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新型物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的应用进展陈义光;李铭刚;徐丽华;刘祝祥;夏振远;文孟良【摘要】综述了新型物理诱变方法离子注入(Ion Implantantion)、激光(Laser)和微波(Microwave)的生物学效应及其近年来在微生物诱变育种中的研究与应用.【期刊名称】《长江大学学报（自然版）理工卷》【年(卷),期】2005(002)005【总页数】3页(P46-48)【关键词】微生物诱变育种;物理诱变方法;离子注入;激光;微波【作者】陈义光;李铭刚;徐丽华;刘祝祥;夏振远;文孟良【作者单位】云南省微生物研究所,教育部微生物资源重点实验室(云南大学),云南,昆明,650091;吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南,吉首,416000;云南省微生物研究所,教育部微生物资源重点实验室(云南大学),云南,昆明,650091;云南省微生物研究所,教育部微生物资源重点实验室(云南大学),云南,昆明,650091;云南省微生物研究所,教育部微生物资源重点实验室(云南大学),云南,昆明,650091;吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南,吉首,416000;云南省烟草科学研究院玉溪农业研究所,云南,玉溪,653100;云南省微生物研究所,教育部微生物资源重点实验室(云南大学),云南,昆明,650091【正文语种】中文【中图分类】Q6-33;Q937以人工诱发基因突变为基础的诱变育种具有速度快、收效大、方法简单等优点，它是菌种选育的一个重要途径，在发酵工业菌种选育上具有卓越的成就，迄今为止国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大部分是人工诱变选育出来的。
近年来，虽然随着代谢控制理论、基因工程技术、蛋白质点突变技术等生物技术的发展，代谢控制育种、杂交育种，特别是基因工程育种在微生物育种工作中发挥着越来越大的作用[1～3]，但是，传统的(“经典的”)诱变育种仍是大多数工业微生物育种最重要、最有效的技术[4～6]。
微生物诱变育种的基本过程
一、筛选目的菌株
在开始微生物诱变育种之前，首先要确定育种的目标，并从中筛选出具有潜在优良性状的目的菌株。
这一步通常需要利用各种生理生化实验和分子生物学技术，对大量菌株进行初步的筛选和鉴定。
二、诱变处理
在确定了目的菌株之后，接下来需要进行诱变处理。
诱变处理通常包括化学诱变和物理诱变两种方式。
化学诱变使用化学诱变剂处理菌株，而物理诱变则利用物理因素（如紫外线、X射线、中子等）处理菌株。
这些诱变因素可以引起菌株基因的突变，进而产生新的性状。
三、突变体的筛选
经过诱变处理后，大量菌株中会存在各种突变体。
为了获得具有优良性状的目标突变体，需要进行筛选。
这一步通常采用各种筛选方法，如单菌落挑取法、稀释涂布平板法等，将突变体从大量菌株中分离出来。
同时，需要通过各种生理生化实验和分子生物学技术，对突变体的性状进行鉴定和筛选。
四、遗传稳定性检测
在筛选出目标突变体后，需要对其遗传稳定性进行检测。
遗传稳定性是指突变体在繁殖过程中，是否能够保持其优良性状的稳定性。
这一步通常采用连续繁殖法和稳定性测定法等方法进行检测，以保证突变体的优良性状能够在后代中得到保留。
五、生产能力测定
最后一步是测定突变体的生产能力。
生产能力是指突变体在实际生产过程中，能否产生足够的产物并保持稳定的产量。
这一步通常采用发酵实验和产物分离纯化等方法进行测定，以保证突变体在实际生产中具有实用价值。
