CpG寡核苷酸免疫刺激DNA序列的构效关系分析及其抗肿瘤作用研究

CpG寡聚脱氧核苷酸抑制肾癌细胞增殖及肿瘤生长的体内外实验研究马斌斌;周佩军;徐达;王祥慧;邵琨【摘要】目的研究CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)在体内外对肾癌细胞增殖及肿瘤生长的抑制作用,并探讨其可能的作用机制.方法采用CCK-8法检测不同浓度CpG ODN1826和non-CpG ODN1982(ODN1982)干预对体外培养人肾透明细胞癌Caki-1细胞增殖的影响.24只BALB/c裸鼠皮下接种Caki-1细胞建立荷瘤裸鼠模型,4 d后根据每周1次的治疗方式随机分为对照组(PBS)、ODN1982组(50μgODN1982)、小剂量CpG ODN1826组(25 μg CpG ODN1826)和大剂量CpG ODN1826组(50 μg CpGODN1826),每组6只.于建模后35 d处死动物,比较各组荷瘤裸鼠的肿瘤体积、质量及肿瘤组织学改变;体外分离各组荷瘤裸鼠脾淋巴细胞,乳酸脱氢酶释放法检测不同靶标比例(脾淋巴细胞:Caki-1细胞或脾淋巴细胞:小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞)的荷瘤裸鼠脾淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性.结果 ODN1982对Caki-1细胞的体外增殖活性无显著影响;500μg/mL CpGODN1826干预可显著抑制Caki-1细胞增殖.至实验终止时点,小剂量和大剂量CpG ODN1826组荷瘤裸鼠的肿瘤体积显著小于ODN1982组和对照组(P＜0.05);各组间肿瘤质量比较差异均具有统计学意义(P＜0.05);组织学观察显示,小剂量和大剂量CpG 0DN1826组肿瘤组织较多炎性细胞浸润.当靶标比例为50∶1时,大剂量CpG ODN1826组裸鼠脾淋巴细胞对Caki-1细胞和YAC-1细胞的杀伤活性分别为(9.74±1.16)%和(79.65±5.23)%,显著高于对照组的(7.67±0.22)%和(10.12±3.03)%及ODN1982组的(7.66±0.93)%和(27.60±9.83)%(P＜0.05).结论CpG ODN对体外肾癌细胞增殖及荷瘤裸鼠肿瘤组织生长均具有明显抑制作用,其机制可能与CpG ODN增强荷瘤裸鼠的固有免疫应答有关.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2010(030)007【总页数】6页(P763-768)【关键词】CpG寡聚脱氧核苷酸;肾癌;固有免疫【作者】马斌斌;周佩军;徐达;王祥慧;邵琨【作者单位】上海交通大学,医学院瑞金医院泌尿外科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院泌尿外科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院泌尿外科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院泌尿外科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院泌尿外科,上海,200025【正文语种】中文【中图分类】R737.11固有免疫系统通过Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)识别病原微生物的病原体相关模式分子(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，产生免疫应答[1]。

肠道菌群在肿瘤免疫治疗中的作用研究进展摘要：机体微生物菌群直接影响着人类健康多方面，科学家认为，肠道菌群对人类免疫系统的健康非常关键。

通过研究可知，肠道菌群构成状态和血液中多类型免疫细胞浓度的改变存在直接联系，也就是肠道菌群可以对人类机体免疫系统构成进行直接塑造。

所以，研究人员可以追踪接受抗肿瘤药物治疗的患者的微生物菌群变化。

文章论述了肠道菌群在肿瘤免疫治疗中的作用研究，旨在可以为行业人士提供有价值的参考和借鉴，更好的促进行业发展。

关键词：肠道菌群；肿瘤；免疫治疗；作用引言：在肿瘤发生前，良好的肠道微生态可使肠道有害物质减少，保持肠粘膜的完整性，减少炎症反应，在肿瘤形成阶段，可使机体产生强大的免疫系统对抗肿瘤，减少肿瘤细胞增殖，提升其凋亡速度；肿瘤使用化疗或免疫疗法治疗时，肠道菌群为抑制肿瘤免疫逃逸和增加药物敏感性的主要因素，肠道菌群通过调节“免疫检查点”可更好的实现抗肿瘤免疫治疗。

