田瑞军副教授南方科技大学化学系生物质谱与蛋白质组学课

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＨＥｓｔａｉｎｉｎｇ，Ｍａｓｓｏｎｓｔａｉｎｉｎｇ，ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｑＰＣＲ，ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎｄｏｔｈｅｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｖｅｒｉｆｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＨＤｏｎｉｎｔｅｓｔｉ ｎａｌｆｉｂｒｏｓｉｓｉｎｍｉｃｅａｎｄｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｒｅ ｓｕｌｔｓ　Ｉｎｖｉｖｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅＤＳＳ ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｆｉｂｒｏｓｉｓｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｈａｄｓｈｏｒｔｅｎｅｄｃｏｌｏｎ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｌｏｎｈｉｓ ｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｓｃｏｒｅ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｌｌａｇｅｎｖｏｌｕｍｅｆｒａｃ ｔｉｏｎ，ａｎｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｌｌａｇｅｎⅠｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ．Ａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ４，１０，ａｎｄ２５ｍｇ·ｋｇ－１ＨＤ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｃｏｌｏｎｓｈｏｒｔｅｎ ｉｎｇｏｆｍｉｃｅｗａｓａｌｌｅｖｉａｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｓｃｏｒｅ，ｃｏｌｌａｇｅｎｖｏｌｕｍｅｆｒａｃｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｌｌａｇｅｎⅠｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎａｄｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｉｎｃｏｌｏｎｔｉｓｓｕｅａｎｄＩＥＣ ６ｃｅｌｌｓ，ＨＤｃｏｕｌｄｄｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥＭＴ ｒｅｌａｔｅｄｆａｃ ｔｏｒｓｓｕｃｈａｓα ＳＭＡ，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ，Ｎ ｃａｄｈｅｒｉｎ，ａｎｄｉｎ ｃｒｅａｓｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥ ｃａｄｈｅｒｉｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＨＤｃａｎｉｍｐｒｏｖｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｆｉｂｒｏｓｉｓｂｙｉｎｈｉｂｉ ｔｉｎｇＥＭＴ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐ ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ；ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｆｉｂｒｏ ｓｉｓ；ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｂｏｗｅｌｄｉｓｅａｓｅ；ｃｏｌｌａｇｅｎｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ；ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ｃａｄｈｅｒｉｎ ｓｗｉｔｃｈ网络出版时间：２０２３－０３－２０１５：５４：２０　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３０３１９．２３５３．０３２．ｈｔｍｌ◇肝脏药理学◇ＦＡＴＰ５基因沉默抑制油酸诱导的ＨｅｐＧ２细胞脂肪化及炎症作用王天琦１，孙文龙２，杨馥源３，李敬达４（１．长江大学农学院，湖北荆州　４３４０００；２．山东理工大学生命科学学院，山东淄博　２５５０００；３．长江大学医学院，湖北荆州　４３４０００；４．长江大学生命科学学院，湖北荆州　４３４０００）ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０２０６６文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０４－０６９２－０８中国图书分类号：Ｒ３４２ ２；Ｒ３４４ ７；Ｒ３６４ ５；Ｒ３９２ １１；Ｒ５７５ ５摘要：目的　明确ＦＡＴＰ５作为脂肪酸转运蛋白家族成员，其基因沉默对肝脏细胞脂肪化及炎症作用的影响，并初步探究该影响可能的机制。

科研Mol.Plant：拟南芥蛋白质组图谱的重塑与蛋白质在发育和免疫中共同调节编译：东方不赢，编辑：Emma、江舜尧。

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导读蛋白质组重塑是一种基础适应性反应。

复合体蛋白质和功能性蛋白质通常是共表达的。

研究者使用深度采样策略，将拟南芥组织核心蛋白质组定义为每个组织中约10,000个蛋白质，且在整个植物生命周期中量化近16,000个蛋白质（单细胞的拷贝数）。

整体翻译后修饰蛋白质组学中发现了氨基酸的交换现象，说明了真核生物中可能存在翻译的不忠。

蛋白质丰度的相关性分析揭示了光合作用、种子发育以及衰老和脱落调节中，存在可能组织/年龄特异性转录信号传导模块。

另外，本研究数据表明RD26和其他NAC转录因子具有在种子发育中与耐干旱相关的潜在功能，富含半胱氨酸的受体激酶CRK可以作为衰老中ROS传感器。

核糖体生物发生因子（RBF）复合体的所有组分均以组织、年龄特异的方式共表达，表明拟南芥中这些研究较少的复合体蛋白质组装时功能混杂。

本研究用flg22处理了拟南芥幼苗16小时，分析鉴定了基础免疫反应中蛋白质组结构的特征。

在flg22处理后1、3和16小时，结合平行反应监测（PRM）靶向蛋白质组学，植物激素、氨基酸组分分析和转录本测量获取了一个全面的结果。

研究者发现， JA和JA-Ile水平抑制是通过MYC2（茉莉酸敏感物质1）控制下的IAR3（IAA-ALA抗体3）和JOX2（茉莉酸诱导的加氧酶2）的解共轭和羟基化作用。

这个JA触发的免疫反应调节机制从未被报道，尚未得到充分研究。

本研究生成的数据集广泛覆盖了不同条件中的拟南芥蛋白质组，为相关研究提供了丰富资源。

论文ID原名：Reshaping of the Arabidopsis thaliana proteome landscapeandco-regulation of proteins in development and immunity译名：拟南芥蛋白质组图谱的重塑与蛋白质在发育和免疫中共同调节期刊：Molecular PlantIF：12.084发表时间：2020.09通讯作者：Wolfgang Hoehenwarter通讯作者单位：莱布尼茨植物生物化学研究所实验设计实验结果1. 深度蛋白质组学研究方法因为要对拟南几种组织（组织分别为根，叶，茎生叶，茎，花和角果/种子以及7天至93天衰老的整株植物幼苗）的不同生命阶段进行蛋白质组学测量，及测量用肽flg22处理PTI诱导的蛋白质组。

• 1196 •现物医学 Progress in Modern Biomedicine VoL21 NO.6 MAR2021doi: 10.1324 l/ki.pmb.2021.06.044•专论与综达•呼吸中的疾病诊断标志物及检测技术*罗静怡w孙鹏博u丁艺佩w王阳阳u谢伟东U3A(1清华大学深圳国际研究生院健康科学与技术重点实验室广东深圳518055;2清华大学深圳国际研究生院化学基因组学国家重点实验室广东深圳518055;3清华大学深圳国际研究生院国际开放创新教育中心广东深圳518055)摘要:人类呼出气体中的各种化合物能提供各种疾病和健康状况的重要信息。

近年来，由于红外、电化学、化学发光等新技术的重大突破和质谱仪的使用，使得在极低浓度下精确测量呼出的挥发性有机化合物（V O C s)和气溶胶颗粒成为可能，呼吸检测领域因而取得了重大进展:，呼吸检测因其可以作为一种实时、快速和无创的方法来评估和监测各种疾病与健康状况信息，在科学研究、临床运用中引起了广泛关注。