微生物的变异原理及应用1. 引言微生物变异是指微生物在自然界或实验条件下经过长期的演化过程中，产生了与亲代微生物有明显遗传差异的后代微生物。
微生物的变异一直是微生物学研究的重要领域，对于理解微生物的遗传变异机制以及应用于实际生产具有重要意义。
2. 微生物变异的原理微生物的变异是由于其基因发生了突变所导致的。
微生物的遗传信息存储在其DNA分子中，当DNA发生突变时，这些变异基因就会在后代中得以保留和传递。
微生物的突变可以分为两种类型：自然突变和诱变突变。
2.1 自然突变自然突变是指在微生物的自然生长过程中产生的突变。
这些突变通常是由DNA 复制错误、化学修饰、或者DNA损伤修复过程中发生的。
自然突变是微生物进化的基础，也是微生物遗传变异的主要来源之一。
2.2 诱变突变诱变突变是指通过人工手段诱导微生物基因发生突变。
这种突变方法可以通过化学物质、物理因素或者基因工程技术来实现。
诱变突变可以加速微生物的遗传变异进程，从而产生更多的变异体，为微生物的应用提供新的可能性。
3. 微生物变异的应用微生物变异的应用广泛涉及到农业、食品工业、药物研发以及环境修复等领域。
下面列举了几个常见的应用案例：3.1 作物育种通过微生物变异技术可以对作物进行改良育种，以获得具有抗病虫害、耐逆性和高产性的新品种。
例如，通过诱变突变可以筛选到抗除草剂的小麦品种，从而降低农药使用量，减少对环境的污染。
3.2 食品发酵工业微生物的变异在食品发酵工业中具有重要的应用价值。
通过对工业菌株进行诱变突变，可以提高其代谢能力和产酶能力，从而提高发酵过程的效率和产量。
例如，诱变突变后的酿酒酵母可以产生更多的酒精，提高酒的酿造效率。
3.3 药物研发微生物变异在药物研发中也起到了重要的作用。
通过诱变突变，可以获得抗生素产生菌株或者高效酶制剂的产生菌株。
这些变异菌株可以用于生产药物原料或者制备酶制剂，为药物研发和生产提供了新的资源。
3.4 环境修复微生物变异技术在环境修复领域也有着广泛的应用前景。
微生物诱变育种技术介绍了微生物诱变育种的各种方法，对经典的诱变技术、复合诱变和新型的诱变技术等处理方法进行了比较。
对离子注入法和等离子体诱变育种等新型诱变育种技术的机理进行了阐述，并对其优缺点以及潜在的研究方向进行了论述。
标签：微生物诱变；离子注入法；等离子体诱变微生物诱变育种是一种基因突变技术，通过技术手段改变微生物的遗传结构和功能，进而筛选出具有特定性状的，优良突变型微生物。
这种育种方式，具有较高的微生物变异率，变异速度快，效率高等优点，是食品加工和医药生产等工业的首选方法。
常用的微生物诱变育种方法包括物理法、化学法和生物法等，其中物理法诱变包括：紫外诱变、X射线诱变和γ射线诱变等，化学法诱变包括烷基磺酸盐和烷基硫酸盐、亚硝基烷基化合物、次乙胺和环氧乙烷类和芥子气类），生物法包括基因转导、基因转化和转座子诱变等。
复合诱变是指采用两种及以上的诱变方法，对微生物进行诱变，制的目标菌株。
通常仅采用一种方法进行诱变，会使微生物产生抗性，从而降低突变率，复合诱变具有补充不同诱变方法之间缺陷的优势。
近些年涌现出一批创新的诱变技术，如离子注入诱变法、大气压冷等离子诱变，其中离子注入诱变法具有与复合诱变相似的特性，日趋成为研究诱变技术的主流方向。
原生质体是包含细胞膜和膜内细胞质及其他具有生命活性细胞器的生物质，对于微生物来说即去除细胞壁的细胞。
原生质体也可以作为诱变的对象，其对外界敏感度很高，因此变异率也很高。
1 经典诱变技术1.1 物理诱变1.1.1 紫外诱变DNA由以嘌呤和嘧啶为碱基的核苷酸组成，紫外线诱变可以使嘧啶形成二聚体，DNA在复制和转录时，因存在嘧啶二聚体而不能分离，进而发生变异。
该方法简单、操作安全且诱变率高，其缺点：诱变原理简单，引起的突变单一，形成的突变体类型较少，而对于基因损伤及其修复的研究却很有意义。
