野生红菇的分离纯化培养初探

红菇，又名美丽红菇、鳞盖红菇。

它是一种野生稀有菇品，分布于辽宁、江苏、广西、四川、云南等地，每年夏秋季群生或单生于林中腐殖地上。

红菇营养丰富，味道鲜美，且有药用功效。

在福建闽南地区，妇女分娩时必食红菇补充营养；在广州、香港及东南亚国家很受欢迎。

我国食用菌科研部门进行人工驯化栽培，获得成功。

栽培季节红菇属于中温偏高型的菌类，野生红菇多发生于夏季。

其菌丝生长20℃～25℃均适，出菇23℃～28℃均可，栽培季节为春接种，夏出菇。

通常5月接种，菌丝培养45～50天，6月下旬至7月长菇，提前70天进行原种和栽培种制作。

原料选择红菇属于草腐土生菌类，主要以分解粪、草有机质作为主要营养进行繁衍。

野生红菇子实体多生于林中潮湿、富含有机质的肥沃土壤上。

基质均为腐烂秸秆、杂草、树叶及畜粪。

红菇的栽培原料以富含纤维素的农作物秸秆为宜，如棉籽壳、棉花秆、甘蔗渣、黄豆秸、玉米芯、玉米秆、高梁秆以及山上芦苇、斑茅、象草、节芒等野草均可利用。

培养料配制红菇对养分要求较多，以配制合成培养料为宜。

下面介绍几组配方，供选用。

配方一：棉籽壳86%，麦麸8.5%，石灰2%，碳酸钙1%，过磷酸钙2%，尿素0.5%。

配方二：黄豆秸48%，花生壳20%，棉籽壳19%，麦麸10%，过磷酸钙1%，碳酸钙2%，料水比例为1∶1.3。

配方一、二主要用于熟料袋栽。

配方三：棉籽壳90%，麦麸6%，石灰1%，过磷酸钙1.5%，碳酸钙1%，尿素0.5%，料水比例为1∶1.3。

配方四：芦苇50%，杂木屑16%，棉籽壳30%，石灰1.5%，过磷酸钙2%，硫酸镁0.5%。

料水比例为1∶1.3。

配方三、四适用于发酵料床栽。

红菇栽培分熟料袋栽和发酵料床栽，两种栽培方式不同，培养料制作也有别：熟料栽培按照配方一或二，将培养料拌匀，含水量掌握在60%左右，然后装入17×33～35厘米聚丙烯塑料袋内，经高压灭菌，冷却接种（按常规要求）。

发酵料床栽：按照配方三或四，将培养料混合拌匀，集中成堆发酵处理。

渣福建林业林业动态红菇是非常珍贵的大型外生菌根蘑菇，生境非常苛刻，因其菌丝必须与宿主根系形成共生体才能繁衍出子实体，红菇还没有实现人工种植。

前人在壳斗科大林分里进行了很多红菇菌接种研究，因大树根系的新根量不足难以实现精准接种，以及林下土壤菌群复杂对红菇菌繁衍产生干扰等原因，至今未有突破。

练春兰教授长期深耕松茸栽培且卓有成效，基于前期对红菇做了深入的基础研究，提出新造幼林的新路径，以实现攻克红菇菌难以人工栽培的难题。

练教授团队于2019年在清流国有林场选定采伐迹地作为试验地，该试验地前茬为以松木为主的松阔混交林，因松木感染松材线虫病于2018年进行了松林改造，松木皆伐后采用炼山方式进行林地清理和挖穴整地，于2019年春季进行造林。

造林树种选择较为速生的红锥、栲树、秀丽锥和米槠等壳斗科树种，分别种植了纯林和混交林。

为了尽快构建红菇菌生境，本试验林采用1.5万株·hm -2的高密度造林模式，截止2023年5月，幼树平均高度达到5m 以上，郁闭度达0.7。

为进一步探讨红菇菌标准林分造林模式，营造了4种不同密度的林分：三元区陈大镇砂蕉村采用9000株·hm -2、大田桃源国有林场采用1.8万株·hm -2、清流国有林场采用3万株·hm -2和常规造林密度3000株·hm -2的幼林，通过对不同密度幼林接种红菇的试验结果进行全面分析，总结提炼出符合不同需求的造林模式。

