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hplc高效液相色谱HPLC高效液相色谱简介高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），也被称为液相色谱法（Liquid Chromatography），是一种广泛应用于药物分析、环境监测、食品检测等领域的分离技术。
HPLC色谱技术通过物质在液体流动相和固定相之间的相互作用，实现对分子化合物的分离、检测和定量。
相对于传统的柱层析技术，HPLC具有分离效率高、分析灵敏度高、分析速度快等特点，被广泛应用于科学研究和工业生产。
HPLC的基本原理HPLC色谱技术是建立在分配系数理论的基础上。
它通过固定填料上溶解物质与流动相中溶解物质之间的分配与再分配，实现目标化合物在固定相中的分离。
HPLC色谱法的基本步骤包括：样品制备、装柱、选择流动相、进样、洗脱分离、检测及数据处理等。
HPLC的主要组成部分HPLC主要由一系列组成部分组成，包括：溶剂输送系统、无菌进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统等。
其中，溶剂输送系统用于控制流动相的输送速率和压力，确保流动相以一定速率通过色谱柱；无菌进样器用来将样品进样并转送到色谱柱中；色谱柱是分离目标化合物的关键组成部分，根据所分离物质的化学性质和目标要求选择合适的色谱柱；检测器用来检测溶质的浓度，并将信号转换为电信号输出；数据处理系统用来处理和分析检测到的信号，得出结果。
HPLC的种类和应用领域根据不同的分离机制和柱填料，HPLC可以分为很多不同的类型，包括：反相色谱、离子交换色谱、分子筛色谱等。
反相色谱是最常用的一种HPLC技术，其应用领域非常广泛。
例如，在药物研究领域，HPLC被广泛应用于药物分析、药代动力学研究、质量控制等方面。
在环境监测领域，HPLC被用来检测土壤和水体中的有机污染物、重金属和农药等化学物质。
在食品安全检测领域，HPLC被用来检测食品中的添加剂、农药残留和重金属等有害物质。
HPLC的发展和进展自HPLC技术在20世纪60年代首次提出以来，随着科学技术的不断发展，HPLC技术也在不断进步和改进。
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱高效液相色谱，又称高压液相色谱（HPLC，High Performance Liquid Chromatography），是一种重要的色谱技术，广泛应用于药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。
相较于传统液相色谱，高效液相色谱具有分离效果好、分析速度快、灵敏度高等优势，因此成为现代分析实验的核心技术之一。
高效液相色谱的原理基于物质在不同相互作用力下的差异，通过样品在固定相上的分配行为，实现对不同成分的分离和分析。
其核心部分是色谱柱，包括固定相、流动相和样品分子。
其中，固定相是一种特定的固体或液体材料，具有一定的孔隙结构和表面特性，用于捕获和分离样品成分。
流动相则由溶剂组成，可以通过与固定相的相互作用调节分离效果。
而样品分子则根据其在固定相上的亲疏性，相继被吸附、扩散和解吸，最终实现分离。
高效液相色谱的分离过程包括样品进样、柱温控制、流速调节等步骤，每个步骤都需要严格控制，以保证分离效果和结果准确性。
在样品进样之前，通常需要采用样品前处理方法，如固相萃取、溶剂萃取等，以去除杂质和提高分析物的浓度。
然后，样品通过进样器进入色谱柱，通过控制流速和柱温，使样品成分在固定相上发生分配行为，从而实现分离。
最后，通过采集柱洗脱出来的物质，并通过检测器检测其浓度变化，得到分析结果。
高效液相色谱的关键是选择适当的固定相和流动相。
不同的样品性质和分析要求需要选择不同的固定相。
常见的固定相包括疏水相、离子交换相、亲水相等。
此外，流动相的选择也非常重要，常见的流动相溶剂有水、有机溶剂（如甲醇、乙腈）等。
合理选择固定相和流动相能提高分离效果，提高检测灵敏度。
高效液相色谱有多种检测器可供选择，常用的有紫外-可见光谱检测器（UV-Vis）、荧光检测器、质谱检测器等。
通过检测器的信号，可以得到样品的浓度信息，从而进行定量分析。
高效液相色谱在药物分析中的应用广泛。
例如，针对不同药物的检测需求，可以选择不同的色谱柱和流动相，在合适的检测器下进行分析。
高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography（HPLC）7.1 概述高效液相色谱法—高压液相色谱法 HPLC高效液相仪:流动相：液体固定相：柱子采用十分细小的颗粒填充，高效分离柱，高压泵输送流动相，柱后连高灵敏度检测器，对流出物连续检测。
高交效液相色谱分析过程高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。
7.1.1 高效液相色谱发展历史1903年茨维特发明液相色谱1931年Kuhn, Lederer，液固色谱分离结晶胡萝卜素为α和β异构体，同年制得叶黄素结晶，1938年从维生素B中分离出B6。
1938年获诺贝尔化学奖1958年Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，成为研究蛋白质和酶的重要工具。
1972年获得诺贝尔化学奖。