“免疫检查点”是一种免疫抑制分子，其生理学功能是对T细胞功能的抑制，在肿瘤组织中，它被肿瘤利用并帮助它们免疫逃逸。

据研究可证，肿瘤通过免疫疗法杀伤时，离不开肠道菌群参与，对肠道菌群进行有效调整，可更好的实现良好的治疗效果。

1肠道菌群在肿瘤发展、抗肿瘤免疫治疗中的作用1.1 肠道菌群对胃肠道肿瘤发展的影响肠道菌群中的部分细菌能够使胃肠道组织中出现肿瘤，据多项研究表明，幽门螺杆菌（HP）同萎缩性胃炎、不典型增生、胃癌和肠上皮化生进展间有紧密的联系。

想要更好的降低由GP引发胃癌发生风险，最理想的方式就是幽门杆菌的根除，HP感染可经过多类机制引发胃癌，其中有释放毒力因子VacA、CagA和引发胃上皮细胞内质网应激、自噬以及氧化应激反应。

然而部分研究也证明了，HP同食道癌（EAC）发生成负相关，在一定情况下可以发挥保护作用，最近一些年还有一些研究表明，非HP同胃癌发生相关。

1.2 肠道微生物群对胃肠道外组织肿瘤发展的远距离影响1.2.1肠道细菌向胰腺肿瘤的易位肠道细菌可以迁移到其他密切相关的组织并影响肿瘤的进展，如果给小鼠喂食荧光标记的共生细菌，能够观察到其从肠腔室向胰腺转移。

CpG寡核苷酸免疫刺激DNA序列的构效关系分析及其抗肿瘤作用研究作为免疫刺激序列(immunostimulatory sequence，ISS)，含有非甲基化CpG 二核苷酸的寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides，ODN)能直接激活B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原递呈细胞等；间接激活T细胞、NK细胞；诱导以Th1型为主的免疫应答，是一种高效低毒的免疫佐剂。

在肿瘤、免疫缺陷性疾病、感染性疾病及过敏性疾病治疗中有着强大的潜在应用价值，CpG ODN作为一种新型的免疫刺激剂越来越多地受到人们的关注。

CpG ODN的免疫刺激活性具有结构特异性，其免疫刺激活性与结构之间的相关关系仍有许多环节尚待阐明：游离的5’端结构是否免疫刺激活性所必需?回文结构的有无、多寡、碱基构成特征及其在序列中的位置对活性有无影响?此外，CpG基序在序列中的数量、距离远近、空间连接、5’端的碱基组成对ISS免疫刺激活性的影响也均有待系统研究。

CpG ODN的免疫刺激作用具有种属特异性，我们选择已知有效的小鼠特异性ISS——ODN1826为模板和阳性对照，设计了一系列不同结构的CpG ODNs，采用多种生物学方法对所设计CpG ODNs的免疫活性进行检测，并基于此进行构效关系分析，总结一些能够揭示CpG ODN免疫刺激作用机制的新规律，并对新型CpG ODN的理性设计提供理论和实验依据。

研究中筛选出了若干条免疫刺激活性优于阳性对照ODN1826的ISS，对这些CpG ODN在小鼠体内的抗肿瘤活性以及对荷瘤鼠免疫调节机能的影响进行了系统的分析。

此外，对CpG ODN免疫刺激活性的分子机制进行了初步研究。

一、以小鼠特异性的B型CpG ODN1826为模板和阳性对照，设计了15条CpG ODNs(ODN1～ODN5)，涉及到CpG基序在序列中的数量、距离远近、空间连接，5’端的碱基组成，回文结构的有无、回文结构碱基构成特征及其在序列中的位置等结构变化；所设计CpG ODNs作用于小鼠脾细胞，以其对细胞因子IL-6、IL-12及IFNα等分泌的影响、对B细胞增殖活性、NK细胞杀伤活性的影响等为活性指标，系统分析CpG ODNs的构效关系。