2023年5月，清流白石试验林分和三元砂蕉试验林部分地段，林下可见蜡蘑属、马勃属、红菇属、鹅膏菌属、牛肝菌属等大型外生菌根蘑菇指示菇，林地遍布壳斗科幼树根系，已满足红菇菌的生长条件。

目前，科研团队分别采集红菇菌不同发育阶段的子实体和菌根等实体作为接种材料，使用了392个红菇子实体和79个菌根土，共接种了277个点位。

进行了干法与湿法不同接种方法和不红菇属鹅膏属牛肝菌马勃属腊蘑属菌属不明22（上接第8页）《办法》（送审稿）。

野生香菇：菌种分离操作步骤野生香菇是可以分离出菌种的，但分离出的菌种是不是能够成活，能够成活，是否在人工种植中能够适应人工模拟的生长环境，也具有着不确定性。

如果要它成为人工种植中能使用、并且具有优良的抗性、出菇性能、产量性能、质量性能还需进行无数次的驯化，驯化成功才能被作为新品种进行推广使用。

对野生香菇进行分离并不难，其中最容易的就是采用组织分离法。

所谓的组织分离法，简单的说就是利用香菇组织能再生菌丝的特性，取一块香菇的新鲜组织，放进装有培养基的试管中，再把试管放置在适于香菇菌丝体生长的恒温环境中，进行菌种培育，详细操作步骤如下。

一、PAD培养基制作用组织分离法制作菌种，必须先制作好PDA培养基备用。

1.所用原料马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15克、水1000毫升。

2.制作马铃薯洗净去皮，切成小颗粒，放入铝锅中，加入1000毫升水，进行蒸煮至沸腾。

沸腾状态下保持30分钟后，关火。

用三层以上纱布对锅中的马铃薯进行过滤，把经过过滤得到的马铃薯溶液倒入量杯中。

接着，把葡萄糖、琼脂放入量杯中，并把量杯中的水补足1000毫升后，进行搅拌均匀，使葡萄糖和琼脂充分溶解。

如溶液温度过低，不能充分溶解，可对量杯进行加热，直至全部溶解。

3.灌装试管就是把调节好的培养基趁热用漏斗灌装进早就准备好的试管中，灌装量是试管容积的1/5~1/4，灌装完毕，试管盖紧胶塞，每7支为一组为一组进行捆扎。

4.灭菌把试管放进高压灭菌锅中进行灭菌。

灭菌温度121℃、压力0.105Mpa，灭菌时长30分钟，灭菌过程中，要注意排净高压灭菌锅中的冷气。

灭菌后，锅内温度降至80℃时，放净锅中蒸汽，取出试管。

5.摆放试管斜面。

灭菌锅中取出的试管放置在平台上，试管开口端用物垫起，让试管内培养基形成斜面，使试管内培养基最高处处于试管的1/2位置，试管上覆盖毛巾或棉垫类物品，避免试管内出现冷凝水。

试管中的培养基凝固，试管斜面培养基制作完成。

6.杂菌测试。

大容山野生香菇分离培养试验吴章荣;陈德荣;卢玉文;秦延春;丘献娟;韦锦福【摘要】从大容山采集野生香菇并进行分离及生长条件试验,以期驯化得到适合当地栽培的优良香菇品种.试验结果表明,大容山野生香菇菌丝以培养基配方④,培养基pH5,培养温度为25℃生长最好,菌丝洁白,粗壮,浓密,尖端整齐,爬壁力强,生长速度快.【期刊名称】《食用菌》【年(卷),期】2017(039)002【总页数】2页(P30-31)【关键词】大容山;野生香菇;pH;温度;驯化【作者】吴章荣;陈德荣;卢玉文;秦延春;丘献娟;韦锦福【作者单位】玉林市微生物研究所,广西玉林53700;玉林市微生物研究所,广西玉林53700;玉林市微生物研究所,广西玉林53700;玉林市微生物研究所,广西玉林53700;玉林市微生物研究所,广西玉林53700;玉林市微生物研究所,广西玉林53700【正文语种】中文大容山位于广西东南部，是桂东南最高峰，属热带季风气候，山高林密，原始森林面积广阔，具有丰富的野生食用菌资源。