现在，对于细菌、酵母菌或霉菌的紫外诱变往往是对其原生质体的诱变，缺少了细胞壁对细胞的保护，紫外线可以更直接的作用于DNA，提高突变率，从而产生更多的突变体和表现型。
微生物诱变育种的方法微生物，这小小的生物世界里的居民，有着大大的能量。
而诱变育种呢，就像是给微生物来一场奇妙的变身之旅。
物理诱变是一种常见的法子。
紫外线就像是微生物世界的严厉教官。
微生物们在紫外线的照射下，就如同小士兵接受艰苦的训练。
紫外线那强烈的能量，会打乱微生物内部的基因结构。
比如说一些细菌，原本规规矩矩地按照自己的基因蓝图进行生长繁殖，紫外线一照，就像打乱了建筑图纸一样，基因里的一些部分发生了错乱。
有的微生物在这错乱中就产生了新的特性，也许原本不会产生某种特殊酶的，经过紫外线照射后就有了这种能力。
还有X射线，这可是更厉害的家伙。
如果把微生物比作是一个精密的小机器，X射线就像一把强力的干扰器。
它能深深钻进微生物的内部，对基因进行破坏和重组。
就像把小机器里的一些零件拆下来又重新组装，只不过这里是在基因层面。
有的微生物经X射线诱变后，抗逆性变强了。
原本在稍微恶劣一点的环境里就奄奄一息的，现在能坚强地活下去，而且还活得挺好。
化学诱变也不甘示弱。
化学诱变剂就像是给微生物的基因施魔法的小巫师。
像亚硝酸，它悄悄地接近微生物的基因，把基因里的一些碱基偷偷换掉。
这就好比在密码锁上换了几个密码数字，整个密码锁的开锁方式就可能完全变了。
微生物的基因表达也就随之改变。
一些霉菌经过亚硝酸诱变后，产孢子的能力可能大大增强，原本产一点点孢子的，现在像开了挂一样大量产孢子。
再说说碱基类似物，它们是伪装高手。
它们混入微生物的基因大厦里，伪装成正常的碱基。
可是一旦到了基因复制的时候，就开始捣乱了。
就像一个假零件混进了真零件堆里，在机器组装的时候就会出问题。
这种捣乱会导致基因复制出错，从而产生突变。
有的酵母菌经过碱基类似物的诱变后，发酵能力变得超强，能产生更多的酒精或者其他有用的代谢产物。
复合诱变就像是给微生物来一套组合拳。
先给微生物来点物理诱变，就像先给它一个下马威，打乱它的基因阵脚。
然后再用化学诱变，进一步在混乱的基因里搞点新花样。
工业微生物菌株的筛选和优化随着科技的发展和产业的进步，微生物技术在各个领域有着广泛的应用，特别是在食品、医药、化工和能源等行业中，微生物发酵技术已成为一种十分重要的生产手段。
而工业微生物菌株的筛选和优化则是微生物技术的核心内容之一，对于提高生产效率和生产品质具有至关重要的意义。
一、工业微生物菌株的筛选微生物菌株的选择是微生物发酵工程成功的重要保障。
筛选过程一般包括以下几个方面：（一）来源选择：优秀工业菌株的来源有广泛性、经济性、实用性和安全性四个关键因素。
因此，在工业菌株的来源选择时，应考虑菌种的稳定性、生产的可行性和成本，保证菌株来源的安全性。
（二）物理诱变选择：物理诱变是一种经济实用的菌株改造方法。
常用的物理诱变方法有辐射、超声波、电场、激光、磁场等。
诱变方法的选择要考虑影响因素和目标菌株发酵特性，使其易于操作和管理。
（三）化学诱变选择：化学诱变是微生物菌株改造的另一种方法。
化学诱变包括化学药剂、自然化合物和代谢产物诱变等。
化学诱变可选择产物质量好、糖利用率高、菌液颜色明亮等具体特性的工业菌株。
（四）分子手段筛选：PCR技术、DNA微阵列技术、蛋白质组学等分子生物学手段可以使菌株筛选具有更高的速度和精度，为合适的工业菌株寻找合适的培养条件。
二、工业微生物菌株的优化菌株选型和参数优化是工业微生物发酵成功的关键。
针对具体企业及其工艺要求，对筛选出的菌种进行优化设计，能够提高微生物菌株产量和产品质量，降低生产成本。
针对菌株优化，可以从以下三个方面着手：（一）发酵条件优化：针对具体的菌株，合理调整发酵产物的pH值、温度、气体组成和培养基组分等条件，会使菌株发酵速度更快，产出的产物品质更好。