CpG-ODN对肺腺癌细胞增殖的抑制作用及其与Runx3关系的初步研究的开题报告
题目： CpG-ODN对肺腺癌细胞增殖的抑制作用及其与Runx3关系
的初步研究
背景：肺腺癌是肺癌中最常见的类型，具有高度恶性和易转移的特点，虽然现有的治疗手段能够一定程度上控制肺腺癌的进展，但药物耐
受性和复发率仍然较高。

因此，探索新的治疗手段和机制对于肺腺癌的
治疗具有重要意义。

CpG寡核苷酸（CpG-ODN）是一种能够模拟细菌DNA并激活免疫应答的分子，已被证明具有抗癌作用。

Runx3基因编码
一种转录因子，参与调控细胞周期和细胞增殖，被认为在肺癌中的表达
下调，其与CpG-ODN对肺腺癌增殖的关系需要进一步研究。

目的：本研究旨在探究CpG-ODN对肺腺癌细胞增殖的抑制作用，以及其与Runx3表达的相关性，为肺腺癌的治疗提供新的思路和理论支持。

方法：选取人肺腺癌细胞株作为实验材料，分为实验组和对照组。

实验组分别加入不同浓度的CpG-ODN处理，观察细胞增殖情况。

对照组不加任何处理。

采用Western blot方法检测不同浓度CpG-ODN处理后Runx3的表达情况，并进行相关性分析。

预期结果：预计CpG-ODN能够抑制肺腺癌细胞的增殖，浓度与效应的关系符合一定的规律；CpG-ODN处理后Runx3的表达会显著上调，并且与细胞增殖水平呈现负相关的趋势。

这些发现将为进一步探究CpG-ODN对肺腺癌治疗的潜在作用提供可靠的理论基础。

CpG-ODN抗肿瘤增敏作用的研究进展胡广蕊;孟民杰【摘要】CpG oligodeoxynucleotide(CpG-ODNs),which is widely used in radiotherapy,chemotherapy and the surgical treatment, can enhance treating effects, improve the patients' immunity, reduce the risk of complications and improve patients' quality of life. The basic concept,the structure,the functioning mechanism and anti - tumor effects of CpG-ODN are introduced. The application of CpG-ODN as a novel anti-tumor sensitizer in the tumor treatment with combination of radiotherapy, chemotherapy and surgical operation is specially discussed.%CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides,CpG-ODNs)在放、化疗及外科治疗中的应用,不仅提高了治疗效果,还能提高患者的免疫力,降低发生并发症的风险,改善患者的生活质量.本文简单介绍CpG-ODN的基本概念、结构、作用途径及其抗肿瘤免疫活性,重点介绍近几年来CpG-ODN作为一种新的抗肿瘤增敏剂,联合放、化疗及外科治疗在肿瘤治疗中的应用,并对CpG-ODN的安全性进行了分析,提出CpG-ODN 作为抗肿瘤增敏剂的研究展望.【期刊名称】《广东药学院学报》【年(卷),期】2011(027)005【总页数】4页(P552-555)【关键词】CpG-ODN;免疫活性;肿瘤;放疗;化疗【作者】胡广蕊;孟民杰【作者单位】广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】R979.1对于恶性肿瘤的治疗，主要采取以手术治疗、放射治疗、化学治疗等相结合的综合治疗方法。

CpG ODN序列结构特征对免疫活性影响的研究进展【关键词】 CpG ODN; CpG 基序; 免疫刺激; 序列结构CpG ODN（CpG oligonucleotide, CpG 寡脱氧核苷酸）是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG）的寡脱氧核苷酸(ODN), 可模拟细菌DNA刺激多种哺乳动物包括人的免疫细胞。

它能直接激活B细胞和单核细胞(巨噬细胞和树突状细胞), 间接激活NK细胞和T细胞等多种免疫效应细胞, 增强其功能和细胞因子的分泌, 增强抗原的加工提呈, 诱导Th1型免疫应答, 产生较强的体液免疫和细胞免疫, 增强特异性和非特异性免疫反应。

