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第十六章蛋白与蛋白相互作用分析第一节免疫共沉淀一．实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体和抗原之间的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合抗体Fc段的现象而开发出来的方法，是研究蛋白质相互作用的经典方法，主要用于确定两种蛋白质在完整细胞内是否存在生理性相互作用。
其原理是：当细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用可以被保留下来。
如果用蛋白质X的抗体进行免疫沉淀，那么在细胞内与X结合的蛋白质Y也能被沉淀下来。
目前多将精制的protein A/G预先结合固化在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的protein A就能吸附抗原及其结合蛋白，通过低速离心，可以将目的抗原及其结合蛋白与其它成分分离。
二．主要仪器和试剂1．主要仪器微量高速4°C离心机；vortex震荡器；垂直混和器；Western blot 所需仪器。
2．试剂（1）蛋白定量试剂盒；抗体；PBS；protein A/G agarose beads；（2）Western blot所需试剂（参考本书第十七章免疫印迹）；（3）NP-40蛋白裂解缓冲液（使用前加入蛋白酶抑制剂）：150mM NaCl，0.5% NP-40，50mM Tris-HCl。
配置500mL 需要：5M NaCl 15mL，10% NP-40 25mL，1M Tris-HCl （pH8.0）25mL。
三．实验步骤1.转染24-48 h后，刮取细胞，转移到15mL离心管，1000rpm离心5min，用冰预冷的PBS洗涤细胞一次，细胞沉淀用1mL冰预冷的PBS重悬，移至Eppendorf管，4°C 12000rpm离心1min，弃上清；2.加入适量NP-40细胞裂解缓冲液（用前新鲜加入蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 每隔10min Vortex一次(每次大约30sec)，4℃12000rpm离心1 min，上清移至新的Eppendorf管；3.蛋白定量，每组取适量（通常100μg-1mg）蛋白，用细胞裂解液调整体积使每组一致（通常总体积500-1000μL），加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠；4.4°C孵育30min – 2h，以去除蛋白与Protein A/G琼脂糖珠的非特异结合（pre-clear）；5.4°C，2500rpm 离心3 min，上清移至新的Eppendorf管；6.加入第一抗体，4°C旋转孵育过夜；7.次日，每管加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠，4°C缓慢旋转孵育1–3h；8.4°C，2500rpm 离心3 min，小心吸去上清，琼脂糖珠用1mL裂解缓冲液洗3－4次；每次可样品置于4°C缓慢旋转孵育10min；9.最后一次吸干所有液体，加入40μl的1×SDS 上样缓冲液，Vortex，然后用离心机轻甩30sec；10.沸水煮5分钟，12,000rpm离心1min；11.SDS-PAGE并进行Western blot检测。
解析免疫共沉淀（Co-IP）技术：深入了解蛋白质相互作用及生物药物领域的突破性进展蛋白质是生物体内执行重要功能的基本分子。
它们通过相互作用形成复杂的网络，调控生物过程的发生与发展。
了解蛋白质相互作用对于揭示细胞的功能和疾病的机制至关重要。
免疫共沉淀（Co-IP）技术是一种常用的方法，通过该技术可以研究蛋白质之间的相互作用关系，并在生物药物领域取得了一系列突破性进展。
一、Co-IP技术的基本原理。
Co-IP技术基于免疫学原理，利用特异性抗体将目标蛋白质与其相互作用的伴侣蛋白质结合，并通过免疫沉淀的方式将复合物从细胞提取物中富集出来。
该技术的核心是选择合适的抗体，使其能够高效、特异性地结合目标蛋白质。
随后，通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质，最终得到目标蛋白质及其相互作用伴侣的复合物。
二、质谱技术在蛋白质片段表征中的应用。
质谱技术在蛋白质片段的表征中具有广泛的应用，它可以帮助我们确定蛋白质的氨基酸序列，识别和定量翻译后修饰，确定蛋白质的三维结构等。
这些信息对于理解生物药物的作用机制，评估药物的有效性和安全性，以及优化药物设计都具有重要的价值。
三、突破性进展：揭示蛋白质相互作用及生物药物研发。
Co-IP技术在蛋白质相互作用研究和生物药物研发中取得了重要突破。
以下是几个关键应用领域的例子：1.研究蛋白质复合物及信号通路：Co-IP技术可以帮助鉴定蛋白质复合物中的成员和相互作用方式，从而揭示细胞内复杂的信号通路网络。
例如，通过Co-IP技术，科学家们发现了许多关键的细胞信号通路，如MAPK和PI3K/Akt通路等，为深入理解这些通路的功能和调控机制提供了重要线索。
2.鉴定潜在药物靶点：利用Co-IP技术，研究人员可以筛选和鉴定与疾病相关的蛋白质相互作用伴侣，从而发现潜在的药物靶点。
这种方法在药物研发中具有重要的意义，可以加速新药的发现和开发过程。
3.生物药物研发：Co-IP技术在生物药物研发中的应用也非常广泛。
楼上说的准确的叫Co-IP。
IP就是免疫沉淀，没有“共”，哈哈。
其实楼主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗体，直接检测western,就可以了，为什么还要用IP以后的样品来检测，这是因为p-Pyk2商业化的抗体特异性不好，可能对p-FAK或其他类似的磷酸化蛋白有交叉，所以我们一般为了准确性，看其磷酸化的变化，就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来，在用4G10抗体来检测。
而且这个方法看的是Pyk2蛋白全部的磷酸化位点的情况，而p-Pyk2商业化抗体一般都是识别某一格Tyr磷酸化位点的，所以这两种试验是有本质区别的，这种方法还应用于很多Tyrosine kinase receptor磷酸化的检测，因为这些蛋白磷酸化位点都特别多哈：)免疫沉淀是指用抗体把抗原（包括单体、复合物）沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来研究蛋白质的相互作用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose 珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl 的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
