HIV1假病毒系统的构建及应用

假病毒技术用于抗HIV_1药物筛选及抗药性分析

H IV 在全球范围内流行一直是对人类健康的一个重大威胁, 而人类在对 H IV 疾病的预防和治疗方面的研究进展相对缓慢。目前治疗艾滋病唯一可供选择的方法是 HAART ( h igh ly active an tiretrov iral therapy ) 法 [3 4]。由于 H IV 抗药性的不断产生, 使得现有的治疗方法往往难以达到预期的治疗效果。因此开发新的抗 H IV 药物以及对病毒进行抗药性分析对于提高 H IV 疾病的治疗效果至关重要。而常规的研究方法在实验过程中需要使用具有高危险性的 H IV, 因此对实验室条件
2010, 30( 3)
谢桂煌等: 假病毒技术用于抗 H IV 1药物筛选及抗药性分析
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制在宿主细胞中表达报告基因。在报告细胞型系统中, 报告基因被引入到靶细胞系中。如 TZM b l细胞系便是一种能够表达 Lu c基因的报告细胞系, 它能在 H IV T at蛋白的诱导下表达荧光素酶, 并可以通过这种途径来反映假病毒在宿主细胞中的复制情况。
中国生物工程杂志 China B io techno logy, 2010, 30( 3) : 95 99
综述
假病毒技术用于抗 H IV 1药物筛选及抗药性分析*
谢桂煌 1 赵声兰 2 陈朝银 1**
( 1 昆明理工大学 /清华大学生物资源开发工程研究所昆明 650224 2 云南中医学院昆明 650200 )
3 H IV 1假病毒感染细胞系统的应用
3. 1 应用于筛选抗 H IV 1药物由于 H IV 1假病毒在感染细胞和细胞内复制循环
过程中的很多环节与野生型病毒相同, 因此被越来越多地应用于抗 H IV 1 药物的筛选及药物抗病毒效果的评价。与此同时, 利用假病毒系统进行药物评价的准确性和可行性也同样受到广大学者的关注。 H eynd rickx等 [ 5]为了证明利用 H IV ENV /H IV env型假病毒分析系统进行药物抗 H IV 效果评价所获得的结果具有生物相关性, 构建了 3种抗 H IV 药物评价系统。这 3 种系统分别是 ( 1 ) 复制病毒在外周血单核细胞 ( PBM C s) 中培养。 ( 2 ) 对应假病毒在表达 CD4 和 CCR5 /CXCR 4共受体的 Ghost细胞中培养。 ( 3 ) 对应假病毒在外周血单核细胞 ( PBM Cs) 中培养。在这三个系统中来比较作用于不同靶位的 6种抗 H IV 参考药物 ( T 20, TAK779, AMD3100、BM S806、AZT 和 E fav iren z) 对 5 种处于不同进化枝的病毒分离株的抗病毒活性。使用 JM PV ers ion 5. 0 软件对实验数据进行线性回归分析后发现, 两种使用单轮感染循环的假病毒系统之间具有重要的线性相关关系 ( P < 0. 000 1, R = 0. 866 1 )。同时与复制病毒系统相比, 这两种系统增强了抗病毒实验的敏感性 (分别为 P = 0. 013 和 0. 015) 。最重要的是, 在两种假病毒系统中, 不管是假病毒在 Ghost细胞中培养 ( P < 0. 000 1, R = 0. 782), 还是假病毒在 PBM C s 中培养 ( P < 0. 000 1, R = 0. 742 )所得到的结果都与理论上预料的结果一致。同时通过分析进入抑制剂 BM S806的 5 种衍生物对具有不同 H IV 亚型包膜假病毒的抗病毒活性, 进一步证明假病毒系统的有效性。香港 HKU 巴斯德研究所的 Garcia等 [ 8] 设计了 V SVG / H IV env和 H IV ENV /H IV env两种假病毒模型来构建抗病毒药物筛选系统, 使用已知抗 H IV 药物作为对照, 筛选作用于 H IV 进入细胞后复制循环靶位的抗 H IV 1 药物。同时, 通过采用对样品化合物进行正交组合的方法来优化实验方案, 建立了一种高通量的药物筛选平台, 从 48 000种化合物中成功的筛选出 6种在细胞水平具有抗 H IV 活性的阳性药物。并且使用一种野生型