（二）营养物质优化：灭菌处理后加入的微生物营养成分显著影响微生物的生长和代谢，应根据需求提供营养物质，满足微生物各个生长阶段的需求。
（三）菌株调控优化：菌株调控优化可通过构建对菌株生长有一定抑制作用的遗传工程菌株、抗拒逆境菌株等，从而达到优化和提高微生物菌株产量和质量的目的。
南开大学物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的应用物理科学学院1110293尚彤彤2012/12/8摘要：综述了紫外线、空间诱变、离子注入、激光四种物理诱变方法的原理与应用物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的应用物理科学学院1110293 尚彤彤目前，随着人口的增多和资源的匮乏，开发新能源或者提高资源利用率和回收率等成为人们研究的重点。
微生物在解决人类的粮食、能源、健康、资源和环境保护等问题中发挥着越来越重要且不可替代的独特作用，也为人类带来了巨大的社会效益和经济效益。
但微生物菌种的自然突变率很低，单纯依赖自然突变选育好的菌株远不能满足人们的需求，为了获得高产、低耗、优质的菌种，人们常常通过外界物理、化学、生物因子等因素的改变诱发基因突变。
常用的诱变方法包括物理诱变和化学诱变。
传统的物理诱变是利用各种射线（包括紫外线、X射线、γ射线、快中子、微波、超声波、电磁波和宇宙射线等）为诱变源，对生物靶进行诱变。
近年来，又兴起一些新型高效的诱变方法，如空间诱变、离子注入诱变、激光诱变等，他们操作简单、安全，而且具有突变谱宽和在一定程度上能克服菌种对传统诱源的抗性饱和等优点。
下面介绍一些物理诱变原理及其应用。
1、紫外线诱变原理：DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力，最大的吸收峰在260nm。
紫外线可使DNA分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对，引起突变或死亡。
嘧啶二聚体的形成还会妨碍DNA双链的解开，影响其复制和转录。
应用：在食品方面，它是最常用的技术，因为它操作简单且效果明显。
比如以谷氨酸棒杆菌FC22为出发菌株，经过紫外线诱变（15W紫外灯，照射距离30cm，时间为20s），定向选育出具有磺胺胍抗性的突变株，其L-色氨酸产量比原菌株产量提高了110%；对产曲酸的米曲霉菌株、抗噬菌体保加利亚杆菌、浓香型枸杞久酿造酵母等进行紫外线诱变选育均取得了较理想的成果。
同时很多研究者将紫外诱变结合其他诱变方式配合使用，更是产生了突出的效果。
比如将紫外线与硫酸二乙酯结合使进行复合诱变，筛选到了巨大芽孢杆菌突变株8B，其α－淀粉酶和蛋白酶活性性较出发菌株分别提高96.4%和126.58%，突变株经5次传代后，性能保持稳定。
邹建忠交叉采用紫外线照射和光复法对酒精酵母进行诱变，获得1株耐高温型酒精酵母UT，在40℃下，其产酒率比出发菌提高了11.1%，1且对温度、酸度和盐度变化的耐受力也更好。
环境工程方面，随着工农业的发展，化肥和化工品的大量使用，有机废物的排放量不断增大，难降解的有毒有机物的排放量不断增多，高耐毒性、高降解活性以及特异或光谱降解污染物的特殊细菌用于处理特殊污水，并且起到很好的效果。
近年来有一种新的理论认为活性污泥是一个微生物的生态群体，这些微生物存在着紫外线敏感性差异，适当的紫外线辐射会改变活性污泥的微生物组成结构。
紫外线增强活性污泥的生化降解能力，实际上是利用紫外线抑制活性污泥中的非目标菌群的生长，消除目标菌群在污水中的营养物质竞争对手，优化目标菌群的生长环境，最终达到所需要的增强效果。