1968年出现商品化的高效液相色谱仪7.1.2 高效液相色谱的特点经典液相色谱高效液相色谱色谱柱：柱长10~200cm，内径10~50mm 色谱柱：柱长10~25cm，内径2~10mm常压或减压高压，40~50MPa填料颗粒大，75~600μm（200~30目）填料颗粒小，2~50μm（2500~300目）柱效低，20~50/m 柱效高，40000~60000块/m分析速度慢，1~20h 分析速度快，0.05~1.0h色谱柱只用一次色谱柱可重复多次使用不能在线检测能在线检测设备不同GC：载气与组分无亲合力，体系和类型少，高温，柱外效应可忽略缺点，只分析可气化的试样HPLC：流动相对组分有亲和力，体系多，类型多，低温，可回收样品，柱外效应较大，缺通用型检测器，成本高2. 高效液相色谱的应用范围7.1.3 液相色谱的分类7.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素传质阻力系数C=流动相传质阻力系数+固定相传质阻力系数7.3.1 高压输液系统:1. 构成：储液罐/高压输液泵/过滤器/压力脉动阻力器2. 储液罐：盛入溶剂，连过滤器，防止颗粒进泵3. 高压输液泵: 密封性，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀。
压力：150～350×105 Pa。
作用：将流动相在高压下，连续不断地送入色谱系统。
高压目的：输送流动相及组分。
保持渗透性和快速分析。
装置：双活塞往复泵：稳定输出流量。
7.3.2 进样系统1. 作用：将试样引入色谱柱对分离产生影响：柱外展宽（柱前和柱后展宽）原因：进样系统、连接管道及检测器中存在死体积2. 进样装置：隔膜注射进样器，高压进样阀：六通阀进样装置7.3.3 分离系统-色谱柱和流动相1. 色谱柱作用：分离材料：内部抛光不锈钢管外型：内径：4mm ～5mm柱长：10cm ～50cm高效：填料粒度小：5~10μm塔板数：7 000 ～10 000固定相要求：耐高压基体：实心玻璃珠多孔活性材料：率相对硅胶而言比较低，重现性不好无定型硅胶: 最初的 HPLC 填料，粒径 >5 µm ，柱床稳定性差，比表面积较小，价格便宜球形硅胶: 现代 HPLC 填料，粒径小 (5 µm, 3 µm, <2 µm)，重现性好 ，稳定性好，分离效率高• 硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。
• 以前的纯度较低的硅胶（称为 A 型硅胶）, A 型硅胶是以金属硅酸盐制备而来，具有很高的金属含量，可被用作中性化合物和非离子化合物的分离。
• 纯度高、酸性较弱的硅胶 (称为 B 型硅胶)，这种硅胶是以无金属的工艺制备而来，只含有微量的金属，建议用于分离离子化合物和可电离的化合物，特别是碱性化合物。
• 金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物的分离产生不对称峰或拖尾峰。
孔径 作用和效能< 60 nm对 HPLC 分析没有用，会引起峰形拖尾和较低的分离效率 60 – 150 nm对小分子的分离效果理想 (MW < 4,000 to 130,000), 例如药物分子、传统的中药和小分子的缩氨酸 300 – 1,000 nm 对大分子的分离效果理想，如多肽、核苷和高分子 > 1,000 nm对聚合物的分离效果理想，如DNA 和生物大分子M+表面金属能与螯合化合物络合M SiOH内部的金属对表面硅羟基具有活化作用强酸性A 型硅胶 C18B 型硅胶C182.流动相（1）要求：针对分离组分有良好的选择性，与固定相不溶，对检测器有适当的响应，粘度适宜，化学稳定性，高纯度，安全（2）溶剂的特性参数：溶剂强度，溶解度，极性，选择流动相中溶剂的三角形图（3）流动相组成（4）梯度洗脱装置：梯度淋洗/洗提/淋洗（gradient elution）：将两种或两种以上不同性质但可以互溶的溶剂，随着时间改变而按一定比例混合，以连续改变色谱柱中冲洗液的极性、离子强度或pH等，从而改变被测组分的相对保留值。
目的：提高分离效率，加快分离速度。
分辨能力增加，峰形改善，为解决由k范围较宽的多组分复杂样品的分离，前面的分不开，后面的成分分离度太大，出峰慢，峰形差的问题7.3.4 检测系统检测器：用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。
要求：灵敏度，噪音低、线性范围宽、响应快，死体小、池体积小于15微升溶质性检测器: 仅对被分离组分的物理或化学特性有响应:总体检测器: 对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应:7.3.5 数据处理系统色谱参数的选择和设定：自动化操作仪器；色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理；对采集和存储的数据进行后处理；自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。
常用色谱参数、操作程序，及各种定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。
7.4 液相色谱法的主要类型7.4.1 分配色谱1.分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异进行分离。
根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。
分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。
2.类型：据固定相状态分（1）液液色谱：固定相是通过物理吸附方法将液相固定液涂在载体表面。