可治疗肿瘤、过敏反应性疾病、感染性疾病和免疫功能低下的患者。

国外已对目前对人免疫刺激活性最强的CpG ODN 7909进行了多项的临床试验, 包括对黑色素瘤、非小细胞肺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等肿瘤的Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期临床试验, 以及对HBV、 HCV等感染性疾病的Ⅰ/Ⅱ期临床试验［1-3］, 证实是一种高效低毒的新型免疫治疗剂和佐剂, 并已申请专利。

目前国内的研究尚处于体外实验和动物试验阶段, 尚无具有独立知识产权的CpG ODN序列。

CpG ODN是多个脱氧核苷酸有规律的排列, 其组合形式多样。

而不同序列结构特征的CpG ODN免疫活性相差很大, 改变序列中的某一个或某几个核苷酸都可能会极大地影响其免疫活性, 这是设计免疫活性CpG ODN的理论基础。

通过研究总结并掌握CpG ODN的构效关系对于合成和筛选对人有效的CpG ODN序列有重要意义。

1 CpG ODN的结构特征及分类非甲基化的CpG二核苷酸为核心的六核苷酸特征结构, 即CpG 及其上游、下游各2个核苷酸所组成的六聚体, 是奠定CpG ODN免疫刺激作用的序列元件, 它是CpG ODN免疫刺激活性的核心结构。

Krieg称其为CpG基序(CpG motif), Sato等则称其为免疫刺激序列(ISS, immunostimulatory sequences)。

分子佐剂CpG DNA的研究进展及应用概况摘要免疫佐剂的主要作用是提高抗原（免疫原）的免疫原性和免疫反应的可持续性，它能诱导机体的免疫系统对抗原产生体液免疫或细胞免疫反应。

近年来，免疫佐剂的研究越来越受到人们的关注，该文着重介绍分子佐剂CpG DNA 的研究进展及应用概况，以为开发研制高效、低毒、结构新颖的免疫佐剂提供参考。

关键词分子佐剂；CpG DNA；研究进展；应用作为一种非特异性免疫增强剂，当佐剂与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。

同时，既减少了抗原的使用量，增加了机体抗体的产生量，又可以减轻免疫耐受。

近年来，佐剂发展较快，多种新型佐剂不断涌现，黏膜佐剂、纳米佐剂、天然佐剂及分子佐剂等是目前研究的热点。

用分子佐剂来提高基因疫苗的免疫效率是基因疫苗研究的关键，很多分子佐剂如CpG DNA、细胞因子、共刺激分子、趋化因子、C3d、免疫刺激调节分子等成为当前研究的热点。

1 CpG DNA的研究进展CpG DNA是一种DNA序列，其核心是一些未甲基化的CpG基序，具有免疫激活功能，它包括ODN（oligodeoxynucl-eotides，含CpG基序）和细菌、病毒、无脊椎动物等低等生物的基因组DNA，其碱基普遍遵循5-嘌呤-嘌呤-嘧啶-嘧啶-3的排列规律[1]。

研究表明，这种排列可激活多种免疫效应细胞，又称为免疫刺激DNA序列，其在细菌和病毒基因组中出现的频率至少是脊椎动物基因组的20倍，使入侵的外来细菌和病毒能够轻易地被脊椎动物的免疫系统所识别，从而激活相应的免疫应答机制。

CpG DNA的免疫激活机制可通过模式识别理论来解释，该理论是2000年由美国免疫学家Janeway et al提出的，病原相关分子模式（PAMP）是指天然免疫针对主要靶分子信号，模式识别受体（PRR）是指相对应的识别受体。

天然免疫中TLR家族成员识别PAMP后，从而在抗感染天然免疫中发挥重要作用。

届硕士学位论文前言〕逮泣月叮，‘口年如在上报道细菌来源和人工合成的特征序列即含非甲基化二核昔酸的寡脱氧核昔酸链能诱导细胞增殖分泌抗体有望成为一种新型的佐剂此后研究人员对进行了广泛深入的研究发现能直接刺激细胞，巨噬细胞‘，郎单核细胞〔树突状细胞‘，面抗原递呈细胞〔罗雌”或间接刺激袱细胞网细胞‘分泌。