2、空间诱变育种原理：空间诱变育种是指利用返回式卫星、飞船或高空气球将生物材料搭载到太空, 利用太空特殊的环境对生物材料进行诱变, 再返回地面选育新种质、培育新品种的生物育种新技术。
高空条件下的微重力水平、真空度、质子与电子辐射强度均较高, 其大气结构、气温、空气密度、压力、地磁强度、辐射流均与地面有很大差异, 另外, 还有强烈的紫外线照射等。
这些空间条件都有可能引起微生物发生遗传性变异。
一般认为太空辐射和微重力是空间育种的主要诱变因素。
空间突变的最大特点是突变频率高、突变谱广、变异幅度大、变异性状稳定快, 可获得传统诱变难以得到的有益突变, 从而明显改良微生物某些特性。
应用：对经历了太空飞行的利用木糖产L - 乳酸的野生菌株进行筛选后, 得到1株正向突变菌株Lt- s, 其L - 乳酸产量较出发菌株提高约12. 0%；对经航天诱变的啤酒酵母菌进行复壮和筛选, 得到了1株发酵力、生长速度都好于出发菌株的突变体；对从SF8卫星搭载的4个酿酒酵母样品中筛选到的酵母突变株进行研究, 发现与原始菌株相比, 突变株2. 0016 - M 各项指标增加均达极显著水平(P < 0.01), 其中生物量增加46. 7%, 细胞壁占酵母干重比率增加3. 8%, 细胞壁厚度增加62. 6%, β- 葡聚糖含量增加146. 8%, 甘露聚糖含量增加18. 8%, 而突变株FL03- M 的生物量变化不显著, 其他各项指标都显著降低[21]。
可见空间诱变是提高酵母菌株细胞壁多糖含量的一种有效手段, 但不同酵母菌株对空间环境的敏感性不同。
随着空间诱变机理研究的深入, 相信这一技术将会更好地为食品工业微生物育种服务。
3、离子注入诱变原理：离子注入是一种新型诱变方法，自国外六十年代中后期相继把离子注入技术应用于生物学领域的研究。
由于目前研究水平和研究手段的限制，低能离子生物学的研究主要侧重于对离子注入诱变机理的探索和对生物效应的研究两方面。
离子束特别是低能离子束对微生物有着很好的诱变作用, 低能离子注入生物体组织或细胞, 从而使染色体产生变异的效应包括以下四个过程: 能量沉积、动量传递、质量沉积和电荷交换。
低能离子束具有很强的致突变作用, 并具有射程的可控性、集束性和方向性,能够显著提高生物的变异率, 获得损伤轻、突变率高、突变谱广的诱变结果。
离子注入与传统的X射线、C射线等其它辐射源相比, 具有很多优势: 传能线密度大, 生物生化作用强, 主要效应是局部可控可选择, 辐照的离子参数多种多样, 离子束作用的损伤通常不易修复, 突变体稳定快, 突变率较高。
目前, 离子注入技术已广泛应用于水稻、小麦、玉米、棉花、蔬菜、瓜果、花卉等作物并已初见成效, 获得了常规辐照处理难以产生的罕见变异, 且变异幅度大, 频率高, 良性变异多, 后代稳定快。
应用：利用离子注入进行食品微生物菌种改良已在生产实践中得到广泛的应用。
高艳红等对高耐铬性啤酒酵母菌株进行N+ 注入诱变, 当注入剂量达到一定值时, 得到1株高产GTF的啤酒酵母菌株M 11- 1A11, 其富铬能力较诱变前提高了22. 4%, 且遗传性能稳定。
沈加成等将N+ 注入棘孢曲霉L22, 筛选得到1株突变株NIP35, 其β- 葡萄糖苷酶活性提高1倍, 产酶水平最终提高了近2倍 ; 李文等为了获得可用于原位分离藕联发酵的耐乳酸菌株, 以米根霉为出发菌株, 在投糖浓度为50 g /L、氮源为3. 0 g /L尿素的条件下, 进行离子注入选育, 得到L ( + ) - 乳酸耐酸菌株RK4002, 不添加中和剂, 经30 h的摇瓶发酵, 其L ( + ) - 乳酸产量为出发菌株的1. 7倍, 且可在24 g /L的耐乳酸平板上生长。
传统的离子诱变技术主要使用单一的离子源进行诱变, 而佘涛等用T i+ 注入和N+ 注入交替对番茄红素生产菌株三孢布拉霉进行诱变选育, 得到1株高产菌株,其产番茄红素的能力提高了25%, 因此认为不同种类离子源交替诱变的效果优于单一离子诱变。