本综述主要概述呼出气体成分分析方法及在疾病诊断中的研究与应用情况，旨在为将来疾病的实时、快速和无创诊断提供一种新的策略关键词：呼吸气体分析；无创检测技术；疾病诊断中图分类号:Q47;R322.3;R446文献标识码:A文章编号：1673-6273(2021)06-丨196-05Exhaled Breath Markers for Disease Diagnosis and Detection Technologies* LUO Jing-yiu, SUNPeng-bou, DING Yi-peiIJ f WANG Yang-yang1-3, XIE Wei-dong1^(1 Key Lab in Health Science and Technology, Tsinghua Shenzhen Internationa! Graduate School, Tsinghua University, Shenzhen,Guangdong, 518055, China; 2 State Key Laboratory o f C hemical Oncogenomics, Tsinghua Shenzhen International Graduate School, Tsinghua University, Shenzhen, Guangdong, 518055, China： 3 Open FIESTA Center, Tsinghua Shenzhen International Graduate School,Tsinghua University, Shenzhen, Guangdong, 518055, China)ABSTRACT:V a rio u s c o m p o u n d s in h u m an e x h a le d breath can p ro v id e im p ortan t in fo rm a tio n o n v a rio u s d is e a s e s an d h ealth c o n d i­tio n s. M ajor b reak th rou gh s in n e w t e c h n o lo g ie s su ch a s in frared, e le ctro ch em istry, an d c h e m ilu m in e s c e n c e an d the u se o f m a ss sp ec tro m­eters h a v e m a d e it p o ss ib le to a c c u r a te ly m ea su re e x h a le d v o la tile o rg a n ic c o m p o u n d s (V O C s) a n d a e r o so l p a rticles at ex tr e m e ly lo w co n cen tra tio n s. S ig n ific a n t p ro g ress h a s b e e n m a d e in th e fie ld o f d etectio n. R esp ir a to ry te stin g h a s attracted w id esp re a d a tten tio n in s c i­e n tific resea rch and c lin ic a l a p p lic a tio n s b e c a u se that ca n b e u se d as a r ea l-tim e, fast an d n o n-in v a s iv e m e th o d to ev a lu a te an d m o n ito r in­fo rm a tio n o n v a rio u s d ise a s e s an d h ea lth c o n d itio n s. T h is r e v ie w m a in ly su m m a r iz e s th e a n a ly sis m e th o d s o f e x h a le d breath a n d th eir ap-p lic a tio n in d ise a s e d ia g n o sis, a n d a im s to p ro v id e a n e w stra teg y for the rea l-tim e, rapid an d n o n-in v a s iv e d ia g n o sis o f d is e a s e s in th e fu­ture.Key words:E x h a led breath a n a ly sis; N o n-in v a s iv e d e te c tio n te c h n o lo g y; D is e a s e d ia g n o sisChinese Library Classification(CLC):Q47; R322.3; R446 Document code:AArticle ID: 1673-6273(2021 )06-1196-05刖目我们呼出的气体是一个复杂的基质,它由成千上万个的分子构成了一个独特的生物标志，像血液、指纹一样携带着一些与每个人健康有关的信息。

蛋白质组学研究的是什么现代自然科学突飞猛进，出现了各式各样检测技术，供以科学研究，今天我来讲一下时下最热门的研究手段之一的蛋白质组学。

今天我们就来说一说蛋白质组学到底研究什么，也就是蛋白质组学研究到底能揭示什么解释什么。

2002年诺贝尔化学奖得住中田耕一，由于一次实验误操作，将质谱技术带入了生物学领域，开创了一种新型而且可靠的鉴定生物大分子的方法。

这就是蛋白质质谱技术。

这种技术的到来，给于了蛋白质组学全新的活力，让蛋白质组学从单一的研究细胞模型、动物模型，扩展到了体液、组织等动物样本，而且应用范围的生物复杂度越来越高。

研究的领域也从最初的肽段序列推导，到多肽及蛋白质的定性定量分析，翻译后修饰，最后到如今最火热的靶向蛋白质组学。

蛋白质组学主要应用领域是针对基础生物学的，例如研究通路，蛋白质复合物，互作网络，表征细胞和组织的类型鉴定，观察细胞内周期蛋白质的表达等等。

与当下热门的基因组来对比。

蛋白质才是真正执行生命体功能的基础单位，基因更多的在于调控蛋白质的表达，这样的话基因组测序并不能表示当下状态下的物种的生命表征原理，而且蛋白质在行驶功能的时候总是通过形成各种复合物，组成一个通路网络，达到最后的各种生物学功能。

蛋白质组学的研究给我们提供了一个平台，可以从蛋白质系统的层面去考察、思考。

例如：蛋白-蛋白互作，蛋白质的细胞定位，蛋白质的翻译后修饰（磷酸化、甲基化等），以及研究信号通路及代谢通路的调控。

现今最为火热的靶向蛋白质组学更是提供了一个药物研究、医学研究的手段。

以肝毒性为例子，蛋白质组学就能够为药物研发的前期肝毒性评估提供重要的研究手段。

传统蛋白质组学主要是用来鉴定新的未知的生物大分子，但是这种传统的方法在临床药物研究中就出现了重复性低，精准度低的问题。

这时候如果我们在分析之前就明确我们具体要分析的物质是什么的话，这个问题就可以迎刃而解了，这样靶向蛋白质组学就兴起了，我们不用一次性鉴定成千上万个蛋白，只需要从其中挑出几十种甚至十几种研究相关的蛋白质，而且这些蛋白往往浓度较低，用传统的方法十分容易遗漏。

