蛋白质检验

1 / 6下载文档可编辑 蛋白质的检测（参考GB/T6432-94）

一、原理

凯氏定氮法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氮溢出，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。

二、试剂

（1） 硫酸 化学纯，含量为98%，无氮；

（2） 混合催化剂 0.4g硫酸铜，含5个结晶水，6g硫酸钾或硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀；

（3） 氢氧化钠 化学纯，40%水溶液（m/V）；

（4） 硼酸 化学纯，2%水溶液（m/V）；

（5） 混合指示剂 甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月；

（6） 盐酸标准溶液 基准无水碳酸钠法标定；

a) 0.1mol/l盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。

b) 0.02mol/l盐酸标准溶液：1.67mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。

（7） 蔗糖 分析纯；

（8） 硫酸铵 分析纯，干燥；

（9） 硼酸吸收液 1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1%甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液，混合，置阴凉处保存期为1个月（全自动程序用）。 2 / 6下载文档可编辑 三、仪器设备

（1） 实验室用样品粉碎机或研钵；

（2） 分样筛 孔径0.45mm（40目）；

（3） 分析天平 感重0.0001g；

（4） 消煮炉或电炉；

（5） 滴定管 酸式，10、25mL；

（6） 凯氏烧瓶 250mL；

（7） 凯氏蒸馏装置 常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；

（8） 锥形瓶 150、250mL；

（9） 容量瓶 100mL；

（10） 消煮管 250mL；

（11） 定氮仪 以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。

四、分析步骤

（一） 仲裁法

1. 试样的消煮 称取试样0.5-1g（含氮量5-80mg）（精确至0.0002g），放入凯式烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯式烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化、泡沫消失后，再加强活力（360-410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，消化全过程至少2h。

任务：

1、请设计检验样品抽样单，并抽样，填写相关记录；

2、食品中蛋白质种类及含量是标志食品营养价值的重要指标，查阅资料，了解并下载国家标准测定蛋白质的方法。

3、凯氏定氮法测定食品中蛋白质方法原理是什么？

凯氏定氮法测定食品中蛋白质的原理是样品与浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜一同加热消化, 使蛋白质分解, 其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出, 而样品中的有机氮转化为氨和硫酸结合成硫酸铵, 然后加碱蒸馏, 使氨蒸出,用硼酸吸收后再以标准盐酸溶液滴定, 根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

4、对照国家标准，列出实验所需仪器与试剂

所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。

硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸；40％氢氧化钠溶液：称取40g 氢氧化钠溶于60ml 蒸馏水中；4％硼酸溶液：称取4g 硼酸溶于蒸馏水中稀释至100ml；0.050mol/l 盐酸标准滴定溶液；甲基红次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液（1g/l）与甲基红乙醇溶液（1g/l）按1∶2 体积比混合。

实验室常规仪器及下列各项：

凯氏烧瓶：500ml；可调式电炉；蒸汽蒸馏装置；绞肉机：篦孔径不超过4nm；组织捣碎机；粉碎机；研钵：玻璃或瓷质；化学消化器；凯氏定氮仪；空气滤过器

5.样品在消化过程中，应加入浓硫酸、硫酸钾及硫酸铜，试分别说清他们各自的作用。

加硫酸作用：硫酸及催化剂与样品加热消化, 使蛋白质分解, 其中C、H 形成CO2 和H2O 逸出, 而蛋白质中的氮则转化成( NH4 ) 2SO4

加硫酸钾作用：在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解,它与硫酸反应生成硫酸氢钾,可提高反应温度,一般纯硫酸加热沸点330 ℃,而添加硫酸钾后,温度可达400 ℃,加速了整个反应过程。此外,也可以加入硫酸钠,氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解,水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大,沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大,否则温度太高,生成的硫酸氢铵也会分解,放出氨而造成损失。

