与方法的概括分子生物学实验技术与方法是研究生命现象和机制的重要手段。

它包括了一系列的技术分析和方法，如基因测序技术、PCR技术、蛋白质组学、转染技术、组织培养技术、荧光技术等等。

其中，基因测序技术是目前最重要的技术之一。

它可以解析DNA序列中的各个碱基、基因等结构元素，为生物学研究提供了极为有利的手段。

PCR技术也是分子生物学实验技术中比较受欢迎的一种技术，它是一种快速检测DNA和RNA的方法，可以在很短的时间内扩增出多个相同的DNA片段或RNA片段，为分析和研究生物的基因、蛋白质等提供了便利。

此外，蛋白质组学是分子生物学研究中另一个重要的手段。

它可以帮助研究人员了解蛋白质的分子结构、功能和相互作用，是研究生物体内各种信号和代谢途径的重要方法。

2. 基因测序技术基因测序技术是分子生物学实验技术中的一项重要技术。

它是指通过一系列的实验步骤，将生物样品中的DNA分离开来，然后通过被称为“测序仪”的机器设备，解析出其DNA序列信息，最终得到一个完整的基因组序列。

基因测序技术的核心是测序仪，目前主要有Illumina、Pacific Biosciences等几种测序仪。

基因测序技术的应用范围非常广泛，如研究一个特定基因的结构和表达情况、找出某些基因存在的异常及其对人体健康的影响等。

当然，基因测序技术的应用不仅局限于科学方面，它还可以应用于医疗诊疗、个性化医学、疾病预防等多个领域。

3. PCR技术PCR技术是一种利用DNA聚合酶扩增DNA的特定技术。

这种技术可以在短时间内扩增出大量的DNA片段，达到检测目的。

PCR技术的核心是DNA聚合酶，通过PCR技术可以扩增任意长度的DNA片段，如检测特定的基因序列等。

分子生物学实验技术

分子生物学实验技术

分子生物学实验技术分子生物学实验技术是分子生物学研究领域中使用的一系列实验技术的总称，它们主要用于分析和操作生物体内分子水平的结构和功能。

这些技术的发展与进步，在分子生物学研究中具有重要意义，为科学家们提供了更加高效、准确和精细的实验方法和手段。

本文将着重介绍分子生物学实验技术的一些常用方法和原理。

一、聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种通过DNA扩增技术在体外合成目标DNA的方法。

它通过引物与待扩增DNA片段的互补配对，在DNA复制酶（如Taq聚合酶）的催化下，经过一系列的温度循环（包括解链、退火和扩增）反复进行，从而使得目标DNA不断扩增，达到检测和分析的目的。

PCR技术广泛应用于基因检测、疾病诊断、犯罪分析等领域。

二、DNA测序技术DNA测序是指通过测定DNA的碱基序列，以获取基因信息的一种手段。

传统的DNA测序技术包括Sanger测序和Maxam-Gilbert测序。

随着高通量测序技术（NGS）的发展，如Illumina测序、Ion Torrent测序等，使得大规模、快速、低成本的DNA测序成为可能。

DNA测序技术在基因组学和遗传学研究中扮演着关键角色。

三、蛋白质分析技术蛋白质是生物体内功能最为重要的分子之一，研究蛋白质的组成、结构和功能对于理解生物体的生理过程具有重要的意义。

蛋白质分析技术主要包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western Blotting、质谱分析等。

SDS-PAGE凝胶电泳可用于蛋白质的分子量测定和纯化，Western Blotting则可以用来检测特定蛋白质的存在及其相对量，质谱分析则可以用来确定蛋白质的氨基酸序列。

四、基因克隆技术基因克隆是指将DNA片段插入到载体DNA（如质粒）中，并利用细胞的自我复制机制，将其复制并表达出来的技术。

这个技术广泛应用于基因工程、药物研发、植物育种等领域。

基因克隆技术的核心是DNA片段的连接和转化。

连接可通过限制性内切酶切割DNA片段，并使用DNA连接酶进行连接；转化则是将重组质粒转入宿主细胞中，使其进行复制和表达。