㊀南京农业大学学报㊀２０２０ꎬ４３(４):７４０－７４７ｈｔｔｐ://ｎａｕｘｂ.ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ㊀ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＤＯＩ:１０.７６８５/ｊｎａｕ.２０１９０７００９收稿日期:２０１９－０７－０６基金项目:国家自然科学基金项目(３１７７２６４８)作者简介:李若楠ꎬ硕士研究生ꎮ∗通信作者:李春梅ꎬ教授ꎬ博士ꎬ主要从事饲料卫生㊁畜禽环境生理与营养调控研究ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｃｈｕｎｍｅｉｌｉ＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ李若楠ꎬ康瑞芬ꎬ沈丹ꎬ等.谷氨酰胺对呕吐毒素诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞凋亡和炎症的影响[Ｊ].南京农业大学学报ꎬ２０２０ꎬ４３(４):７４０－７４７.ＬＩＲｕｏｎａｎꎬＫＡＮＧＲｕｉｆｅｎꎬＳＨＥＮＤａｎꎬｅｔａｌ.ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｏｎｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｏｆＩＰＥＣ￣Ｊ２ｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ２０２０ꎬ４３(４):７４０－７４７.谷氨酰胺对呕吐毒素诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞凋亡和炎症的影响李若楠ꎬ康瑞芬ꎬ沈丹ꎬ戴鹏远ꎬ唐倩ꎬ李春梅∗(南京农业大学动物科技学院ꎬ江苏南京２１００９５)摘要:[目的]本试验以猪空肠上皮细胞(ＩＰＥＣ￣Ｊ２)为模型ꎬ探讨谷氨酰胺(Ｇｌｎ)对呕吐毒素(ＤＯＮ)诱导的ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞凋亡和炎症的影响ꎮ[方法]通过ＭＴＴ方法测定细胞活力来选择适宜的Ｇｌｎ浓度ꎬ以不添加Ｇｌｎ和ＤＯＮ的细胞为空白对照组ꎬ试验组分别为０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ组ꎬ２.０μｇ ｍＬ－１ＤＯＮ组和２.０μｇ ｍＬ－１ＤＯＮ＋０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ组ꎬ处理２４ｈ后测定各组细胞凋亡率㊁活性氧自由基(ＲＯＳ)及细胞凋亡和炎症相关基因和蛋白的表达水平ꎮ[结果]与对照组相比ꎬＤＯＮ处理２４ｈ细胞凋亡比例和ＲＯＳ含量(ＲＯＳ荧光密度/细胞总数)显著升高(Ｐ<０.０１)ꎻ与ＤＯＮ组相比ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组显著降低细胞的凋亡比例和ＲＯＳ含量(Ｐ<０.０１)ꎮ与对照组相比ꎬＤＯＮ组上调ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞白细胞介素１β(ＩＬ￣１β)㊁白细胞介素６(ＩＬ￣６)㊁环氧合酶２(ＣＯＸ￣２)及肿瘤坏死因子α(ＴＮＦ￣α)炎症相关基因和Ｃａｓｐａｓｅ￣３及Ｃａｓｐａｓｅ￣８凋亡相关基因的表达水平ꎻ与ＤＯＮ组相比ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组下调ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞ＩＬ￣１β㊁ＣＯＸ￣２㊁Ｃａｓｐａｓｅ￣３㊁Ｃａｓｐａｓｅ￣８㊁ＢＡＫ和Ｂｃｌ￣２基因的表达水平ꎮ蛋白免疫荧光结果显示ꎬ与对照组相比ꎬＤＯＮ组上调ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞Ｃａｓｐａｓｅ￣３ꎬ核转录因子κＢ(ＮＦ￣κＢ)和磷酸化核转录因子κＢ(ｐｈｏｓｐｈｏ￣ＮＦ￣κＢ)蛋白的表达ꎬ而添加Ｇｌｎ后(ＤＯＮ＋Ｇｌｎ组)下调了相关蛋白的表达ꎮ[结论]Ｇｌｎ通过清除ＤＯＮ诱导的ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞中过量的ＲＯＳ及调节炎症和凋亡相关基因及蛋白的表达量来缓解由ＤＯＮ引起的肠道上皮细胞损伤ꎮ关键词:谷氨酰胺ꎻ呕吐毒素ꎻ猪空肠上皮细胞ꎻ炎症ꎻ凋亡中图分类号:Ｓ８２８.９㊀㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号:１０００－２０３０(２０２０)０４－０７４０－０８ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｏｎｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｏｆＩＰＥＣ￣Ｊ２ｃｅｌｌｓＬＩＲｕｏｎａｎꎬＫＡＮＧＲｕｉｆｅｎꎬＳＨＥＮＤａｎꎬＤＡＩＰｅｎｇｙｕａｎꎬＴＡＮＧＱｉａｎꎬＬＩＣｈｕｎｍｅｉ∗(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００９５ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:[Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ]Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ(ＩＰＥＣ￣Ｊ２ｃｅｌｌｓ)ｗｅｒｅｕｓｅｄａｓａｍｏｄｅｌｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅ(Ｇｌｎ)ｏｎｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ(ＤＯＮ)ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｏｆＩＰＥＣ￣Ｊ２ｃｅｌｌｓ.[Ｍｅｔｈｏｄｓ]ＴｈｅａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅＧｌｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙＭＴＴｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙａｓｓａｙꎬａｎｄｔｈｅｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔＧｌｎａｎｄＤＯＮｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ.Ｔｈｅｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅ０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎꎬ２.０μｇ ｍＬ－１ＤＯＮａｎｄ２.０μｇ ｍＬ－１ＤＯＮ＋０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ａｆｔｅｒ２４ｈꎬｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓꎬｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ(ＲＯＳ)ꎬｓｏｍｅｇｅｎｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ.[Ｒｅｓｕｌｔｓ]ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄＲＯＳｃｏｎｔｅｎｔ(ＲＯＳｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｎｓｉｔｙ/ｃｅｌｌｔｏｔａｌ)ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒＤＯＮｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒ２４ｈ(Ｐ<０.０１).ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＤＯＮｇｒｏｕｐꎬＤＯＮ＋ＧｌｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄＲＯＳｃｏｎｔｅｎｔ(Ｐ<０.０１).ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬＤＯＮｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓꎬｓｕｃｈａｓｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ￣１β(ＩＬ￣１β)ꎬｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ￣６(ＩＬ￣６)ꎬｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ２(ＣＯＸ￣２)ꎬｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｌｐｈａ(ＴＮＦ￣α)ꎬＣａｓｐａｓｅ￣３ꎬＣａｓｐａｓｅ￣８ꎻＤＯＮ＋Ｇｌｎｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＬ￣１βꎬＣＯＸ￣２ꎬＣａｓｐａｓｅ￣３ꎬＣａｓｐａｓｅ￣８ꎬＢＡＫａｎｄＢｃｌ￣２ｇｅｎｅｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＤＯＮｇｒｏｕｐ.ＰｒｏｔｅｉｎｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬＤＯＮｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａｓｐａｓｅ￣３ꎬｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ(ＮＦ￣κＢ)ａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ(ｐｈｏｓｐｈｏ￣ＮＦ￣κＢ)ｐｒｏｔｅｉｎꎬａｎｄＧｌｎｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ.[Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ]ＧｌｎａｌｌｅｖｉａｔｅｄｔｈｅｄａｍａｇｅｏｆＩＰＥＣ￣Ｊ２ｃｅｌｌｓｃａｕｓｅｄｂｙＤＯＮｂｙｄｅｃｒｅａｓｉｎｇＲＯＳｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｇｌｕｔａｍｉｎｅꎻｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌꎻｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ(ＩＰＥＣ￣Ｊ２ｃｅｌｌ)ꎻｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎꎻａｐｏｐｔｏｓｉｓ１４７㊀第４期李若楠ꎬ等:谷氨酰胺对呕吐毒素诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞凋亡和炎症的影响㊀㊀呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌꎬＤＯＮ)ꎬ是由镰刀菌侵染农作物产生的一种Ｂ族单端孢霉烯族霉菌毒素ꎬ广泛存在于农作物中ꎬ严重威胁动物和人类的健康[１]ꎮ全球范围内ꎬ呕吐毒素的平均检出率高达５９％ꎬ欧洲和亚洲的检出率最高[２]ꎮ龚阿琼等[３]对２０１７年我国多个地区的饲料原料进行了检测ꎬ经统计分析发现ＤＯＮ在大多数饲料原料中检出率均为１００％ꎮＤＯＮ广泛存在于饲料和人类食品中ꎬ对人和动物的健康造成危害ꎮＤＯＮ可引起动物呕吐㊁拒食㊁腹泻㊁生长迟缓㊁肠道出血㊁免疫系统紊乱和神经系统疾病[４]ꎮ肠道作为营养物质消化和吸收的主要场所ꎬ亦是抵抗外源毒素和致病性病原微生物入侵的天然屏障[５]ꎮ肠道黏膜上皮是ＤＯＮ主要的靶器官ꎬ经口摄入的ＤＯＮ通过被动扩散进入肠上皮细胞后ꎬ抑制肠上皮细胞的蛋白质合成ꎬ破坏紧密连接蛋白的结构ꎬ损伤肠道屏障的完整性ꎬ增加肠上皮的通透性ꎬ降低营养物质的吸收和转运效率[６]ꎮ另外ꎬ也有研究报道ꎬＤＯＮ影响细胞增殖ꎬ诱导细胞发生程序性死亡ꎬ改变相关基因的表达[７]ꎮ本课题组前期研究发现ꎬＤＯＮ可诱发ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞产生过量的ＲＯＳꎬ降低细胞的存活率ꎬ诱导细胞凋亡和炎症相关基因及蛋白表达水平发生改变[８]ꎮ谷氨酰胺(ｇｌｕｔａｍｉｎｅꎬＧｌｎ)作为一种功能性氨基酸ꎬ可以促进肠道黏膜再生ꎬ增强肠黏膜免疫力ꎬ减少氧化损伤ꎬ刺激肠上皮细胞增殖ꎬ增强肠屏障功能ꎬ维持小肠消化功能和黏膜完整[９]ꎮ在调节基因表达㊁细胞信号㊁抗氧化反应㊁神经传递和免疫等方面发挥着重要作用[１０]ꎮ已有研究指出ꎬ仔猪饲料中添加Ｇｌｎ有利于维持仔猪小肠的完整性ꎬ促进小肠黏膜屏障的再生[１１]ꎬ但有关Ｇｌｎ是否能缓解毒素造成的肠道损伤尚未见报道ꎮ因此ꎬ本试验以ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞为模型ꎬ探讨Ｇｌｎ对ＤＯＮ诱导的ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞凋亡和炎症反应的影响ꎬ旨在阐明Ｇｌｎ在调节ＤＯＮ诱导的肠上皮细胞凋亡和炎症反应中可能发挥的作用ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料猪空肠上皮细胞(ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓꎬＩＰＥＣ￣Ｊ２)购自北京北纳创联生物有限公司ꎻ呕吐毒素购自美国Ｓｉｇｍａ公司ꎻ胎牛血清(ＦＢＳ)㊁抗生素－抗真菌剂㊁ＤＭＥＭ高糖培养基均购自Ｇｉｂｃｏ公司ꎻ荧光定量ＰＣＲ(ｑＰＣＲ)试剂盒㊁反转录试剂盒购自ＴａＫａＲａ公司ꎻＬ－谷氨酰胺(纯度>９９.０％)㊁活性氧自由基(ＲＯＳ)水平检测试剂盒㊁ＭＴＴ检测试剂盒及ＡｎｎｅｘｉｎＶ￣ＦＩＴＣ细胞凋亡检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所ꎻｃｌｅａｖｅｄ￣Ｃａｓｐａｓｅ３抗体㊁ＮＦ￣κＢ(Ｐ６５)抗体购自美国Ａｂｃａｍ公司ꎮ１.２㊀细胞的复苏与培养将冻存在液氮的细胞取出ꎬ于３７ħ水浴锅解冻ꎬ转移至１５ｍＬ离心管ꎬ１０００ｒ ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎꎻ弃上清液后ꎬ加入４ｍＬＤＭＥＭ高糖培养基(含１０％ＦＢＳ)ꎬ重悬并混匀细胞沉淀ꎬ接种至细胞培养瓶ꎬ放入３７ħ㊁含５％ＣＯ２的细胞培养箱中培养ꎮ显微镜下观察细胞生长状况ꎬ视实际情况更换细胞培养液ꎬ待细胞融合达到８０％时进行传代ꎮ弃上清液ꎬＰＢＳ清洗３次后ꎬ加入１ｍＬ胰酶并消化１.５ｍｉｎꎬ加入１ｍＬ培养基终止消化ꎻ将贴壁的细胞轻轻吹打下来后ꎬ将传代细胞与培养基一起移入新的１５ｍＬ离心管中ꎬ１０００ｒ ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎꎻ弃上清液后ꎬ加入完全培养基ꎬ重悬混匀后ꎬ接种至细胞培养瓶ꎬ放入细胞培养箱培养ꎬ用于试验处理或继续传代ꎮ１.３㊀细胞活力测定采用ＭＴＴ方法测定细胞活力ꎮＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞以１ˑ１０５ｍＬ－１细胞浓度接种到９６孔板ꎮ当９６孔板内的细胞融合度达到８０％时ꎬ分别用相同体积的ＤＭＥＭ(ＣＫ)㊁Ｇｌｎ(０.２５㊁０.７５和１.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１)㊁ＤＯＮ(２.０μｇ ｍＬ－１)㊁ＤＯＮ＋Ｇｌｎ(２.０μｇ ｍＬ－１＋０.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１㊁２.０μｇ ｍＬ－１＋０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１㊁２.０μｇ ｍＬ－１＋１.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１)处理细胞２４ｈꎬ参照ＭＴＴ检测试剂盒说明书检测细胞活力ꎮ１.４㊀试验设计与处理以ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞为模型ꎬ试验分为４个组ꎬ分别为细胞对照组(ＣＫ)㊁Ｇｌｎ组(０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ)㊁ＤＯＮ组(２.０μｇ ｍＬ－１ＤＯＮ)㊁ＤＯＮ＋Ｇｌｎ组(２.０μｇ ｍＬ－１ＤＯＮ＋０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ)ꎮＤＯＮ溶于无水乙醇并配制成１ｍｇ ｍＬ－１的储存液于－２０ħ保存ꎬ用基础培养基稀释至２.０μｇ ｍＬ－１并于４ħ保存ꎮＬ－谷氨酰胺(纯度>９９.０％)用培养基配制成１０ｍｍｏｌ Ｌ－１的储存液于４ħ保存ꎮ将消化后的细胞以均等浓度分别接种到９６孔板或６孔板ꎬ当细胞融合度达到８０％时ꎬＧｌｎ㊁ＤＯＮ和ＤＯＮ＋Ｇｌｎ组分别用含有ＤＯＮ或(和)Ｇｌｎ的ＤＭＥＭ高糖培养基替代ＤＭＥＭ高糖培养基ꎬ继续培养(４㊁８和２４ｈ)进行相关试验ꎮ２４７南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第４３卷１.５㊀细胞ＲＯＳ水平测定将盖玻片消毒后放入１２孔板中ꎬ将１００μＬ细胞悬液按１０５ｍＬ－１的密度接种于１２孔板ꎬ４~６ｈ后显微镜下观察细胞是否贴壁ꎬ贴壁后每孔加１ｍＬ完全培养基ꎮ细胞融合度达到８０％时ꎬ弃掉培养液ꎬ用相同体积的ＤＭＥＭ(ＣＫ)㊁Ｇｌｎ(０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１)㊁ＤＯＮ(２.０μｇ ｍＬ－１)㊁ＤＯＮ＋Ｇｌｎ(２.０μｇ ｍＬ－１ＤＯＮ＋０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ)处理细胞２４ｈ后ꎬ参照ＲＯＳ检测试剂盒说明书检测ＲＯＳ水平ꎮ操作结束后用激光共聚焦显微镜观察爬片并拍照ꎮ１.６㊀细胞凋亡率测定ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞以２ˑ１０５ｍＬ－１浓度接入６孔板ꎬ当细胞融合度达到８０％时ꎬ用不含乙二胺四乙酸(ＥＤＴＡ)的胰酶进行消化ꎬ参照ＡｎｎｅｘｉｎＶ￣ＦＩＴＣ细胞凋亡试剂盒说明书ꎬ用流式细胞仪检测细胞凋亡率ꎮ１.７㊀细胞凋亡和炎症相关基因表达水平的测定细胞以２ˑ１０５ｍＬ－１浓度接入６孔板ꎬ当细胞融合度达到８０％时ꎬ提取细胞ＲＮＡꎻ测定细胞ＲＮＡ浓度后ꎬ按照ＴａＫａＲａ反转录试剂盒说明书对ＲＮＡ进行反转录ꎬ获得ｃＤＮＡꎻ测得ｃＤＮＡ浓度后ꎬ将各样品ｃＤＮＡ浓度稀释到１００ｎｇ μＬ－１ꎬ－２０ħ保存或用于后续试验ꎮ按照ＴａＫａＲａＳＹＢＲ®ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ试剂盒说明书加入各反应试剂ꎬ在ＲＴ￣ｑＰＣＲ仪上检测细胞凋亡和炎症相关基因的表达ꎮ设定反应程序如下:９５ħ３０ｓꎻ９５ħ５ｓꎬ６０ħ３４ｓꎬ４０个循环ꎻ９５ħ１５ｓꎬ６０ħ１ｍｉｎꎬ９５ħ１５ｓꎮ采用２－ΔΔＣＴ法计算各基因相对表达水平ꎮ表１㊀ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞凋亡和炎症因子相关基因的引物序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｇｅｎｅｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓ基因名称Ｇｅｎｅｎａｍｅ引物序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓ(５ᶄң３ᶄ)产物长度/ｂｐ㊀Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ㊀㊀β￣ａｃｔｉｎ㊀㊀ＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡ/ＴＴＴＧＧＡＡＡＧＧＣＡＧＧＧＡＣＴ２１８㊀㊀ＩＬ￣１β㊀㊀㊀㊀ＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣ/ＡＴＣＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴＧＣＡＣ２２３㊀㊀ＩＬ￣６㊀㊀㊀㊀ＴＴＣＡＣＣＴＣＴＣＣＧＧＡＣＡＡＡＡＣ/ＴＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＣＣＴＴＧＣＴ１２２㊀㊀ＴＮＦ￣α㊀㊀ＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣ/ＧＡＧＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡＴＡＣＣＣＡＣ１４６㊀㊀ＣＯＸ￣２㊀㊀㊀㊀ＡＧＡＡＧＣＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＴＴＣ/ＡＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＧＧＡＧ２１５㊀㊀Ｃａｓｐａｓｅ￣３㊀㊀㊀㊀ＧＧＡＡＴＧＧＣＡＴＧＴＣＧＡＴＣＴＧＧＴ/ＡＣＴＧＴＣＣＧＴＣＴＣＡＡＴＣＣＣＡＣ３５１㊀㊀Ｃａｓｐａｓｅ￣８㊀㊀㊀㊀ＴＣＴＧＣＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＴＧＡＴＴ/ＴＣＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＣ１６５㊀㊀ＢＡＫ㊀㊀ＣＣＣＴＧＴＡＣＧＴＣＴＡＣＣＡＧＡＧＧ/ＡＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＴＡＧＣＡ１７９㊀㊀Ｂｃｌ￣２㊀㊀㊀㊀ＧＣＴＡＣＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＡＧＧＧＡ/ＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＴＡＡＧＡＧ１６１１.８㊀细胞凋亡和炎症相关蛋白表达的测定利用免疫荧光法测定细胞凋亡和炎症相关蛋白的表达情况ꎮ用相同体积的ＤＭＥＭ(ＣＫ)㊁Ｇｌｎ(ＤＭＥＭ＋０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ)㊁ＤＯＮ(ＤＭＥＭ＋２.０μｇ ｍＬ－１ＤＯＮ)㊁ＤＯＮ＋Ｇｌｎ(ＤＭＥＭ＋２.