石等细胞因子和。

等抗体图诱导以为主的免疫应答是一种天然的免疫佐剂在抗过敏抗肿瘤抗感染和免疫缺陷性疾病治疗中具有潜在的应用价值图刺激免疫细胞分泌直接刺激细胞分泌几龟促进直接或间接刺激细胞分泌诱导反应刺激分泌细胞因子介导义效应一、是一种理想的免疫佐剂目前能用于人类的佐剂包括不完全福氏佐剂细胞因子一疗效肯定但是制备复杂受限制不完全福氏佐剂诱导反应反应在细胞毒淋巴细胞泛反应和抗感染中不及反应有效且该佐剂注射局部炎症反应大具有较好的届硕士学位论文抗肿瘤作用但局部注射抗肿瘤作用持续时间短转染率低川相较而言诱导以反应为主的免疫应答同时还可使反应向反应逆转且合成简便毒副作用小是理想的免疫佐剂己有报道可以增强’‘猴疟疾疫苗肤’流感病毒亚单位疫苗’破伤风毒素’大肠杆菌耐热肠毒素突变体〔’】抗原和去除的灭活班抗原【’，的免疫原性增加相应的抗体水平同时也能提高机体对核酸疫苗的免疫应答目前美国免疫药剂公司研制的乙肝表面抗原疫苗的佐剂己经进入期临床试验’二、在疾病治疗中的应用抗肿瘤可刺激单核巨噬细胞分泌。

等细胞因子继而诱导细胞分泌丫下具有抗病毒抗细菌调节细胞生长等作用诱导型免疫应答具有抗病毒抗肿瘤作用可以提高的活性诱导型免疫应答同时具有抗肿瘤作用亦可直接刺激细胞分泌几等细胞因子促进细胞共刺激因子的表达诱导细胞成熟分泌。

