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用于普通的Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。
裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA 团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。
另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。
对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。
如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。
如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。
对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。
RIPA裂解液（强）（RIPA Lysis Buffer）Code No. PG410501产品简介：➢本公司的RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）是一种传统的细胞组织快速裂解液。
RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。
➢RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。
RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。
➢RIPA裂解液（强）的主要成分为50mM Tris （pH 7.4），150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂。
可以有效抑制蛋白降解。
➢用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用本公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒（PG400301）测定蛋白浓度。
组织裂解液和细胞裂解液如何配制？一、细胞裂解液配制方法一一、试剂准备1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液:150 mM NaCL1% NP-40 (去垢剂)0.1% SDS (去垢剂)2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂)1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂)1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选)以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。
2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF1.5 mM EDTA1mM NaVanadate （钒酸钠）(任选)3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。
二、实验步骤1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。
加入足够的冷的PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。
在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。
2、向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。
3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中（置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。
4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。
如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。
5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在 -70℃。
方法二NP-40 or Triton-100 1%TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/LNaCl 150mmol/LPMSF（苯甲基磺酰氟） 0.1mmol/L(100μg/ml)Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 μmol/L(0.7μg/ml)Leupeptin（亮抑制肽） 0.5mg/mlAprotinin（抑蛋白酶肽） 0.3μmol/L(1μg/ml)（注：PMSF 贮存液：100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中；Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0);Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中；Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存）裂解操作程序：* 离心收集1×107个细胞* 加入4℃预冷1%NP-40裂解液100μl* 剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀（如为组织进行匀浆）* 4℃放置15~30min* 4℃离心，15 000rpm,10min，取上清备用。
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western 可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。
2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
Western实验步骤Western，也称Westernblot、Westernblotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
用于普通的Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。
裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA 团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。
另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。
对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。
如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。
如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。
对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。
RIPA裂解液（强）（RIPA Lysis Buffer）Code No. PG410501产品简介：➢本公司的RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）是一种传统的细胞组织快速裂解液。
RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。
➢RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。
RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。
➢RIPA裂解液（强）的主要成分为50mM Tris （pH 7.4），150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂。
可以有效抑制蛋白降解。
➢用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用本公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒（PG400301）测定蛋白浓度。
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western 可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
Western免疫印迹（Western Blot）一.原理：Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
也应用于检测蛋白水平的表达。
二.试剂1.裂解液：碧云天RIPA裂解液（强）主要成分为：50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1%TritonX-100，1% sodiumdeoxycholate，0.1% SDS，以及2mM sodium pyrophosphate，25mM β-glycerophosphate，1mM EDTA，1mM Na3VO4，0.5 ug/ml leupeptin等多种抑制剂。
2.PSMF：中文-苯甲基磺酰氟，有剧毒；在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中；100mmol/L PMSF溶液配制方法：溶解174mg的PMSF于足量的异丙醇中，定容到10ml，分装成小份贮存于-20℃，使用时终浓度一般为1mmol/L。