０μｇ ｍＬ－１ＤＯＮ＋０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ)处理细胞２４ｈ后ꎬ将培养基移除ꎬ每孔加入ＰＢＳ(３７ħ预热)１ｍＬꎬ放在摇床上清洗(３次ꎬ每次５ｍｉｎ)ꎻ移除ＰＢＳꎬ加４％多聚甲醛(１ｍＬ)ꎬ室温固定１ｈꎻ移除多聚甲醛ꎬＰＢＳ摇床清洗后ꎬ加入１００μＬＴｒｉｔｏｎＸ－１００(０.５％)通透１０ｍｉｎꎬＰＢＳ清洗ꎻ加入１ｍＬ１％牛血清白蛋白(ＢＳＡ)ꎬ室温封闭１ｈꎻ盖玻片上滴加５０μＬ一抗ꎬ３７ħ于湿盒中避光孵育１ｈꎻＰＢＳ清洗后ꎬ滴加５０μＬＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８标记的二抗ꎬ于湿盒中３７ħ避光孵育１ｈꎻ移除二抗ꎬＰＢＳ摇床清洗后滴加５０μＬ４ᶄꎬ６－二脒基－２－苯基吲哚(ＤＡＰＩ)ꎬ于湿盒中室温避光孵育１０ｍｉｎꎬＰＢＳ清洗ꎻ载玻片上滴加荧光抗淬灭剂ꎬ将细胞爬片倒扣在载玻片上封片ꎮ１.９㊀数据统计与分析试验数据用平均数ʃ标准差( ｘʃＳＤ)表示ꎬ采用ＳＰＳＳ２０.０软件进行单因素方差分析(Ｏｎｅ￣ｗａｙＡＮＯＶＡ)ꎬ并用ＬＳＤ法进行多重比较ꎬ试验数据分析采用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５软件完成ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀Ｇｌｎ对ＤＯＮ诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞活力的影响由图１可知:与对照组相比ꎬ０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ组和１.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ组细胞的存活率显著升高(Ｐ<０.０１)ꎬＤＯＮ组(２.０μｇ ｍＬ－１)和ＤＯＮ＋０.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ组细胞的存活率显著降低(Ｐ<０.０１)ꎬ而ＤＯＮ＋０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ组和ＤＯＮ＋１.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ组细胞的存活率无显著差异ꎮ与ＤＯＮ组相比ꎬＤＯＮ＋０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ和ＤＯＮ＋１.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ组细胞存活率显著上升(Ｐ<０.０１)ꎮＤＯＮ＋０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ组㊀第４期李若楠ꎬ等:谷氨酰胺对呕吐毒素诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞凋亡和炎症的影响细胞活力与对照组相近ꎬ因此ꎬ我们选取０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ作为试验剂量ꎮ图１㊀谷氨酰胺(Ｇｌｎ)对呕吐毒素(ＤＯＮꎬ２.０μｇ ｍＬ－１)诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞活力的影响Ｆｉｇ １㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅ(Ｇｌｎ)ｏｎｔｈｅｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｉｎＩＰＥＣ￣Ｊ２ｉｎｄｕｃｅｄｂｙｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ(ＤＯＮ)１)ＣＫ:对照组Ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌꎻ０.２５㊁０.７５㊁１.２５Ｇｌｎ表示０.２５㊁０.７５㊁１.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎꎮ０.２５ꎬ０.７５ꎬ１.２５Ｇｌｎｉｎｄｉｃａｔｅ０.２５ꎬ０.７５ꎬ１.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ.２)不同大写字母表示处理间差异显著(Ｐ<０.０１)ꎮ下同ꎮＤｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓａｂｏｖｅｔｈｅｂａｒｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０.０１ｌｅｖｅｌ.Ｔｈｅｓａｍｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ.２.２㊀Ｇｌｎ对ＤＯＮ诱导细胞ＲＯＳ水平的影响如图２所示:ＤＯＮ(２.０μｇ ｍＬ－１)处理ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞２４ｈ后ꎬ与对照组相比ꎬＤＯＮ组ＲＯＳ的荧光值显著升高(Ｐ<０.０１)ꎻ而Ｇｌｎ(０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１)处理ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞２４ｈ后ꎬ其ＲＯＳ的荧光值无显著变化ꎮ与ＤＯＮ组相比ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组细胞ＲＯＳ的荧光值显著降低(Ｐ<０.０１)ꎮ图２㊀Ｇｌｎ对ＤＯＮ诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞ＲＯＳ水平的影响(ˑ４００)Ｆｉｇ ２㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＧｌｎｏｎＲＯＳｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙＤＯＮｉｎＩＰＥＣ￣Ｊ２ｃｅｌｌｓ㊀㊀ＣＫ:对照组ＢｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌꎻＧｌｎ:０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１ＧｌｎꎻＤＯＮ:２.０μｇ ｍＬ－１ＤＯＮꎻＤＯＮ＋Ｇｌｎ:２.０μｇ ｍＬ－１ＤＯＮ＋０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｇｌｎ.下同ꎮＴｈｅｓａｍｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ.２.３㊀Ｇｌｎ对ＤＯＮ诱导细胞凋亡的影响如图３所示:ＤＯＮ(２.０μｇ ｍＬ－１)处理ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞２４ｈ后ꎬ早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例显著增加(Ｐ<０.０１)ꎻ用Ｇｌｎ(０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１)单独处理细胞时ꎬ会显著降低早期凋亡细胞的比例(Ｐ<０.０１)ꎻＤＯＮ和Ｇｌｎ同时处理细胞时ꎬ与ＤＯＮ组相比ꎬ早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例显著性降低(Ｐ<０.０１)ꎮ２.４㊀Ｇｌｎ对ＤＯＮ诱导细胞凋亡和细胞炎症相关基因表达的影响２.４.１㊀对细胞凋亡相关基因表达的影响㊀由图４可知:ＤＯＮ(２.０μｇ ｍＬ－１)或Ｇｌｎ(０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１)处理ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞４ｈꎬ与对照组相比ꎬＧｌｎ组Ｃａｓｐａｓｅ￣３基因表达水平显著升高(Ｐ<０.０５)ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组Ｃａｓｐａｓｅ￣３３４７南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第４３卷和Ｃａｓｐａｓｅ￣８基因表达水平显著升高(Ｐ<０.０５)ꎻ与ＤＯＮ组相比ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组Ｃａｓｐａｓｅ￣３和Ｃａｓｐａｓｅ￣８基因的表达水平显著升高(Ｐ<０.０５)ꎮＤＯＮ或Ｇｌｎ处理ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞８ｈꎬ与对照组相比ꎬＧｌｎ组Ｂｃｌ￣２基因的表达水平显著升高(Ｐ<０.０５)ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组Ｃａｓｐａｓｅ￣８㊁ＢＡＫ和Ｂｃｌ￣２基因的表达水平显著升高(Ｐ<０.０５)ꎻ与ＤＯＮ组相比ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组Ｃａｓｐａｓｅ￣３基因的表达水平显著降低(Ｐ<０.０５)ꎬＢＡＫ㊁Ｂｃｌ￣２㊁Ｃａｓｐａｓｅ￣８基因的表达水平显著升高(Ｐ<０.０５)ꎮ２４ｈ时ꎬ各基因表达水平在各处理组间无显著性差异ꎮ图３㊀Ｇｌｎ对ＤＯＮ诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞凋亡的影响Ｆｉｇ ３㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＧｌｎｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＤＯＮｉｎＩＰＥＣ￣Ｊ２ｃｅｌｌｓ图４㊀Ｇｌｎ对ＤＯＮ诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞凋亡相关基因表达的影响Ｆｉｇ ４㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＧｌｎｏｎｇｅｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＩＰＥＣ￣Ｊ２ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＤＯＮ㊀㊀相同时间内ꎬ不同小写字母表示处理间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮＡｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅꎬｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓａｂｏｖｅｔｈｅｂａｒｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆ￣ｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０.０５ｌｅｖｅｌ.２.４.２㊀对细胞炎症相关基因ｍＲＮＡ表达的影响㊀由图５可知:ＤＯＮ(２.