楼上说的准确的叫Co-IP。
IP就是免疫沉淀，没有“共”，哈哈。
其实楼主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗体，直接检测western,就可以了，为什么还要用IP以后的样品来检测，这是因为p-Pyk2商业化的抗体特异性不好，可能对p-FAK或其他类似的磷酸化蛋白有交叉，所以我们一般为了准确性，看其磷酸化的变化，就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来，在用4G10抗体来检测。
而且这个方法看的是Pyk2蛋白全部的磷酸化位点的情况，而p-Pyk2商业化抗体一般都是识别某一格Tyr磷酸化位点的，所以这两种试验是有本质区别的，这种方法还应用于很多Tyrosine kinase receptor磷酸化的检测，因为这些蛋白磷酸化位点都特别多哈：)免疫沉淀是指用抗体把抗原（包括单体、复合物）沉淀下来，是一种抗原纯化、浓集的方法；免疫共沉淀指用抗体把抗原复合物沉淀下来，常用来研究蛋白质的相互作用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
基于微流控芯片的蛋白质高灵敏快速检测技术研究共3篇基于微流控芯片的蛋白质高灵敏快速检测技术研究1蛋白质是生物体内许多重要化学反应和生命表现的基础物质，因此在生物医学、生命科学以及食品工业等领域中具有重要的应用价值。
然而，如何高效地检测蛋白质成为了研究人员关注的问题之一。
现代生命科学和医学研究中，蛋白质检测技术的发展起着决定性的作用。
传统的蛋白质检测方法在性能上存在一些问题，例如条件苛刻、过程繁琐等。
近年来，微流控芯片技术快速发展，为高灵敏度和快速检测蛋白质提供了新的可能性。
微流控芯片技术是一种将微流体学的概念应用于芯片技术中的新型技术。
由于其微小流通体积、高效率、快速响应和可重复性等特点，使得微流控芯片在生物医学和生命科学中得到广泛的应用。
与传统的检测技术相比，微流控芯片检测技术具有以下优点：①检测过程自动化，操作简便；②靶分子检测的容易性和高灵敏度；③减小样品消耗和反应污染的可能性；④实现多参数同时检测，提高检测速度和准确性。
基于微流控芯片的蛋白质检测技术，是一种利用微流控芯片对微小的蛋白质样本进行高灵敏度快速检测的技术。
这种技术主要是基于特殊的仪器设备和芯片结构，以及一系列特殊的微流控芯片加工工艺和生物学方法。
相对于传统的蛋白质检测技术，该技术拥有以下优势。
首先，快速检测。
基于微流控芯片的蛋白质检测技术采用微流控技术，可以将反应体积压缩到微米级别，缩短蛋白质检测时间，从而实现快速检测。
其次，高灵敏度。
由于微流控芯片的成像窗口积极利用了紫外线照射的特点，检出的灵敏度更高。
其次，自动化程度高，操作简单方便。
虽然微流控芯片的制作难度较大，但在实验室实验的过程中，操作简便、操作功效高，自动化程度也高。
最后，适用范围广。
基于微流控芯片的蛋白质检测技术既可用于检测单一的样品，也可以同时检测多样品的蛋白质，适用于多种蛋白质检测。
微流控芯片技术是一项前沿技术，基于其原理的蛋白质检测技术也是一个充满挑战的研究领域，其复杂性主要表现在以下方面：首先掌握微流控芯片的设计与加工技术；其次，在芯片反应域内实现靶分子的高效捕获和分离；第三，在芯片上建立靶分子检测的体系，需要一系列特殊的生物学方法和技术手段。
遗传HEREDITAS Beijing 27 5 : 801 807 2005 技术与方法染色质免疫沉淀技术在研究DNA 与蛋白质相互作用中的应用1 1 1 2 1 王春雨石建党朱彦张琚 1. 南开大学分子生物学研究所教育部生物活性材料重点实验室天津300071 2. 美国塔芙茨大学医学院圣伊丽莎白医学中心心血管研究所分子生理学实验室波士顿马萨诸塞02135 2997 美国摘要: 在后基因组时代DN A 蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域。
与其他方法相比染色质免疫沉淀技术chromat in immuno pr ecipitatio n assay ChIP 是一种在体内研究DN A 蛋白质相互作用的理想的方法。
近年来这种方法与DN A 芯片和分子克隆技术相结合可用于高通量的筛选已知蛋白因子的未知DN A 靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况这将有助于深入理解DN A 蛋白质相互作用的调控网络。
总结了染色质免疫沉淀技术的方法特别介绍了使用这些方法取得的最新进展。
关键词: DN A 蛋白质相互作用染色质免疫沉淀技术ChIP DN A 芯片ChIP 克隆中图分类号: Q 78 文献标识码: A 文章编号: 0253- 9772 2005 05- 0801- 07 Application of Chromatin Immunoprecipitation Assay in Deciphering DNA Protein Interactions WANG Chun Yu1 SH I Jian Dang 1 ZH U Yan1 2 Z H ANG Ju 1 1. The Key La borat ory of Bioactive Mat erials Minist ry of Educat ion Ins titute for Molecular Biology Nankai Universit y Tianjin 300071 China 2. Laboratory of Molecula r Physiology Division of Cardiovas cular Res earch St . Eliza bet h s Medica l Center Tufts Univers ity S chool of Medicine Bost on MA 02135 2997 US A Abst ract : In the post genomic era identifyi ng and characterizing vari ous DNA protein inter actions are a major chal lenge in the