研究从大容山采集到香菇（图1）并进行分离驯化试验，希望获得适合当地栽培的优良香菇新品种。

试验分别从菌盖处菌柄与菌盖处取组织培养块进行分离培养，对比分离的效果；分别运用5 种不同培养基配方，7 种不同的pH，以及不同温度范围进行培养试验。

现将试验结果总结如下。

图1 大容山野生香菇1 材料和方法1.1 供试材料从大容山上采得的新鲜野生香菇子实体。

经过分离纯化后获得菌株。

1.2 不同部位子实体分离试验选择生长健壮、朵形正常、无病虫、菌膜未破的野生香菇子实体。

取材按菌盖、菌柄与菌盖交界处两个部位进行分离，培养基为PDA 加富培养基，常规方法制作，置于生化培养箱25℃培养。

1.3 供试母种培养基配方试验设计五个配方:配方①马铃薯100 g，葡萄糖10 g，琼脂8.3 g；配方②马铃薯100 g，葡萄糖10 g，琼脂8.3 g，硫酸镁2 g，磷酸二氢钾2 g；配方③马铃薯100 g，葡萄糖10 g，琼脂8.3 g，硫酸镁2 g，磷酸二氢钾2 g，蛋白胨2 g；配方④马铃薯100 g，葡萄糖10 g，琼脂8.3 g，硫酸镁2 g，磷酸二氢钾2 g，蛋白胨4 g；配方⑤马铃薯100 g，葡萄糖10 g，琼脂8.3 g，硫酸镁2 g，磷酸二氢钾2 g，麸皮10 g。

DB福建省地方标准DB/×××—2007野生食用菌菌种分离与鉴定技术规范（报批稿）200×-××-××发布200×-××-××实施发布福建省质量技术监督局DB/×××—2007前言本标准由福建省科技厅和福建省农业厅提出。

本标准起草单位：福建省三明真菌研究所、福建农林大学菌物研究中心、福建省科技厅星火办。

本标准主要起草人：黄年来、上官舟建、林汝楷、谢宝贵、林津添、张运茂、郭美英、朱坚、陈晓、吴小平、邓优锦、刘新锐。

1DB/×××—2007野生食用菌菌种分离与鉴定技术规范1范围本标准规定了野生食用菌菌种采集、采集前准备、标本采集与保存、菌种分离与鉴别等。

本标准仅适用于野生食用菌,不适用于有毒真菌。

2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单位（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究可以使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T12728-2006食用菌术语3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。

3.1食用菌ediblemushroom可食用的大型真菌，常包括食药兼用和药用大型真菌，多数为担子菌，如双孢蘑菇、香菇、草菇、牛肝菌等，少数为子囊菌，如羊肚菌、块菌等。