０μｇ ｍＬ－１)或Ｇｌｎ(０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１)处理ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞４ｈꎬ与对照组相比ꎬＤＯＮ组ＩＬ￣６㊁ＣＯＸ￣２和ＴＮＦ￣αｍＲＮＡ表达水平显著升高(Ｐ<０.０１)ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组ＣＯＸ￣２㊁ＩＬ￣１β和ＴＮＦ￣αｍＲＮＡ表达水平显著升高(Ｐ<０.０１)ꎻ与ＤＯＮ组相比ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组的ＩＬ￣１β和ＴＮＦ￣αｍＲＮＡ表达水平显著升高(Ｐ<０.０１)ꎬＩＬ￣６和ＣＯＸ￣２ｍＲＮＡ表达水平显著降低(Ｐ<０.０１)ꎮＤＯＮ或Ｇｌｎ处理ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞８ｈꎬ与对照组相比ꎬＧｌｎ组ＩＬ￣１βｍＲＮＡ表达水平显著升高(Ｐ<０.０１)ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组ＩＬ￣６ｍＲＮＡ表达水平显著增加(Ｐ<０.０１)ꎻ与ＤＯＮ组相比ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组的ＩＬ￣６ｍＲＮＡ４４７㊀第４期李若楠ꎬ等:谷氨酰胺对呕吐毒素诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞凋亡和炎症的影响表达水平显著升高(Ｐ<０.０１)ꎮ２４ｈ时ꎬ与对照组相比ꎬＧｌｎ组ＩＬ￣１βｍＲＮＡ表达水平显著升高(Ｐ<０.０１)ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组ＩＬ￣６ｍＲＮＡ表达水平显著升高(Ｐ<０.０１)ꎻ与ＤＯＮ组相比ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组ＩＬ￣６ｍＲＮＡ表达水平显著升高(Ｐ<０.０１)ꎮ图５㊀Ｇｌｎ对ＤＯＮ诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞炎症相关基因表达的影响Ｆｉｇ ５㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＧｌｎｏｎｇｅｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎＩＰＥＣ￣Ｊ２ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＤＯＮ㊀㊀相同时间内ꎬ不同大写字母表示处理间差异显著(Ｐ<０.０１)ꎮＡｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅꎬｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓａｂｏｖｅｔｈｅｂａｒｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０.０１ｌｅｖｅｌ.２.５㊀Ｇｌｎ对ＤＯＮ诱导细胞凋亡和细胞炎症相关蛋白表达水平的影响由图６可知:ＤＯＮ(２.０μｇ ｍＬ－１)处理ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞２４ｈ后ꎬＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞的ｃｌｅａｖｅｄ￣Ｃａｓｐａｓｅ３蛋白在细胞质内大量表达ꎮ与对照组相比ꎬＧｌｎ(０.７５ｍｍｏｌ Ｌ－１)组ｃｌｅａｖｅｄ￣Ｃａｓｐａｓｅ３蛋白的荧光强度无显著变化ꎬＤＯＮ组ｃｌｅａｖｅｄ￣Ｃａｓｐａｓｅ３蛋白的荧光强度极显著升高(Ｐ<０.０１)ꎻ与ＤＯＮ组比ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组细胞的ｃｌｅａｖｅｄ￣Ｃａｓｐａｓｅ３蛋白荧光强度有所降低但无统计学差异ꎻＮＦ￣κＢ蛋白在细胞质内被观察到ꎬ且ＤＯＮ处理后其蛋白的荧光强度与对照组相比显著升高ꎮ与对照组相比ꎬＧｌｎ组ＮＦ￣κＢ蛋白的荧光强度无显著变化ꎻ与ＤＯＮ组相比ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组细胞的ＮＦ￣κＢ蛋白荧光强度减少但无显著差异ꎻ磷酸化ＮＦ￣κＢ蛋白由细胞质转移至细胞核而大量表达ꎮ与对照组相比ꎬＧｌｎ组和ＤＯＮ＋Ｇｌｎ组细胞的磷酸化ＮＦ￣κＢ蛋白荧光强度无显著变化ꎬＤＯＮ组蛋白的荧光强度显著增加(Ｐ<０.０５)ꎮ与ＤＯＮ组相比ꎬＤＯＮ＋Ｇｌｎ组细胞的磷酸化ＮＦ￣κＢ蛋白荧光强度显著降低(Ｐ<０.０５)ꎮ３㊀讨论氨基酸是生物体内重要的一类物质ꎬ参与机体中蛋白质的合成和各种生理活动ꎮＧｌｎ作为哺乳动物体内的非必需氨基酸ꎬ可由体内其他氨基酸转化而来ꎬ其代谢后产生的ＡＴＰ是葡萄糖的３倍ꎬ被认为是小肠的主要供能物质[１２]ꎮＧｌｎ具有抗氧化功能ꎬ可以促进谷胱甘肽过氧化物酶基因的表达ꎬ还可通过氧化供能调节信号传递过程中细胞凋亡酶的活性ꎬ抑制一氧化氮的合成速率ꎬ参与由ＴＮＦ￣α诱导的细胞毒性作用和抗氧化物质谷胱甘肽的合成[１３]ꎮＲＯＳ检测结果表明ꎬ添加Ｇｌｎ可以降低由ＤＯＮ引起的过量ＲＯＳꎬ这可能是由于谷胱甘肽促进谷胱甘肽过氧化物酶的合成ꎬ从而提高细胞抗氧化能力ꎬ清除部分氧自由基ꎬ从而降低ＲＯＳ水平ꎮＥｖａｎｓ等[１４]研究发现ꎬ在ＨＴ￣２９结肠癌细胞中由ＴＮＦ￣α相关凋亡诱导配体(ＴＲＡＩＬ)引起的细胞凋亡会提高细胞核的聚缩ꎬ激活Ｃａｓｐａｓｅ￣８和Ｃａｓｐａｓｅ￣３的表达ꎻ添加Ｇｌｎ可抑制由ＴＲＡＩＬ引起的细胞凋亡ꎬ但其缓解由细胞因子升高引起的细胞凋亡机制与细胞ＧＳＨ介导的抗氧化应激机制并不相同ꎮ本试验结果发现ꎬ添加Ｇｌｎ可降低由ＤＯＮ诱导的ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞凋亡相关蛋白ｃｌｅａｖｅｄ￣Ｃａｓｐａｓｅ３的表达ꎮ因此ꎬ我们猜想Ｇｌｎ对肠上皮细胞的保护作用可能与凋亡相关蛋白表达的改变相关ꎮＧｌｎ作为供能物质ꎬ当机体经口或非经口途径摄入Ｇｌｎ后肠道的细胞因子水平会有所降低ꎮ在对人５４７６４７卷南㊀京㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报第４３图６㊀Ｇｌｎ对ＤＯＮ诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞ｃｌｅａｖｅｄ￣Ｃａｓｐａｓｅ３㊁ＮＦ￣κＢ和磷酸化ＮＦ￣κＢ蛋白表达的影响Ｆｉｇ ６㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＧｌｎｏｎｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｌｅａｖｅｄ￣Ｃａｓｐａｓｅ３ꎬＮＦ￣κＢａｎｄｐｈｏｓｐｈｏ￣ＮＦ￣κＢｉｎｄｕｃｅｄｂｙＤＯＮｉｎＩＰＥＣ￣Ｊ２ｃｅｌｌｓ㊀㊀上:染色图ꎬˑ４００ꎻ下:统计图ꎮＴｏｐ:Ｃｏｌｏｒｉｎｇｃｈａｒｔꎬˑ４００ꎻＢｏｔｔｏｍ:Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｃｈａｒｔ.不同大小写字母分别表示在０.０１和０.０５水平上差异显著ꎮＤｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌａｎｄｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓａｂｏｖｅｔｈｅｂａｒｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０.０１ａｎｄ０.０５ｌｅｖｅｌｓ.体进行肠道活检时发现ꎬ采用Ｇｌｎ治疗的病人肠道促炎细胞因子ＩＬ￣６和ＩＬ￣８基因表达量显著降低ꎬ这主要是因为Ｇｌｎ抑制了ＮＦ￣κＢ的激活[１５]ꎮ脑部创伤大鼠模型注射Ｇｌｎ后发现ꎬＧｌｎ会缓解大鼠肠道组织形态损伤并降低肠道内细胞因子的表达量ꎬ其缓解作用可能是通过降低肠道内ＮＦ￣κＢ蛋白的表达量来实现的[１６]ꎮ谷氨酰胺对急性肺损伤小鼠具有保护作用[１７]ꎮ本试验结果表明ꎬＧｌｎ处理２４ｈ可以降低ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞促炎细胞因子ＩＬ￣６和ＣＯＸ￣２基因表达量ꎬ降低ＮＦ￣κＢ和磷酸化ＮＦ￣κＢ蛋白的表达量ꎬ提高细胞的抗炎能力ꎬ但在处理４ｈ和８ｈ时ꎬＧｌｎ促进炎症因子ＩＬ￣６和ＩＬ￣１β基因的表达ꎮ因此ꎬ我们推测Ｇｌｎ缓解细胞炎症反应与处理时间有关ꎬ短时间内炎症因子的释放可能是细胞受到外界刺激启动防御机制的一种表现ꎬ随处理时间的延长才显现出Ｇｌｎ的缓解作用ꎬ炎症相关因子的表达量开始呈降低趋势ꎮＴＮＦ￣α是巨噬细胞被激活后产生的细胞因子ꎬ具有细胞毒性ꎬ其毒性作用会抑制Ｇｌｎ的蛋白质合成功能[１８]ꎮ研究发现ＲＯＳ通过诱导细胞ＴＮＦ￣α的增加ꎬ促进肾小球上皮细胞凋亡ꎬ而加入过氧化物清除剂后ꎬ凋亡比例降低[１９]ꎮ本试验结果显示ꎬ虽然Ｇｌｎ可以清除ＲＯＳꎬ但ＤＯＮ＋Ｇｌｎ组ＴＮＦ￣α基因的表达量与ＤＯＮ组相比显著升高ꎬ这可能与Ｇｌｎ的处理时间㊁靶向性㊁特异性和不同抗氧化剂的过度补偿作用有关ꎮ在基因水平上ꎬＧｌｎ促进ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞内ＴＮＦ￣α基因的表达ꎬ进而促进Ｃａｓｐａｓｅ￣３及Ｃａｓｐａｓｅ￣８基因的表达ꎮ但蛋白表达结果表明Ｇｌｎ降低细胞凋亡和炎症相关蛋白的表达ꎬ因此ꎬ试验结果最终表现为细胞凋亡相关蛋白的表达量降低ꎬ细胞凋亡比例降低ꎮ本研究结果表明ꎬＧｌｎ通过清除ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞中过量的ＲＯＳ㊁调节凋亡和炎症相关基因及蛋白的表达水平来缓解由ＤＯＮ引起的肠道上皮细胞损伤ꎬ该结果为Ｇｌｎ在动物生产中的应用提供了基础理论依据ꎮ参考文献Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ:[１]㊀ＬｉＲꎬＬｉＹꎬＳｕＹꎬｅｔａｌ.Ｓｈｏｒｔ￣ｔｅｒｍｉｎｇｅｓｔｉｏｎｏｆｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌｉｎｎａｔｕｒａｌｌｙｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄｆｅｅｄａｌｔｅｒｓｐｉｇｌｅｔｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅａｎｄｇｕｔｈｏｒｍｏｎｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎ[Ｊ].ＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１８ꎬ８９(８):１１３４－１１４３.[２]ＪｉＦꎬＸｕＪꎬＬｉｕＸꎬｅｔａｌ.ＮａｔｕｒａｌｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌａｎｄｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅｉｎｗｈｅａｔｆｒｏｍＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅꎬＣｈｉｎａ[Ｊ].ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１４ꎬ７４７㊀第４期李若楠ꎬ等:谷氨酰胺对呕吐毒素诱导ＩＰＥＣ￣Ｊ２细胞凋亡和炎症的影响１５７:３９３－３９７.[３]龚阿琼ꎬ全明旭ꎬ周锋ꎬ等.２０１７年上半年我国饲料原料及配合饲料霉菌毒素检测分析[Ｊ].中国饲料ꎬ２０１７(２０):４１－４３.