HIV-1假病毒包装及感染条件优化

实验，同时对感染过程中假病毒接种剂量与二乙氨乙基葡聚糖（ＤＥＡＥ — Ｄｅｘｔｒａｎ）使用浓度进行了优化。结果在包装过程粒与ｅｎｖ真核表达质粒转染比例为４：１、转染试剂与质粒比例为３：１，转染后培养４８ｈＨＩＶ－１假病毒的滴度
关键词：人类免疫缺陷病毒；假病毒；包装方法；二乙氨乙基葡聚糖
ＤｏＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－９４５５．２０１７．１５．００３文献标志码：Ａ文章编号：１６７２ — ９４５５（２Ｏ１７）１５－２１７２－０３
（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，ＢｅｉｊｉｎｇＤｉｔａｎＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｏｆＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／ＢｅｉｊｉｎｇＫｅｙ
ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｐａｃｋａｇｅａｎｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＨＩＶ－１ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄｖｉｒｕｓ
ＣＨＥＮＤａｎｙｉｎｇ，ＬＩＲｕｉ，ｚＨＡＮＧＹｕｅ，ＳｏＮＧＣｈｕａｎ，ＨＡＮＪｕｎｙａｎ，ＺＨＡＮＧＹｕａｎｙｕａｎ

HIV假病毒的制备及感染性检测

假病毒包装和检测方法，假病毒感染CEM细胞来源: 日期：2011-4-11(共有0 条评论) 我要评论我们现在以一个具体的实例来说明假病毒的包装和检测方法。

(一)材料1．质粒pNL-Luc-R-Env-或pNL-Luc-R+Env-：质粒包含HIV-1前病毒克隆pNL4.3的大部分基因组，荧光素酶基因Luc代替了HIV的nef基因，HIV的env基因发生了移码突变，R-为vpr基因发生了移码突变，使宿主细胞生长不能到达G2期。

pSV7d-Env：质粒把HIV-1的外壳蛋白基因(如HXB2、JR．FL、ADA、BAL的env基因)插入质粒载体pSV7d。

两个质粒为Amp抗性，都可以转化大肠杆菌细胞进行扩增。

2．细胞系和培养基HOS细胞或U87细胞的培养基为DMEM／10％FBS／1％青霉素／链霉素。

悬浮细胞的培养基为RPMI／10％FBS／1％青霉素／链霉素。

一般情况下，需要加入puromycin(1ug／m1)来维持共受体分子的长期表达。

3．Ca3(P04)2转染试剂2×HBS：1．0g HEPES、1．6g NaCl、0．074g KCl、0．025g Na2 HP04。

加去离子水至100ml，调pH至7．05～7．15，灭菌后4~C保存；2．0mol／L CaC12：29．40g CaCl2.H2O，加去离子水至100ml，灭菌；去离子水，灭菌。

4．感染试剂和荧光素酶检测试剂Polybrene(Sigma)8mg／ml溶于PBS，-20℃保存；荧光素酶检测试剂盒(Pro-mega)。

(二)方法1．假病毒粒子的包装1)转染前一天，传293或293T细胞至10cm培养皿，细胞数为2×10^6个／10ml DMEM ／10％FBS2)用10ug的pNL-Luc-R+Env-和10ug的pSV7d-Env两个质粒共转染293细胞。

转染前纯化质粒，用乙醇沉淀质粒再用450ul去离子水重悬这两个质粒，加入70ul的2．0mol ／L CaCl2，再逐滴加入500u1的2×HBS，冰上静置30min，逐滴加人293细胞中；3)转染24h后换培养基；4)转染48h后收上清，用0．45umol／L的滤膜过滤细胞沉淀；5)分装成lml小管，一80℃保存，取少量检测p24蛋白含量或逆转录酶含量。

假型病毒制备与应用进展

第 32 卷第 6 期 2010 年 6 月
中国预防兽医学报
Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine
Vol. 32，No.6 Jun. 2010
假型病毒制备与应用进展
张振杰，崔丽娜，张元鹏，赵协，王亮，常维山 *
(山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018)
中图分类号：S852.61
文献标识码：B
文章编号：1008-0589(2010)06-0495-04
假型病毒 (Pseudotyped virus) 是利用现代生物技术人工合成的一种病毒，它与真病毒相比不仅囊膜上具有其他病毒的糖蛋白，而且核酸分子上编码囊膜蛋白的基因被删除，所以这种病毒只能进行“一个细胞周期”的侵染，在慢病毒表达高度发展基础上[1]，确保了假型病毒的生物安全性。一般在研究传染性强和不易体外培养的病毒囊膜蛋白的功能和性质时，制备假型病毒是一种行之有效的方法。假型病毒可以模拟真病毒的侵染，它的应用一定程度上避免了高致病性病毒的传播和扩散，在病毒学研究方面显示出许多优势。另外，具有复制功能和非竞争性的假型病毒载体能够在体外高效地转移靶基因于哺乳动物细胞，并且假型病毒宿主范围广、转染效率高、滴度高[2]、不易被血清补体灭活。因此假型病毒不仅可以用来研究病毒与宿主细胞的相互作用，鉴定病毒受体，更重要的是可以用于筛选抗病毒药物、测定患者体内中和抗体的效价、评价疫苗临床免疫的效果和作为基因治疗工具。
2010 年
有几种假型病毒侵染系统已经成功的建立，如鼠白血病病毒 (MuLV )/ 猪瘟病毒 (CSFV-E )、 VSV-G/MuLV、 HIV/ H5N1 (禽流感)-HA 等[8]。