4、激光诱变原理：激光辐射通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合作用，直接或间接的影响生物有机体，热效应引起酶失活、蛋白质变性，导致生物的生理、遗传变异；压力效应使组织形变、破裂，引起生理及遗传变异；电磁场效应产生自由基导致DNA损伤，引起突变；光效应是通过一定波长的光子被吸收，跃迁到一定能级，引起细胞DNA或RNA、质粒、染色体畸变效应，酶的活化或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变。
光量子引起细胞内等所含无中的任何物质一旦发生改变，都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异。
但传统低功率长脉冲He-Ne激光诱变方法存在易损伤细胞活性、突变率低、突变无方向性、育种周期长等缺陷，所以飞秒激光成为了人们重点研究对象。
在这里，我想重点介绍一下飞秒激光在诱变育种中的应用。
飞秒激光由于其脉冲持续时间短、瞬时功率大、聚焦尺寸小的特点，其在微生物诱变方面有着独特的优势:（1）脉冲时间与生物化学反应时间相同飞秒（1510 s）超短的时间范围正好是基本的化学反应和分子内电子和原子核运动的时间范围，如化学反应中化学键的断裂或形成，分子重排形成新分子，能量从一个分子传递到另一个分子等过程。
随着Zewail最早利用飞秒激光研究化学反应的动力学过程而被授予1999 年的诺贝尔化学奖，人们已经在飞秒化学生物领域有了较大进步，尤其飞秒技术已经被用于研究DNA 中电荷传递及质子传递过程。
所以超短飞秒脉冲辐射微生物细胞时能从微观角度影响到生物新陈代谢过程中各种生物化学反应，从而促进变异概率的提高。
（2）高能光子与生物组织作用强烈飞秒激光由于其高峰值功率，在与微生物细胞相互作用时引起细胞器或细胞内分子对激光能量的非线性吸收，这种非线性吸收在焦点处产生高激发的等离子体。
由于在等离子体产生的过程中会产生活性自由基，它们易与细胞内的蛋白质、酶和DNA发生化学反应，影响生物代谢，从而增强了变异的效果。
（3）DNA定点切除近红外飞秒激光系统（重复频率为80 MHz，波长为800 nm，能量2 nJ）已被用于破坏人类染色体上的高浓缩的DNA 和单个伸展的DNA 分子的染色体组对于微生物（尤其原核生物）来说，由于DNA 分子只有一条或者几条，又由于飞秒激光聚焦小，在显微镜下可以对微生物的DNA 进行飞秒激光定点切除、移植等操作。
此种方法针对性强、精确度高，使突变更有目的性，避免了目前大多激光诱变“黑箱子操作”的盲目性，能够有效的减少后续高通量筛选高产优质菌株的工作量。
（4）细胞损伤小大多数细胞在700～1100 nm波长范围内吸收系数小，散射系数小，因而几乎是透明的，因此近红外飞秒激光对细胞的穿透深。
并且当飞秒激光聚焦于微生物细胞时，聚焦处的光强非常高，足以引起非线性吸收，但聚焦处附近的热影响非常小，飞秒激光对邻近细胞几乎没有损害（温度升高小于10－5 K），且不影响细胞活性，而紫外和可见光不仅穿透深度小，且对活细胞的损坏严重。
其作用机理为：（1）多光子吸收机理DNA吸收多个飞秒激光光子后，或者直接被离子化，或者发生能量堆积，产生电子迁移效应后，最终导致DNA单链或者双链的损伤与断裂。
（2）等离子体的形成机理高峰值功率的飞鸟激光光束与微生物与细胞内生物大分子作用是，处于基态的原子吸收光子后能量跃迁到高能级，形成主要由电子、离子、激发态的原子、分子和自由基等组成的低温等离子体，等离子体效应可使生物大分子的化学键发生改变，导致突变的发生。
（3）生物活性氧产生机理飞秒激光能激发细胞产生活性氧，即自由基，如过氧化氢、羟自由基和单线态氧等，而自由基的存在会导致DNA 单链断裂和碱基损伤。
