第九章细菌感染的分子生物学检验
- 格式:ppt
- 大小:539.00 KB
- 文档页数:12
是的,要做PCR。
首先你要提出细菌的DNA。
方法如下:1、液体培养及保种:从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡(转速160r/min)培养16小时。
吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP 管中,再加甘油(30-40%)进行保种。
(-80摄氏度保藏2年)2、提取DNA(CTAB法):(1)取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中,12000r/min离心2min,弃上清。
(2)向沉淀物中加入350ul双蒸水,重新悬浮沉淀。
(3)加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K(20mg/ml),溶菌酶3ul,混匀,于50℃温育1h。
(4)加入50ul 5mol/L NaCl溶液,充分混匀,再加入50ul CTAB/NaCl 溶液,混合后再65℃温育30min。
(6)冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质):氯仿:异戊醇(增强酚的作用)(25:24:1),小心上下颠倒混匀,12000r/min离心5min,将上清液转移到新的EP管,重复此步骤2-3次,直至分层界面无白色沉淀。
(7)加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),小心颠倒混匀,12000r/min 离心5min将上清液转移到新的EP管。
(纯化作用)(8)加入0.6倍体积的异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,12000r/min离心15min弃上清。
(9)向离心管中加入75%乙醇,12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀,小心弃上清,重复洗涤1次,弃上清将离心管倒置于吸水纸上,晾干。
(10)加入50ul(双蒸水)/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。
(11)电泳检测6、PCR扩增:(细菌的通用引物为27F和1492R)将提取得到的DNA 进行PCR扩增,电泳检测扩增得到的16S rDNA(如果菌类分明,条带清晰,PCR原液可直接送去测序,双向测通,得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对,得出鉴定结果)7、酶切带型分型确定操作单元:将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切,电泳检测酶切产物,酶切带型相同的分为一个操作单元。
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分:1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增,电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂:1、培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
)。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)(1L):121.1g Tris,加浓盐酸约(70ml, 60ml, 42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。
冷却到室温后调pH,每升高1℃,pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA(pH8.0)(1L):186.1g Na2EDTA•2H2O,用NaOH调pH至8.0(约20g),高温高压灭菌,室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4,7.6,8.0)(1L):组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。
1M Tris-HCl (pH7.4,7.6,8.0)取100ml,0.5M EDTA(pH8.0)取20ml。
高温高压灭菌,室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS(W/V):称10g,68℃加热溶解,用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl:称292.2gNaCl,高温高压灭菌,4℃保存。
7、CTAB/NaCl(10%CTAB,0.7M NaCl):溶解4.1g NaCl,加10g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵),加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇:按氯仿:异戊醇=24:1(V/V)的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):按苯酚与氯仿/异戊醇=1:1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分:1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增,电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂:1、培养基:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
)。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)(1L):121.1g Tris,加浓盐酸约(70ml, 60ml, 42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。
冷却到室温后调pH,每升高1℃,pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA(pH8.0)(1L):186.1g Na2EDTA•2H2O,用NaOH调pH至8.0(约20g),高温高压灭菌,室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4,7.6,8.0)(1L):组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。
1M Tris-HCl (pH7.4,7.6,8.0)取100ml,0.5M EDTA(pH8.0)取20ml。
高温高压灭菌,室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS(W/V):称10g,68℃加热溶解,用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl:称292.2gNaCl,高温高压灭菌,4℃保存。
7、CTAB/NaCl(10%CTAB,0.7M NaCl):溶解4.1g NaCl,加10g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵),加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇:按氯仿:异戊醇=24:1(V/V)的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):按苯酚与氯仿/异戊醇=1:1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
菌种鉴定的分子生物学方法——16S rDNA 测序鉴定菌种一. 原理细菌中包括有三种核糖体RNA ,分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。
5S rRNA 虽易分析,但核苷酸太少,没有足够的遗传信息用于分类研究;23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍,分析较困难。
而16S rRNA 相对分子量适中,又具有保守性和存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ,rRNA 基因由保守区和可变区组成。
在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性,根据这些保守区可以设计出细菌通用物,可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段,并且这些引物仅对细菌是特异性的,也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补,而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此,16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展,越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中,只要将基因序列放入基因数据库进行对比,便可快速的鉴定所测定的细菌种属,这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
二. 技术路线该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
具体技术路线如下:三. 方法步骤(一)细菌基因组DNA 提取(酶解法)1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。
细菌培养液基因组DNADNA 提取PCR 扩增16S rDNA 片段片段回收连接克隆载体阳性克隆鉴定 测序2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中,8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。