3.裂解液（含PMSF）的配制：1ml裂解液加100 mM 的PMSF 10 μl（只是比例关系，根据样品量计算出裂解液的实际体积再配制相应的裂解液）。
PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合4.丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N,N’-亚甲双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
Western Blot实验步骤蛋白抽提①把组织剪切成细小的碎片。
②融解Western及IP细胞裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
③按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液（如果裂解液不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量）。
④用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
在冰上放置30min。
⑤充分裂解后，4o C 13000g离心30分钟，取上清，其中一部分按1uL样品+4uLPBS 稀释后取2uL用于测蛋白浓度。
另一部分煮沸10分钟-20o C保存。
蛋白质定量：采用BCA蛋白测定法①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
②完全溶解蛋白标准品，取10微升稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/mL。
用PBS稀释标准品。
③将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20微升加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20微升。
④加上述稀释5倍的样品2uL加到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20微升。
⑤各孔加入200微升BCA工作液，37o C放置30分钟。
注：也可以室温放置2小时，或60o C放置30分钟。
BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。
并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。
⑥测定A562的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
SDS-PAGE电泳①根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，配制SDS-PAGE浓缩胶与分离胶：本实验浓缩胶为3.9%，分离胶为8%和10%。
使用Whatman 3 mm 滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，如上配制浓缩胶。
用10mL注射器将浓缩胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不要产生气泡。
Western-Blot操作流程试剂配制1.RIPA裂解液：50mM Tris（MW121.14，PH7.5）3.02g150mM NaCl 4.38g1%TritonX-100 5ml1%脱氧胆酸钠5g0.1%SDS 0.5g蒸馏水至500ml。
调pH值至7.5。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。
使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
2. 蛋白酶抑制剂cooktail所需母液成分：（1）100mmol/L PMSFPMSF 17.4mg异丙醇1ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
（2）10mM 亮肽素leupeptin:-20℃保存（3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin:4℃保存配制：成分终浓度每ml裂解液所加母液量PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulLeupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulAprotinin 1ug/ml （储存浓度稀释2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。
1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250 100mg95％乙醇50ml85％磷酸100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中。
2．牛血清白蛋白B SA储存液（1mg/ml）：100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4℃保存。
1．4X上样缓冲液1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8）2mlSDS 0.8g溴酚蓝0.04g甘油4ml去离子水定容至10ml。
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
使用时稀释成1X。
2．1.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20 C。
论坛里发的都是关于细胞的免疫共沉淀的实验方法,这是我做组织时用到的方法,希望能给大家有点帮助实验方法如下:第一步：制备组织裂解物1. 把组织剪切成细小的碎片。
2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。
3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。
(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
)4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。
然后同样离心取上清，用于后续实验。
或1. 使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。
最好在冰上操作。
以防止蛋白降解2. 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存-80°C以备后用。
3. 每5mg组织加入300ul裂解液，使用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
4. 用300ul裂解液冲洗刀片两次，然后将组织液在4°C缓慢摇动2小时5. 12000rpm 4°C.离心20分钟。
轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀。
裂解液的体积要根据组织量来确定。
蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失，另一方面也减少后续电泳的上样量（如果需要的话）。
蛋白的合适浓度为1-5 mg/ml ，最低不能少于 mg/ml。
第二步：预纯化裂解物使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合Ig的蛋白去除，随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异结合agarose 或sepharose beads的蛋白去除，另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。
Western blot protocol第一部分：样品制备（一）、所需试剂：1. Western及IP细胞裂解液(KGP701)：Western及IP细胞裂解液分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；2. PMSF（100mM）：sigma；3. PBS（二）、所需耗材：离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、4℃高速离心机（四）、操作步骤：1．在每mL 冷Western及IP细胞裂解液加入10μL 100mM PMSF，混匀。
冰上保存数分钟待用；2. 倒掉已处理好的细胞的培养液，预冷的PBS冲洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液，将培养瓶置于冰上；3. 加入上述适量配制好的Western及IP细胞裂解液（107个细胞加入Western及IP细胞裂解液1 mL～2 mL），用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；4. 裂解完毕后，迅速用细胞刮将细胞刮于培养瓶一侧（动作须块），然后用枪将细胞碎片和裂解液转移至1.5ml EP管中（操作在冰上进行），10000转/分，4℃离心5 min（离心机需要预冷）；5. 取上清转移至新的预冷的离心管中，蛋白定量（BCA法）；第二部分：测定蛋白浓度（一）、所需试剂：凯基BCA蛋白含量检测试剂盒（KGPBCA），分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融。
（二）、所需耗材：Ep管、96孔板、离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、振荡器、37℃烤箱、酶标仪（四）、操作步骤：1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；2. 取一块96孔板，按照下表加入试剂：3. 把96孔板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下比色测定。