ＧｏｎｇＡＱꎬＱｕａｎＭＸꎬＺｈｏｕＦꎬｅｔａｌ.ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｙｃｏｔｏｘｉｎｉｎｆｅｅｄｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓａｎｄｃｏｍｐｏｕｎｄｆｅｅｄｉｎＣｈｉｎａｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｈａｌｆｏｆ２０１７[Ｊ].ＣｈｉｎｅｓｅＦｅｅｄꎬ２０１７(２０):４１－４３(ｉｎＣｈｉｎｅｓｅｗｉｔｈＥｎｇｌｉｓｈａｂｓｔｒａｃｔ).[４]ＷｕＱꎬＫｕ㊅ｃａＫꎬＨｕｍｐｆＨＵꎬｅｔａｌ.Ｆａｔｅｏｆｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌａｎｄｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ￣３￣ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｄｕｒｉｎｇｃｅｒｅａｌ￣ｂａｓｅｄｔｈｅｒｍａｌｆｏｏｄｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ:ａｒｅｖｉｅｗｓｔｕｄｙ[Ｊ].ＭｙｃｏｔｏｘｉｎＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１７ꎬ３３(１):７９－９１.[５]Ｇｏｎｚ ｌｅｚ￣ＣａｓｔｒｏＡＭꎬＭａｒｔíｎｅｚＣꎬＳａｌｖｏ￣ＲｏｍｅｒｏＥꎬｅｔａｌ.Ｍｕｃｏｓａｌｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｉｇｎａｔｕｒｅｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅｉｎｉｒｒｉｔａｂｌｅｂｏｗｅｌｓｙｎｄｒｏｍｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙａｎｄＨｅｐａｔｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ３２(１):５３－６３.[６]ＡｗａｄＷＡꎬＺｅｎｔｅｋＪ.Ｔｈｅｆｅｅｄｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌａｆｆｅｃｔｓｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｔｈｒｏｕｇｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ[Ｊ].ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ８９(６):９６１－９６５.[７]ＢｒａｃａｒｅｎｓｅＡＰꎬＬｕｃｉｏｌｉＪꎬＧｒｅｎｉｅｒＢꎬｅｔａｌ.Ｃｈｒｏｎｉｃｉｎｇｅｓｔｉｏｎｏｆｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌａｎｄｆｕｍｏｎｉｓｉｎꎬａｌｏｎｅｏｒｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎꎬｉｎｄｕｃｅｓｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅｏｆｐｉｇｌｅｔｓ[Ｊ].ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎꎬ２０１２ꎬ１０７(１２):１７７６－１７８６.[８]ＫａｎｇＲꎬＬｉＲꎬＤａｉＰꎬｅｔａｌ.ＤｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｏｆＩＰＥＣ￣Ｊ２ｃｅｌｌｓｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇＲＯＳｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＰｏｌｌｕｔｉｏｎꎬ２０１９ꎬ２５１:６８９－６９８.[９]ＬｉｕＹꎬＸｉｏｎｇＸꎬＴａｎＢＥꎬｅｔａｌ.Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｈｅａｌｔｈｏｆｗｅａｎｅｄｐｉｇｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１９ꎬ６:４６－５９.[１０]ＷａｎｇＨꎬＺｈａｎｇＣꎬＷｕＧＹꎬｅｔａｌ.Ｇｌｕｔａｍｉｎｅｅｎｈａｎｃｅｓｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｍｏｄｕｌａｔｅｓｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ￣ｒｅｌｅａｓｉｎｇｆａｃｔｏｒｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｔｈｅｊｅｊｕｎｕｍｏｆｗｅａｎｌｉｎｇｐｉｇｌｅｔｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎꎬ２０１５ꎬ１４５(１):２５－３１.[１１]ＸｉｎｇＳꎬＺｈａｎｇＢＬꎬＬｉｎＭꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｌａｎｙｌ￣ｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａｂａｒｒｉｅｒｉｎｗｅａｎｅｄｐｉｇｌｅｔｓｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｗｉｔｈｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ[Ｊ].ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１７ꎬ９８(１):１４４－１５５.[１２]ＷａｎｇＢꎬＷｕＧꎬＺｈｏｕＺꎬｅｔａｌ.Ｇｌｕｔａｍｉｎｅａｎｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓꎬ２０１５ꎬ４７(１０):２１４３－２１５４.[１３]ＤｉｎｇＺꎬＬｉＷꎬＨｕａｎｇＪꎬｅｔａｌ.Ｄｉｅｔａｒｙａｌａｎｙｌ￣ｇｌｕｔａｍｉｎｅａｎｄｖｉｔａｍｉｎＥｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓｃｏｕｌｄｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｙｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＰｘａｎｄＰＰＡＲαｇｅｎｅｓꎬａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎꎬｆｅｅｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎꎬｇｒｏｗｔｈꎬａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｊｕｖｅｎｉｌｅｃｏｂｉａ[Ｊ].Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅꎬ２０１７ꎬ４７０:９５－１０２.[１４]ＥｖａｎｓＭＥꎬＪｏｎｅｓＤＰꎬＺｉｅｇｌｅｒＴＲ.Ｇｌｕｔａｍｉｎｅｐｒｅｖｅｎｔｓｃｙｔｏｋｉｎｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｉｃｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎꎬ２００３ꎬ１３３(１０):３０６５－３０７１.[１５]ＫｉｍＭＨꎬＫｉｍＨ.Ｔｈｅｒｏｌｅｓｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｉｎｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｉｔｓｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｄｉｓｅａｓｅｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０１７ꎬ１８(５):１０５１－１０６６.[１６]ＣｈｅｎＧꎬＳｈｉＪꎬＱｉＭꎬｅｔａｌ.ＧｌｕｔａｍｉｎｅｄｅｃｒｅａｓｅｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｐｒｏ￣ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｆｔｅｒｔｒａｕｍａｔｉｃｂｒａｉｎｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｓ[Ｊ].ＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００８ꎬ５７(２):５７－６４.[１７]黄杰ꎬ刘京ꎬ马娜娜ꎬ等.谷氨酰胺对急性肺损伤小鼠ＭＵＣ５ＡＣ的调节及其对肺脏的保护作用[Ｊ].畜牧与兽医ꎬ２０１９ꎬ５１(４):９７－１０３.ＨｕａｎｇＪꎬＬｉｕＪꎬＭａＮＮꎬｅｔａｌ.ＲｅｇｕｌａｔｉｖｅａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＵＣ５ＡＣ[Ｊ].ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ＆ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１９ꎬ５１(４):９７－１０３(ｉｎＣｈｉｎｅｓｅｗｉｔｈＥｎｇｌｉｓｈａｂｓｔｒａｃｔ).[１８]ＺｈｏｕＪꎬＦａｎＳꎬＣａｏＹꎬｅｔａｌ.Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ￣αｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｆｒａｃｔｉｏｎａｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒａｔｅｏｆｔｈｅｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙｇｌｕｔａｍｉｎｅｉｎｒａｔｓ[Ｊ].ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１５ꎬ９(２):５４７－５５２.[１９]ＳｖｅｒｒｉｓｓｏｎＫꎬＡｘｅｌｓｓｏｎＪꎬＲｉｐｐｅＡꎬｅｔａｌ.Ａｃｕｔｅｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ(ＲＯＳ)￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｆＩＬ￣１βꎬＴＮＦ￣αꎬａｎｄＩＬ￣６ｏｎｔｈｅｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｂａｒｒｉｅｒ(ＧＦＢ)ｉｎｖｉｖｏ[Ｊ].ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙＲｅｎａｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ３０９(９):Ｆ８００－Ｆ８０６.责任编辑:周广礼。