[GB/T12728-2006，定义2.1.4]3.2药用菌medicinalmushroom有药用价值的高等(大型)真菌。

〔GBT12728-2006，定义2.1.5〕3.3木腐菌woodrottingmushroom自然生长在木本植物上可引起木材腐烂的大型真菌。

人工栽培的食用菌多数是木腐菌，如香菇、金针菇等。

[GB/T12728-2006，定义2.3.10]3.4草腐菌strawrottingmushroom自然生长在草本植物残体上的大型真菌，如草菇、双孢蘑菇。

菇的菌种分离技术实验香菇 Lentinus edodes (Berk.) Sing, 别名冬菇、花菇、香菌、厚菇等。

在真菌分类学上属真菌门、担子菌亚门、层菌门、蘑菇目、口蘑科、香菇属。

在我国的江西、浙江、湖北、广东、四川、云南、海南、台湾等省均有分布。

香菇迄今为止已有千年的栽培历史。

中国是世界香菇栽培的发源地。

香菇是世界性消费的菇类，是人们喜爱的美味佳食，不但具有清香味鲜的独特风味，而且含有大量对人体有益的营养物质，具有很高的营养价值和经济价值。

国内外市场的需求量很大，有着广阔的发展前景。

袋栽香菇，能进行规模化生产，集约化管理，是今后一个阶段香菇发展的方向。

香菇栽培均以纯丝接种，亦先制备纯菌种。

菌种有固体菌种和液体菌种两大类。

根据香菇生长发育所需营养成分，制成液体培养基，再加入一定量固化剂如琼脂等，即可制成固体培养基。

一、试验原材料野生香菇、PDA培养基、CPDA培养基、刀、剪、镊子、玻拌等。

二、试验方法1、培养基的制作（1）、配方A 马铃薯琼脂培养基（PDA基），马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18~20g，水1 000ml，pH ~6配方B 综合培养基（CPDA基），PDA加磷酸二氢钾3g、硫酸镁、VB1 5~10mg、琼脂18~20g，水1 000ml，pH ~6（2）、配制方法选择质量好的马铃薯，去皮，挖去芽眼，削掉青绿部分。

切成蚕豆小块称取马铃薯，加水1 000ml，煮沸并保持30min，然后用4层纱布过滤，滤汁内加入琼脂和葡萄糖，在文火上使琼脂融化，加水补足到1 000ml，调pH至~6。

趁热将此汁液装入试管中，每支试管装10~15ml。

试管口用棉花塞塞紧，外面再用双层报纸包扎，以防棉塞受潮，将试管放入高压灭菌锅中，在121℃/30min，灭好菌后，将试管摆成斜面，待培养基冷却后凝成斜面即为斜面培养基。