以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；4. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；5. 根据标准曲线计算样品实际浓度（单位：μg/μl），将所有样品浓度用裂解液调至4μg/μl；6. 分装保存于-80℃,避免反复冻融。
Western blot一、试剂配制1）细胞裂解液：用双蒸水定容至50ml，于4℃保存。
2）PMSF：PMSF 0.0174g溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。
注：PMSF工作浓度为0.1-1mM，此液为100mM母液，使用前加入细胞裂解液中，终浓度为1mM。
PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸和，吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。
一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。
凡被PMSF污染的衣服应予丢弃。
PMSF在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。
PMSF在水溶液中的活性丧失速率高于4℃。
pH值为8.0时，20umol/L的PMSF溶液的半寿期大约为35分钟（James，1978），这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。
3）1.5M Tris-base PH8.8：Tris-base 18.17g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至96ml，调PH时约需4ml浓HCL。
4）0.5M Tris-base PH6.8：Tris-base 6.05g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至97ml，调PH时约需3ml浓HCL。
5）10%SDS：SDS 10g溶于60ml双蒸水中，68℃助溶，定容至100ml，注：由于SDS溶解时会产生很多泡沫，定容时应先定容至95ml，等泡沫散去。
6）30%Acry/bis：丙烯酰胺29g，甲叉丙烯酰胺1g，双蒸水定容至100ml，37℃助溶，-4℃保存。
注：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺时应戴手套和口罩，配制该溶液时应在通风橱中进行，操作过程中应穿好实验服，注意防护。
8）10mg/ml牛血清白蛋白（BSA）母液：BSA 0.01g，生理盐水1ml，-20℃保存，使用时稀释为1mg/ml工作液。
9）5×SDS凝胶上样缓冲液（Loading Buffer）：组分：1MTris-base PH6.8（250mM），SDS（10%），溴酚蓝（0.5%），甘油（50%），β-巯基用双蒸水定容至5ml，小分（1ml）分装后，于室温保存，使用前将50ulβ-巯基乙醇加入每小份中，加入β-巯基乙醇Buffer可在室温中保存一个月，使用时稀释为1×工作液。
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
Western及IP细胞裂解液
产品简介：
多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，譬如Triton、SDS、NP-40等。
Western及IP 细胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。
所获得的蛋白质可以用于SDS-PAGE，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris、Triton X-100组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。
用Western及IP细胞裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用leagene BCA蛋白浓度测定试剂盒(PT0001测定蛋白浓度。
由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不宜用Bradford法测定由Western及IP细胞裂解液获得的样本的蛋白浓度。
产品组成：
主要成分：主要由 Tris-HCl、NaCl、Triton X-100，以及sodium pyrophosphate、β-glycerophosphate、EDTA等多种蛋白酶抑制剂组成。
自备材料：
1、高速离心机
2、微量移液器
3、PMSF，亦可采购Leagene的苯甲基磺酰氟溶液(PMSF,100mmol/L)(PI0011)
操作步骤（仅供参考）：
(一)贴壁培养细胞
1、取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀后，使用前取适当量的裂解液加入
PMSF，使其最终浓度为1mM。
2、去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，
留取沉淀。
3、按照6孔板每1孔加入100～200μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Western及IP
细胞裂解液。
移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。
通常裂解液作用于细胞1～5s内，细胞就会被裂解。
4、10000～12000g，离心3～5min（如果用冷冻离心机4℃离心效果更佳），取上清。
5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二) 悬浮培养细
1、取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀后，使用前取适当量的裂解液加入
PMSF，使其最终浓度为1mM。
2、低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
3、用手指轻弹细胞，使其松散。
按照6孔板每孔细胞加入100～200μl含有PMSF的裂
解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。
通常6孔板每孔细胞加入100ul裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150～200μl。
再用手指轻弹以充分裂解细胞。
充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
4、10000～12000g，4℃离心3～5min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5、进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三) 组织样本
1、取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀后，使用前取适当量的裂解液加入
PMSF，使其最终浓度为1mM。
2、把组织剪切成细小的碎片，越小越好。
3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控
制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
4、按照每20mg组织加入100～200μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。
冰上
或4℃裂解30～60min。
5、步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入100～200μl裂解液的比例加
入含有PMSF的Western及IP细胞裂解液。
用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
6、按照每20mg组织加入100～200μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。
7、10000～12000g，4℃离心10～15min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
8、进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事项：
1、在壁培养细胞的操作步骤中，去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，
可以不用清洗。
2、如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减
少裂解液的用量。
3、在培养细胞的裂解中，如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再
裂解。
大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对
比较容易裂解充分。
4、如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex
使样品裂解充分。
然后同样离心取上清，用于后续实验。
直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
5、溶解Leagene Cell lysis buffer for Western and IP的时候，应尽量缩短溶解时间，
避免裂解液中的有效成分失效。
6、细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。
7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
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产品编号 产品名称
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PI0011苯甲基磺酰氟溶液(PMSF,100mmol/L)
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PT0013考马斯亮蓝快速染色液。