HIV-1假病毒的研究进展

和特性往往不同，过不同途径或不同方法获得的通不同毒株很难进行评价、比评估。因此，立一个对建准确、可重复性的中和抗体检测方法对于研究中和病毒的机制是至关重要的。选择最佳的中和实验方案需要考虑的技术因素主要包括：检测病毒株的所细胞嗜性和细胞毒性作用、实验步骤的复杂性、工作量和费用。目前，过分子克隆获得的假病毒越来通越受到研究者的青睐。原因之一是非克隆病毒可能在多次传代后发生改变，用克隆化的实验材料则使
避免了这方面的可变因素。可以说，稳定的质粒以
我国主要流行的ＣＦ７０一ＣＢ、ＲＦ１Ｅ亚Ｒ０／８Ｂ、 ’ Ｃ０一Ａ型假病毒的工作 ¨ 而且初步建立了基于假病毒系，统的中和抗体的检测方法，也有报道应用假病毒技术研究ＨＩｖ一１制抑制剂ｌ用假病毒检测体复２。系应用于抗ＨＩ药物的检涮。但是，国ＨＩ假ｖ我ｖ
【ｅｏｄ］Ｖ；ｓｕｏｉｓｓＥｖＫｙｗｒｓＨＩＰｅｄｖｒｅ；ｎｕ
假病毒是一种病毒的核酸由另一种病毒编码的包膜蛋白所包被，而形成的具有外源性病毒囊膜，从
而基因组保持着逆转录病毒本身基因组特征的病毒。通常是将携带有某一种病毒囊膜蛋白基因的载体和携带另一种病毒核衣壳骨架基因的载体共转染

hiv的结构及作用机理

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus;abbr:HIV),即艾滋病(AIDS,获得性免疫缺陷综合征)病毒,就是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。

1983年,人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。

它就是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(Lentivirus),属逆转录病毒的一种。

HIV通过破坏人体的T淋巴细胞,进而阻断细胞免疫与体液免疫过程,导致免疫系统瘫痪,从而致使各种疾病在人体内蔓延,最终导致艾滋病。

由于HIV的变异极其迅速,难以生产特异性疫苗,至今无有效治疗方法,对人类健康造成极大威胁。

2015年3月4日,多国科学家研究发现,艾滋病毒已知的4种病株,均来自喀麦隆的黑猩猩及大猩猩,就是人类首次完全确定艾滋病毒毒株的所有源头。

[1]来源编辑2015年3月4日,多国科学家研究发现,艾滋病毒已知的4种病株,均来自喀麦隆的黑猩猩及大猩猩,就是人类首次完全确定艾滋病毒毒株的所有源头。

已知艾滋病毒毒株共有4种,分别就是M、N、O、P,每种各有不同源头,其中传播最广的M与N早已证实来自黑猩猩,但较罕见的O与P则就是到后来才被证实O与P均就是来自喀麦隆西南部的大猩猩。

全球至今只有两宗P型病例,O型亦只有10万人,主要集中在中西非。

[1]形态特征编辑形态结构人类免疫缺陷病毒直径约120纳米,大致呈球形。

病毒外膜就是类脂包膜,来自宿主细胞,并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41;gp41就是跨膜蛋白,gp120位于表面,并与gp41通过非共价作用结合。