research of gene tr anscripti onal regulation. Although many techni ques can be used for thi s purpose chr o matin immunopreci pitation assay ChIP by contrast is ideally suited for studyi ng DNA protein interactions in v ivo . In recent years standard ChIP assay has been modi fied to uncover some known factors unknown target sequences es pecial ly when combined wi th DNA microarray and molecular cloni ng strategi es. These hi gh throughput ChIP assays are more and more used to reveal the di stributi on profile of trans acti ng factor binding si tes throughout the genome which may yield many new insights into the DNA protein interaction network. This article summarized the methods of ChIP as say and highl ighted recent progress in the appli cation of this technique. Key words: DNA pr otein i nteractions chromati n immunoprecipitati on assay ChIP DNA micr oarr ay ChIP cl oning收稿日期: 2004 07 08 修回日期: 2004 08 04基金项目: 国家自然科学基金资助项目编号: 30471733 30271297 和留学人员短期回国工作讲学项目两个基地项目编号: 30410403237 2002 年度高等学校博士学科点专项科研基金编号: 20020055026 Supported by National Natural Sciences Foundat ion of China No. 30471733 30271297 Fund for Chinese Scholars Abroad to Work and Lecture in China Two Base Project No. 30410403237 and Spe o. cialized Research Fund for t he Doctoral Program of Higher Educat ion N 20020055026 作者简介: 王春雨1979男天津市人博士研究生专业方向: 医学分子生物学。
实验入门之---免疫共沉淀（Co-IP）小编最近挺忙的，实验室各种事情要做，读研的都知道，就不多加唠叨了，研究做机制的，肯定会做到蛋白与蛋白之间的结合伴侣情况，转录激活功能等等，首先讲结合蛋白，就要涉及到免疫共测定实验。
好吧不多说了，上干货。
原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用，为研究蛋白质相互作用的方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用prorein A预先结合在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否结合。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中。
4. 4℃，12000g离心15-30min，立即将上清转移到新的离心管中。
5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗3-4遍珠子，然后用PBS 配制成50%浓度。
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法一、基本概念免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。
免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。
其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。
与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。
不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。
在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。
二、抗体的选择（一）多克隆抗体多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。
但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。
（二）单克隆抗体与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。
但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。
三、免疫沉淀方法免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。
若为前者，免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，只需压片即可检测到靶蛋白的存在；若为后者，经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后，尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。
（一）所需试剂及溶液改良的RIPA液（细胞裂解液）、稀释缓冲液（常用PBS溶液）、TSA溶液、0.05mol/lTris（pH6.8）、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。