2、接种室及接种用具的消毒将无菌室内紫外灯及超净工作台上的紫外灯打开照射30min，然后将室内的风扇及超净工作台上的风扇打开通风30min。

第20卷第1期北华大学学报(自然科学版)Vol.20No.12019年1月JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY(Natural Science)Jan.2019文章编号:1009-4822(2019)01-0064-04DOI :10.11713/j.issn.1009-4822.2019.01.013血红铆钉菇多糖分离纯化及抗氧化活性研究王㊀贺,宋文刚,任㊀婷,牟莹莹(北华大学药学院,吉林吉林㊀132013)摘要:目的㊀探讨血红铆钉菇的多糖分离纯化及抗氧化活性方法.方法㊀应用传统热水浸提法提取粗多糖,进行反复冻融后初步去除蛋白,再用sevage 法除蛋白,纯化后苯酚-硫酸法测糖含量,考马斯亮蓝法测蛋白含量,对多糖进行超氧阴离子自由基㊁羟基自由基和DPPH 等体外抗氧化能力试验.结果㊀传统热水浸提方法得糖率为4.19%,除蛋白后蛋白含量为10.71%,并且血红铆钉菇多糖对超氧阴离子清除效果最好,而对DPPH 和羟自由基的清除效果也较为明显.结论㊀血红铆钉菇有较强的体外抗氧化活性,并且清除率随多糖的浓度增大而增加.关键词:血红铆钉菇;分离纯化;体外抗氧化中图分类号:R923文献标志码:A收稿日期:2018-10-26基金项目:吉林农业大学博士后基金项目.作者简介:王㊀贺(1993-),女,硕士研究生,主要从事药物化学研究,E-mail:2305030554@;通信作者:宋文刚(1968-),男,博士,教授,硕士生导师,主要从事天然药物化学研究,E-mail:1049538768@.Isolation ,Purification and Antioxidant Activity ofChroogomphus rutilus PolysaccharidesWang He,Song Wengang,Ren Ting,Mu Yingying(College of Pharmacy ,Beihua University ,Jilin 132013,China )Abstract :Objective To study isolation,purification and antioxidant activity of Chroogomphus rutilus Polys-accharides.Method Polysaccharides with water extracted by traditional method was repeated freezing and thawing in order to remove protein.Purified polysaccharides were tested for sugar content by phenol-sulfuric acid method.Determination of protein content was measured by using the Bradford method.Experiment on the effect of polysaccharides scavenging DPPH,hydroxyl radicals and superoxide anion.Results The probability of obtaining polysaccharide by the traditional method is 4.19%.After protein removal,the protein content was 10.71%,and the polysaccharide has the best effect on superoxide anion removal,and the effect of DPPH and hydroxyl radical scavenging is also obvious.Conclusion Chroogomphus rutilus has great antioxidant activity in vitro,and the clearance rate increases with the concentration of the polysaccharide increase.Key words :Chroogomphus rutilus ;separation and purification;in vitro antioxidant ㊀㊀多糖是广泛存在于植物㊁动物㊁微生物组织中的一类天然高分子化合物,是维持生命正常运转的基本物质之一,具有抗氧化㊁抗衰老㊁调节免疫等多种生理活性[1],且无毒副作用,已被广泛应用于医药和保健食品领域.真菌多糖是由各种真菌的子实体和菌丝体所产生的一类代谢产物[2].在国际上,真菌多糖被称为生物反应调节物,简称BRM,可作为免疫增强剂和免疫激活剂.目前,在全球范围内约有数千种真菌,其中不仅有许多具有食用价值的美味真菌,还有许多具有保健功能的真菌,也有不少是具有毒性的真菌.研究表明:药用菌的活性多糖具有抗菌㊁抗病毒和抗凝作用,可提高肝脏的解毒功能,提高动物的氧利用率,降低血黏稠度,并具有强心㊁降糖㊁镇静㊁镇痛㊁平喘㊁止咳㊁化痰的功效.20世纪中后期,有学者通过数次重复实验证明了食用真菌多糖的抗肿瘤活性,自此以后,真菌多糖逐渐成为国内和国际各个学科领域研究的热点之一[3].血红铆钉菇(Chroogomphus rutilus(Schaeff.) l.)