细胞表面的聪明受体作者:王曼徐华强来源:科学杂志（）录入:Admin 字体:构成生物体数以亿计的细胞并非孤立地存在，而是一直处于互相联系中，感知周围环境的变化，作出相应反应，因为它们表面有“聪明”的受体。

强光使人闭眼、花香使人愉悦、黑暗使人恐惧……，你有没有想过，人的大脑是如何感知外部环境变化并作出反应的？人的身体由数万亿个细胞组成并精密协调地工作，完成各种生理功能，这其中又是什么充当传感器来传递信息，使细胞感知周围环境。

这些问题一直是个谜，在20世纪的大部分时间里，人们不清楚充当传感器的这些物质是由什么组成的，以及它们如何工作。

两位医生出身的科学家经过不懈的努力，揭示了其中的奥秘：细胞表面存在着一类称为G 蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor，简称GPCR)的蛋白质，它将从外界接受的不同信号分子，通过自身构象的变化激活细胞异源三聚体的鸟苷酸结合蛋白（即G蛋白），后者将信号传至胞的效应分子引起反应。

这两位科学家是美国霍华德·休斯医学研究所和美国杜克大学医学中心医学教授莱夫科维茨（Robert Joseph Lefkowitz），斯坦福大学医学院分子与细胞生理学教授科比尔卡（Brian Kent Kobilka）。

因为他们突破性地揭示了G蛋白偶联受体的在工作机制，共同获得了2012年度诺贝尔化学奖。

莱夫科维茨1968年利用放射性追踪细胞受体，将碘同位素标记糖皮质激素和肾上腺素，证明了受体独立于腺苷酸环化酶（AC）的存在，随后分离纯化了β2肾上腺素能受体（β2-adrenergic receptor），证实了细胞表面受体的存在。

后加入的科比尔卡则将编码β-肾上腺素能受体的基因从人类基因组中分离出来，并创造性地获得了β-肾上腺素能受体被激素激活并向细胞发送信号的精确图像，弄清了它的三维结构及其信号转导机制。

什么是G 蛋白偶联受体生物体的基本单位是细胞，细胞由细胞膜及其的细胞质和细胞核组成，外界信号进入细胞首先要通过细胞膜，水和氧气等小分子物质能自由通过，而某些离子和大分子物质则不能自由通过。

基于蛋白质组学的植物耐盐机制和分子标记研究植物是我们生活中不可或缺的一部分。

而随着人类活动的不断增加，环境的污染和全球气候变化问题日益严峻，这也在很大程度上影响了植物的生长和发展。

其中，盐渍化是一个普遍存在的现象，特别是在世界上许多干旱的地区。

为了使植物适应这种环境，科学家们从不同的角度去研究植物的适应性。

其中，基于蛋白质组学的研究是当前研究植物耐盐机制和分子标记的重要手段之一。

一、植物耐盐机制研究植物的耐盐性主要是通过减轻和适应两种方式来完成的。

减轻盐胁迫是指通过减少盐分进入植物体内以及提高盐分排出量的策略。

适应盐胁迫则是指增强植物对盐分的耐受性，使植物在含盐环境中仍能正常生长发育。

具体来说，植物的耐盐性主要表现在以下几个方面：（1）盐胁迫信号传导（Na+、K+/Na+交换、Ca2+等）：盐胁迫会影响植物细胞膜的离子通道活性，导致细胞膜的通透性发生变化。

其中，Na+、K+/Na+交换和Ca2+等重要离子在植物的耐盐过程中起到了重要的作用。

因此，它们的信号传导机制以及相关的激素调控机制在植物耐盐性的研究中是非常重要的。

（2）离子平衡：由于盐分会影响植物体内K+、Na+、Cl-等离子的浓度平衡，而这种失衡会影响植物的生长和发育。

因此，在植物耐盐性的研究中，研究植物细胞膜上的离子通道的调控机制和离子平衡机制非常重要。

（3）保护酶和蛋白质的积累：受盐分胁迫影响，植物体内会增加一些保护酶（如超氧化物歧化酶和过氧化物酶）和特定的蛋白质（如HSPs）的积累，防止盐分对植物生长和发育的影响。

（4）激素参与：除细胞内离子之外，激素在植物较强的耐盐机制中也发挥了重要作用。

其中，ABA作为最重要的激素之一，在植物耐盐性研究中扮演着重要的角色。

二、基于蛋白质组学的研究随着蛋白质组学技术的快速发展，科学家们利用蛋白质组学技术研究植物对盐胁迫的适应性和耐受性机制，已经成为当前植物生物技术和分子生物学研究的热点之一。

（1）蛋白质组成分析：通过蛋白质组成分析可以了解植物胁迫后产生的蛋白质变化。

前沿空间蛋⽩质组学：⼀种强⼤的细胞⽣物学发现⼯具真核细胞⾼度区室化，⽣物过程被分隔在不同的区室进⾏。

蛋⽩质功能与亚细胞定位密切相关，不同的区室提供不同的化学环境（例如pH和氧化还原条件）、不同的潜在作⽤配体或底物。

因此，对蛋⽩质亚细胞定位的严格控制是细胞⽣理学的重要调控内容。

⼤多数细胞⽣物学过程涉及蛋⽩质亚细胞定位的变化，例如转录因⼦在细胞核-胞浆的穿梭、细胞凋亡过程中线粒体蛋⽩的重新定位，以及细胞表⾯信号传导受体的内吞等。

相反，蛋⽩质的错误定位通常与细胞功能障碍和疾病相关，包括神经变性、癌症和代谢紊乱等。

以蛋⽩质空间定位为研究⽅向的空间蛋⽩质组现在已经⽤于揭⽰⼈类蛋⽩质组的复杂结构，如单细胞变异、动态蛋⽩质易位，相互作⽤⽹络改变，以及蛋⽩定位改变等。

⼀些研究者也已成功运⽤空间蛋⽩质组学来研究疾病，包括急性病毒感染、肝病等。

2019年5⽉，KTH 瑞典皇家理⼯学院的 Emma Lundberg 教授和德国马克斯-普朗克研究所的Georg H. H. Borner 教授，在国际著名期刊 Nature Reviews | Molecular CellBiology（IF=35.612）发表了题为《Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cellbiology》的综述性⽂章，系统介绍了空间蛋⽩质组学的技术、未来发展的机遇与挑战。

下⾯⼩编为⼤家解读⼀下这篇综述。

01空间蛋⽩质组学研究⽅法⽬前三种互补的⽅法可⽤于空间蛋⽩质组学研究：细胞器分级的质谱分析（图1）、蛋⽩质与蛋⽩质互作⽹络分析（图2），以及基于蛋⽩质定位的蛋⽩质成像（图3）。

1）基于质谱的细胞器分级⽅法质谱可⽤于复杂混合物中蛋⽩质的定性和定量研究。

空间蛋⽩质组学可借助传统⽣物化学分析⽅法，如下图1a 所⽰，通过定制的亚细胞分级分离（如，梯度离⼼或差速离⼼）来富集⽬标细胞器（绿⾊）。

然后利⽤质谱⽅法只分析富集到的组分。