缺点：物理浸渍的液体固定相，由于流动相的溶解作用或机械作用易流失，导致柱上保留行为改变。
（2）键合相色谱：固定相通过化学反应将有机分子键合到载体或硅胶表面上。
按固定相与流动相极性分3. 流动相选择：常用溶剂：己烷/甲醇/乙腈/水/乙酸乙酯/乙醇/四氯化碳常用溶剂的极性顺序：水(最大)>乙腈>甲醇>乙醇>四氢呋喃>正丁醇>己烷>煤油(最小)二元或多元组合溶剂:调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间4.固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用（1）表面多孔型固定相基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。
（2）全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成；全多孔型固定相7.4.2 化学键合相色谱法（CBPC: Bonded Phase Chromatography ）涂渍固定液化学键合固定相:化学反应通过化学键将固定液结合在担体表面。
键合相色谱法：采用化学键合固定相的液相色谱法固定相的结构：载体或担体（基质)+功能层分类•化学键合相•反相键合相色谱•正相键合相色谱•离子对色谱和离子抑制色谱a. 硅氧碳键型：≡Si—O—Cb. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂应用最广；c. 硅碳键型：≡Si—Cd. 硅氮键型：≡Si—NR,-C4, -C8, -C18,-C6H5, -CN, -NH2,-SO3H, -COOH, -NR4＋Cl疏水基团如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等极性基团如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。
分离机制：分配+ 吸附（以LLC为基础）特点：1）不易流失2）热稳定性好3）化学性能好4）盛载载样量大5）适于梯度洗脱A. 反相键合相色谱（RP-HPLC）（1）．分离机制：疏溶剂理论●非极性的烷基键合:“分子毛”，有较强的疏水特性。
●流动相：极性溶剂●任务：分离含有极性官能团的有机化合物时，●保留：分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；●洗脱：被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用，●分离：两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。
（2）固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题）（3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性> 固定相极性底剂+ 有机调节剂（极性调节剂）例：水+ 甲醇，乙腈，THF（4）流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分t R↑（5）出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱（6 ）适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）反相键合相色谱法是高效液相色谱中应用最为广泛的一个分支，主要是因为：①各种不同碳链长度的非极性固定相已商品化，流动相由水及加入水中的少量有机溶剂组成，方便廉价，水的截止波长低，有利于痕量组分的紫外检测；②非极性固定相最适合于分离非极性或极性小的样品，对强极性或离子型化合物如生物碱、磺胺类药物也可通过调节流动相的pH值或在流动相中加入离子对试剂（离子对色谱法）实现分离；③色谱柱平衡快，适于梯度洗脱。
B. 正相键合相色谱（1）分离机制：存在溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力（2）固定相：极性大的氰基或氨基键合相（3）流动相：极性小（同LSC）底剂+ 有机极性调节剂例：正己烷+ 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分t R↓，k↓固定相和流动相选择----n、k、α三者之间分子作用力：极性改变k，2～5，取决于流动相组成反相色谱：甲醇、乙腈、四氢呋喃和水改变α，改变流动相化学性质改变k值甾类化合物的分离k为定值时，改变α的影响（5）出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱化学键合相色谱法特点化学键合相色谱法适用：•氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）•异构体、极性不同的化合物，分离不同类型的化合物。
•氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性•分析极性大物质、糖类等7.4.3 吸附色谱（液-固吸附色谱）LSAC1.原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异。
过程：当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。