- 1 - 双缩脲法测定蛋白质的含量心得体会

蛋白质是组成人体的重要物质，也是构成细胞的基本单位。对生命活动起着决定性作用。

一、双缩脲法测定蛋白质的含量检验原理蛋白质分子在加热时失去一个氨基酸残基或几个羧基残基，可与浓硫酸作用产生红色的硫酸铵，故在反应后滴加碱液可以消除这种颜色，最终的颜色变化和硫酸铵的存在有关。反应机理是：先是双缩脲中的氮原子与四氯化碳反应，生成橙黄色的醌式结构，这是一种较稳定的化合物，不易被破坏；然后与氨水反应，得到淡黄色的 N-氨基- N-乙酰氨基脲衍生物，后者再与亚硝酸钠作用，就生成蓝紫色的物质；最后双缩脲与盐酸羟胺反应，又生成红色的络合物，从而消除了试样中未参与反应的四氯化碳所引起的颜色。

在实际工作中，常用中性或弱碱性的氢氧化钠溶液来代替稀硫酸作为反应的溶剂，并且滴加的碱液总量比用双缩脲测定蛋白质含量的需要多出2～3倍左右。影响因素当 pH 值在7.5左右时，加入中性或弱碱性的氢氧化钠溶液后，随着反应的进行，氢氧根离子浓度逐渐减小，而亚甲基的电离度却增大（如图），导致反应过程中平衡向生成盐的方向移动，直至生成白色沉淀为止。

蛋白质分子为何会发生加聚反应？

蛋白质分子由于高温使其中间部位的肽键断裂而形成二聚体。蛋白质分子之间相互作用力极强，二聚体的分子内能降低，故不易继续维持其天然状态，需经热处理才能恢复到原始的三聚体状态。在加热 - 2 - 时由于水解，或发生一些副反应等原因，往往使反应速率缓慢下来，当达到某一点后，停止加热，如果分析条件适宜，便可发现二聚体，但此时它已不能被测定。故通常将二聚体在70℃下加热10分钟，使其完全水解。

注意事项在做双缩脲反应时，必须严格控制反应条件，尤其是 PH

值，否则很容易造成二聚体，导致测定失败。

蛋白质的检测（参考GB∕T6432∙94）

一、原理

凯氏定氮法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓硫酸破坏有机物,使含氮物转化为硫酸镀。加入强碱进行蒸馈使氮溢出，再用酸滴定,测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25,计算出粗蛋白含量。

二、试剂

（1）硫酸化学纯，含量为98%,无氮；

（2）混合催化剂0.4g硫酸铜，含5个结晶水，6g硫酸钾或硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀；

（3）氢氧化钠化学纯，40%水溶液（m/V）；

（4）硼酸化学纯，2%水溶液（m/V）；

（5）混合指示剂甲基红0.1%乙醇溶液，澳甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月；

（6）盐酸标准溶液基准无水碳酸钠法标定；

a） 0.1mol∕l盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入IOOOmL蒸储水中。

b） 0.02mol∕l盐酸标准溶液：1.67mL盐酸注入IOOOmL蒸储水中。

（7）蔗糖分析纯；

（8）硫酸筱分析纯，干燥；

（9）硼酸汲取液1%硼酸水溶液IOOOmL,加入0.1%溟甲酚绿乙醇溶液IOmL,0.1%甲基红乙醇溶液7mL,4%氢氧化钠水溶液，混合，置阴凉处保存期为1个月（全自动程序用）。

三、仪器设施

（1）试验室用样品粉碎机或研钵；

（2）分样筛孔径0.45mm（40目）；

（3）分析天平感重0.0001g；

（4）消煮炉或电炉；

（5）滴定管酸式，10、25mL；

（6）凯氏烧瓶250mL； （7）凯氏蒸储装置常量直接蒸播式或半微量水蒸气蒸储式；

（8）锥形瓶150、250mL；

（9） 容量瓶100mL；

（10）消煮管250mL；

（Il）定氮仪以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。

四、分析步骤

（一）仲裁法

1 .试样的消煮称取试样0.5√Lg（含氮量5-8Omg）（精确至0.0002g）,放入凯式烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合匀称，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯式烧瓶置于电炉上加热，开头小火，待样品焦化、泡沫消逝后，再加强活力（360-410°C）直至呈透亮 的蓝绿色，然后再连续加热，