向内就是由蛋白p17形成的球形基质(Matrix),以及蛋白p24形成的半锥形衣壳(Capsid),衣壳在电镜下呈高电子密度。

衣壳内含有病毒的RNA基因组、酶(逆转录酶、整合酶、蛋白酶)以及其她来自宿主细胞的成分(如tRNAlys3,作为逆转录的引物)。

编码基因病毒基因组就是两条相同的正链RNA,每条RNA长约9、2-9、8kb。

两端就是长末端重复序列(long terminal repeats, LTR),含顺式调控序列,控制前病毒的表达。

新型HIV-1核酸定量内标构建及验证

苷酸，经Ｇａｔｅｗａｙ重组得到含突变碱基的ｐＮＬ４３一ＡＥＮＶ－ＬＵＣ — ＡＴＴＲ表达载体，该载体与水泡性口膜炎病毒（ＶＳＶ）质粒共转染２９３细胞４８ｈ后收集上清中ＨＩＶ－１内标假病毒颗粒，检测ｐ２４抗原含量，定量假
ｂａｓｅｂｙＧａｔｅｗａｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＴｈｉｓｖｅｃｔｏｒａｎｄＶＳＶｐｌａｓｍｉｄｗｅｒｅｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏ２９３Ｔ
Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｂｅｏ＇ｉｎｇＹｏｕ＂ａｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｏ＇ｉｎｇ１０００６９，Ｃｈｉｎａ
ｓｔａｎｄａｒｄｂａｓｅｄｏｎｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓｐ２４ｒｅｇｉｏｎｗａｓｍｕｔａｔｅｄｗｉｔｈｏｕｔｃｈａｎｇｉｎｇｐ２４ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ
段：获得仅具有１次感染性的ＨＩＶ－１假病毒颗粒（３．６１×１０ＩＵ／ｍ１）；ｐ２４抗原检测含量为２８３．２ｐｇ／ｍｌ；

HIV1+Gag蛋白的重组、表达与应用

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得酉ｊＥ太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

学位论文作者签名：卫ｐ回签字日期：狮｛‘年ｒ月／ｏ日摘要获得性免疫缺陷综合症（ａｃｑｕｉｒｅｄｉｍｍｕｎｏｃｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ．ＡＩＤＳ）是当今世界影响最大，危害也最大的疾病之一，它的防治迫在眉睫。

人类免疫缺陷病毒（ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）是ＡＩＤＳ的病原体，其中编码核，Ｉｉ，蛋白的ｇａｇ基因是ＨＩＶ基因中最保守的一段。

含有ｐ２４和ｐ１７的核心蛋白，又称Ｇａｇ蛋白具有一定的抗原性，而且抗Ｇａｇ蛋白的抗体是ＨＩＶ感染后可从血液中最早检出的抗体，因此ＨＩＶ－Ｇａｇ蛋白对ＡＩＤＳ的检测有着重要的作用。

本文主要是对ＨＩＶ－ｇａｇ基因的重组、表达和应用进行了研究。

目的研制ＨＩＶ抗体诊断试剂。

方法根据从Ｇｅｎｂａｒｔｋ上查询到的ＨＩＶ－ｇａｇ基因的序列，分别设计了上游引物（ｇａｇＦ）：５＇－ＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡ一３’和下游引物（ｇａｇＲ）：５＇－ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＴＣＧＴＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＴＧＡ一３’。

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）的方法从ＨＩＶ－１的基因中扩增出ｇａｇ的ＤＮＡ。

经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将ｇａｇ的ＤＮＡ插入表达载体ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ质粒中，构成重组的ｇａｇ－ｐＴｒｅＨｉｓ２Ａ质粒。

将此重组质粒转化原核表达菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）中，用异丙基一Ｂ—Ｄ．琉代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达。

表达的蛋白用Ｎｉ”亲和层析柱纯化后做ＳＤＳ．ＰＡＧＥ检测，以及蛋白印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，Ｗｂ）和间接ＥＬＩＳＡ实验的应用研究。

一种新的HIV-1潜伏感染模型的建立方法

一种新的HIV-1潜伏感染模型的建立方法摘要】本研究在原有工作基础上进一步优化HIV-1潜伏感染细胞模型的建立方法。

利用表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，EGFP）的HIV-1假病毒感染人Jurkat T细胞，采用流式细胞术分选出GFP阳性细胞群，经20天培养后，获得静息的GFP阴性的细胞群，之后通过激活剂曲古抑菌素A（Trichostatin A，TSA）刺激，检测GF P以及p24抗原的表达情况，筛选出H IV-1潜伏感染的单克隆细胞群。

该新方法较传统方法更为有效，所建立的HIV-1潜伏感染模型可用于各种药物或激活剂的筛选和检测，也为进一步研究HIV-1潜伏感染机制奠定了工作基础。

【关键词】HIV-1Jurkat T细胞系绿色荧光蛋白潜伏感染模型【中图分类号】R392-33 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）03-0041-02人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）-1感染所导致的获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome ， A I D S)自1981年被发现以来，一直严重威胁着全人类的生存和健康。

而目前除了高效抗逆转录病毒疗法（highly active antiretroviral therapy ， H A A R T）能够明显减缓疾病进程外，尚无其他更为有效的替代治疗方案。

但是此仅有的H A A R T治疗方案依然不能从根本上治愈H I V感染者：由于H I V-1感染宿主细胞后，其病毒基因组可以整合在宿主细胞基因组上形成处于静默状态的前病毒，这些静默的前病毒不会进行或仅在极低水平上进行转录和复制，因此避免了宿主免疫系统和抗逆转录病毒药物的攻击从而得以长期潜伏；一旦条件合适，潜伏的病毒又能恢复复制能力，导致HI V感染者的病情迅速恶化[1][2]。