抗体提高机体抵抗疾病的能力图图的免疫刺激作用刺激单核细胞分泌捉进细胞成熟分泌侧促进细反应促进细胞分泌，等同时诱导胞产生具有抗病毒抗肿瘤和促进细胞分泌等诱生的“和对肿瘤细胞均有抑制杀伤届硕士学位论文目舀观点二受体介导’，与细胞表面的样受体四结合导致二聚化通过胞内结构域招募髓样细胞分化因子吸引丝苏氨酸蛋白激酶并使琅自身磷酸化磷酸化班盛解离后与另一衔接蛋白受体相关因相互作用而后通过激活激酶转移生长因子激酶一方面激活几激酶通过磷酸化几解除几对’的抑制作用另一方面通过激活助有丝分裂原激活的蛋白激酶胞外信号调节激酶胞外信号调节激酶使激酶磷酸化激酶活化还能诱导肠涯磷酸化激活激活的催化应激激酶一一二泛接着二和磷酸化激活转录因子激活蛋白”的组成蛋白和蛋白激活和形成”转录因子和”均为诱导免疫应答基因表达的必需因子如图所示图受体介导的免疫作用机制被识别促使结合使磷酸化磷酸化后的很解离作用于一方面通过月等活化等另一方面激活激酶解除对声的抑制作用声进入细胞核促进多种前癌基因和细胞因子的表达届硕士学位论文四、的结构特点的免疫刺激活性主要由的特征性结构引起的基本骨架为’’，非甲基化二核昔酸是的功能部位，二核昔酸两侧的核昔酸为的侧翼序列非甲基化二核昔酸是的功能部位图图二核营酸化学结构红色为供体黄色为受体胞啥睫在一上有个氢受体一位上有一个供体这是和受体识别的重要部位一酮一亚氨基对的免疫活性很重要甲基化可使免疫刺激活性丧失鸟嗓吟在几上有两个受体上有两个供体，上基团被去除或修饰将导致免疫活性丧失队，，侧翼序列影响的免疫活性和特异性的侧翼序列可以根据不同的碱基排列出现多种组合方式但并非每种组合方式都具有免疫刺激活性侧翼序列对免疫刺激活性起重要作用阴等人研究发现’一一‘中是必需的，为时，具有较强的免疫活性若被无活性‘，’一二脱氧核普酸替代为时，对鼠的免疫活性最强，等人则发现’端相邻的第个核昔酸对的免疫效应至关重要其结构改变及碱基替代均可使免疫活性下降甚至丧失，且其序列与种属特异性密切相关对鼠作用较强的为对届硕士学位论文的方法能从总体水平上反映的免疫刺激活性的强弱法是于年首次报道的用于检测细胞增殖的简便准确的方法该方法检测的吸光值的大小能反映对细胞刺激增殖作用的强弱’掺入法与法均能反映淋巴细胞的增殖情况但是掺入法步骤复杂又具有放射性危害所以我们采用法来检测对新生儿单个核细胞的刺激作用从而筛选出对新生儿免疫刺激作用较强的序列图设计筛选流程首先总结设计原则根据设计原则设计巧条免疫新生儿脐血单个核细胞然后用法筛选出两条对新生儿免疫刺激作用较强的序列第二部分复合物免疫增强作用的研究图利用分子偶联技术合成复合物提高靶细胞对丙的摄取率增强的免疫刺激活性细胞对的摄取情况细胞是通过受体介导还是通过胞吞作用摄取目前尚无定论细胞对的摄取率不高且容易被核酸酶降解使对细胞的免疫刺激作用持续时间短对不同的细胞免疫刺激作用不同其原因除与细胞特异性有关外还可能与细胞对因的摄取率高低相关丙的化学结构决定了的特异性化学结构改变将影响的免疫活性我们考虑通过提高细胞对的摄取率来提高的免疫刺激作用届硕士学位论文前言分子偶联技术硫代修饰可降低核酸酶对的降解作用脂质体包埋可增强细胞对的摄取率但脂质体半衰期短缺乏靶向作用基因枪注射能直接将注入细胞但操作技术不易掌握而且以上方法均是非选择性提高细胞对的摄取率考虑到的免疫刺激作用具有细胞特异性最好能靶向性提高细胞对的摄取率对人具有较强的免疫刺激作用其所含的核心序列主要对细胞具有免疫刺激作用而主要表达于细胞表面我们利用交联剂碳二亚胺促进闷配体与多聚赖氨酸缩合成利用正负电荷吸引作用合成复合物通过识别细胞上的将携带至细胞表面利于细胞对的摄取然后再通过法法等检测复合物的免疫刺激活性图复合物的免疫增强作用复合物免疫单个核细胞法检测步抗体水平荧光显微镜观将合成的法检测细胞增殖作用情况检测亚细胞群的情况察摄取的细胞第三部分三种复合物免疫刺激活性的比较将第一部分筛选出的条分别合成复合物与复合物的免疫活性进行比较一方面检测复合物能否非特异性地提高靶细胞对的摄取率另一方面比较三种复合物对新生儿的免疫刺激活性届硕士学位论文第二部分第二部分复合物免疫增强作用的研究己侣旨件习具有细胞和种属特异性含核心序列的主要刺激小鼠的细胞含有’或心核心序列的能较好地激活小鼠皮下树突状细胞产生细胞因子翎“含’核心序列的对猪外周血单个核细胞具有最佳刺激活性免疫刺激活性除了与其核心序列结构特点密切相关外细胞对的摄取率高低是影响其免疫活性的关键因素同一对同一种属不同的细胞免疫刺激作用不同一方面是由于的结构特点决定的细胞特异性另一方面可能是由于不同细胞对的摄取率不同本实验旨在提高细胞对的摄取率以提高的免疫刺激作用考虑到带负电荷细胞膜表面也带负电荷阻止进入细胞我们试图利用带正电荷的多聚赖氨酸聚集形成图这样不仅可以携带更多的而且由于中和了所带的负电荷利于进入细胞提高细胞对的摄取率图与聚合示意图但是这种方法不能针对性地提高靶细胞对的摄取率利用具有细胞特异性的特点选择对靶细胞具有较强免疫刺激作用的，然后通过靶细胞受体介导将导向靶细胞针对性提高靶细胞对的摄取率增强对该类细胞的免疫刺激作用若届硕士学位论文第二部分欲提高体液免疫的时候可以用细胞相应受体的配体为靶弹头若欲提高细胞免疫可考虑以细胞上特异受体的配体为靶弹头细胞是一种重要的免疫活性细胞主要执行体液免疫功能新生儿脐血淋巴细胞的表型相对不成熟分泌低下抗体反应低下易于感染另有研究报道新生儿细胞具有较大的增殖及产生的潜力’本实验以新生儿脐血细胞为靶细胞选择配体为靶弹头希望合成的复合物能促进新生儿细胞尽快成熟增强细胞产生抗体的能力增强新生儿抵抗疾病侵犯的能力那么如何才能制成具有靶向性的复合物呢如何能将靶弹头和有效连接而又不改变的结构和生物学功能直接交联的方法如紫外交联法化学直接交联法都将影响到的化学结构和生物学功能我们考虑用分子偶联技术即利用交联剂乙基一一二甲基丙基碳二亚胺能促使与多聚赖氨酸发生缩合反应二者间形成酞胺键合成带正电荷通过正负电荷静电作用与带负电荷的形成复合物图图复合物合成及免疫作用示意图复合物通过识别主要表达于上的主动将导向细胞提高细胞对的摄取率摄取后介导信号传导刺激细胞分泌抗体届硕士学位论文第二部分实验结果一的合成情况取经浓缩管离心分离获得的进行电泳图图复合物及的分析复合物经可见泳道和泳道的上样孔中均有残留物未见条带泳道可见条带泳道既无残留物也未见条带由于考马斯亮蓝只使蛋白质显带核酸不显带所以泳道中未出现条带而泳道和泳道中因一分子量太大残留于孔中二者中的均与发生脱水缩合反应生成一没有未结合的所以未见条带一与结合比例的确定采用凝胶电泳阻滞实验确定与的结合比例当完全滞留于上样孔时二者结合比例最佳将按进行稀释分别取林与匹浓度林留绿色荧光标记混合进行琼脂糖凝胶电泳电泳迁移率如图所示第泳道为向正极泳动箭头示所在位置第泳道荧光集中于加样孔负极侧向负极拖带程度由泳道向泳道逐渐变浅届硕士学位论文第二部分第泳道样品同第泳道第泳道荧光集中于加样孔负极侧无明显的拖带第泳道荧光集中于加样孔正极侧向正极拖带图复合物的琼脂糖凝胶电泳一泳道和一稀释的各林分别与林浓度“的倪混合泳道同泳道泳道由于分子量太大在电场力作用下不能通过凝胶孔径不同比例的复合物均滞留于上样孔处一泳道中所带正电荷多于所带的负电荷所以可见向负极拖带泳道中二者电荷基本中和未见拖带泳道所带的负电荷多于所带的正电荷可见向正极的拖带所以的稀释比例最好于与之间它们与混合形成的复合物基本呈电中性这里采用泌稀释的与泌浓度林留混合形成的复合物研究其免疫刺激活性单个核细胞对的摄取情况显微镜观察细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光亮点图相差显微镜下细胞清楚可见图摄取荧光的细胞和未摄取荧光的细胞综合图见图其中荧光亮点为含有的单个核细胞不含荧光的细胞为未摄取届硕士学位论文第二部分的单个核细胞荧光显微镜观察相差显微镜观察届硕士学位论文第二部分明暗场综合图图单个核细胞摄取显微镜观察单个核细胞对摄取率分析不同刺激时间细胞对的摄取率流式细胞仪检测显示阴性对照组细胞对的摄取率为仪一复合物组中在刺激及时细胞对的摄取率为一组在相同刺激时间细胞对的摄取率为一组在上述刺激时间摄取率为由此可见复合物组中细胞对的摄取率远远高于组图届硕士学位论文第二部分单个核细胞中的表达情况川傀，从仁踌加肠妞合钧图单个核细胞中的表达情况。