属担子菌亚门㊁牛肝菌目㊁铆钉菇科㊁铆钉菇属,多分布于黑龙江㊁吉林㊁辽宁㊁四川㊁山西㊁湖南㊁西藏㊁云南㊁广东㊁河北等地区[4],东北地区俗称红蘑㊁松树伞㊁松蘑等.血红铆钉菇是膳食纤维㊁天然抗癌及抗氧化物质的重要来源[5],在健胃㊁抗癌㊁防病㊁治疗糖尿病方面有辅助治疗的作用,另外,血红铆钉菇还有预防早衰及抗辐射功效.本研究以血红铆钉菇多糖为主要研究对象,对铆钉菇多糖进行了提取和纯化,此结果为血红铆钉菇的深入研究奠定基础.目前,对血红铆钉菇的研究多数集中在对它的分类㊁形态和培养等方面,而国内外对血红铆钉菇的提取工艺㊁抗氧化活性研究较少[6],血红铆钉菇的多糖功效具有广阔的开发利用前景,有必要对其多糖进行系统研究,并针对其抗氧化作用进行更深入的探讨.1㊀材料与方法1.1㊀材料与试剂血红铆钉菇(市售);无水乙醇(天津市致远化学试剂有限公司);正丁醇(辽宁泉瑞试剂有限公司);三氯甲烷(北京化工厂);硫酸(天津市凯信化学有限公司);苯酚(北京化工厂);葡萄糖(辽宁泉瑞试剂有限公司).1.2㊀试验方法1.2.1㊀基本工艺样品的制备:血红铆钉菇浸泡过夜,撕碎,用热水浸法提取3次后合并提取液.浓缩提取液至1000mL 后,缓慢加入4倍体积无水乙醇进行醇沉,隔夜.去上清后,用乙醚乙醇反复脱水干燥3次,离心,将沉淀放入真空干燥器干燥,得粗多糖.样品除蛋白:将粗多糖溶于三蒸水,放入-80ħ冰箱中进行反复冻融至没有沉淀,再用sevage法除蛋白,除净沉淀后冻干,作为下一试验的样品. 1.2.2㊀血红铆钉菇多糖的鉴定应用苯酚-硫酸法测定多糖含量.1)葡糖糖标准液配置(100μg/mL):取50mg葡萄糖,加入适量水溶解,定容至500mL;2)标准曲线制作:精取葡萄糖溶液5,10,15,20,25,30μL,用水补至50μL,加入5%苯酚25μL及硫酸125μL,室温放置30min,在490nm测吸光度;3)糖含量测定:取多糖20mg,加入适量蒸馏水溶解,定容至500mL,按照2)的方法测量吸光度.利用所得方程式计算出糖含量,然后代入下列公式计算提取率:多糖提取率=VˑCˑfˑW2W3ˑW1ˑ100%,式中:W1为血红铆钉菇的质量(g);W2为由W1提取的血红铆钉菇多糖质量(g);W3为从W2中称取的实验用的粗多糖质量(g);V为溶解W3定容后所得体积(L);f为校正系数;C为所得方程式计算结果,即多糖浓度(g/L).应用考马斯亮蓝法测定蛋白含量.1)考马斯亮蓝试剂配制:称取考马斯亮蓝0.01g,溶解于5mL的95%乙醇中,加入10mL的85%的磷酸,用蒸馏水稀释至100mL,过滤备用;2)蛋白质标准溶液配制:将5mg/mL的牛血清白蛋白加水稀释至50μg/mL;3)标准曲线的制作:分别量取标准品0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL装入玻璃试管中,加蒸馏水补至1.0mL.加考马斯亮蓝4mL,静置5min后在波长595nm处测定吸光度;4)蛋白含量测定:取0.1g/L样品5mL,按照标准曲线方法操作,测定吸光度.1.2.3㊀多糖抗氧化活性的研究1)超氧阴离子自由基清除试验:取Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2)加入不同浓度(50,100,200, 400,800μg/mL)的多糖溶液,混匀后保温,然后加入邻苯三酚反应,25ħ水浴反应4min,最后加入HCl终止反应,在325nm处测吸光度,以蒸馏水作为对照,计算出样品对O2-㊃的清除率.计算公式: O2-㊃清除率=(V1-V0)/V1ˑ100%,式中:V1为样品组吸光度;V0为对照组吸光度. 2)羟自由基清除试验:96孔板中加入50μL 0.15mmol/L的FeSO4㊁20μL2mmol/L的水杨酸㊁10μL不同浓度(50,100,200,400,800μg/mL)的多糖溶液㊁50μL6mmol/L的H2O和20μL蒸馏水;空白组将多糖溶液替换为蒸馏水,对照组将水杨酸替换为蒸馏水;将96孔板放入37ħ水浴中, 1h后冷却,用三蒸水调零,在510nm处测吸光度,做3组平行实验,取吸光度平均值,吸光值越小,清除羟基自由基的效果越好.以抗坏血酸(V C)替换多糖样品,作阳性对照.用下面公式计算多糖对羟基自由基的清除率:㊃OH清除率=A空白-(A样品-A对照)A空白ˑ100%.3)DPPH清除试验:样品组在96孔板中加入100μL不同浓度(50,100,200,400,800μg/mL)的多糖溶液与100μL的DPPH溶液,做3组平行实验;56第1期王㊀贺,等:血红铆钉菇多糖分离纯化及抗氧化活性研究对照组DPPH 溶液用95%乙醇替换,空白组的多糖溶液替换为蒸馏水.将96孔板28ħ水浴30min 后,用50μL 蒸馏水和150μL 95%的乙醇调零,于515nm 处测定吸光值,结果取平均值.用抗坏血酸(Vc)做阳性对照,计算DPPH 清除率:DPPH 清除率=A空白-(A 样品-A 对照)A 空白ˑ100%.2㊀结果与分析2.1㊀多糖的鉴定2.1.1㊀糖含量测定结果应用苯酚-硫酸法测定多糖的含量,用葡萄糖作为标准品,吸光度为纵坐标y ,葡萄糖质量(μg)为横坐标x ,绘制标准曲线(见图1),计算回归方程和糖含量,得到回归方程为y =0.0798x +0.0746,相关系数R 2=0.9926.代入公式,计算得糖率为4.19%.图1苯酚-硫酸法标准曲线Fig.1Standard curve of phenol-sulfuric acid method2.1.2㊀蛋白含量测定结果蛋白含量测定标准曲线见图2.回归方程为y =0.0056x +0.2855,R 2=0.9922.将血红铆钉菇多糖的吸光度值代入方程,计算出多糖中蛋白质含量为10.71%.图2考马斯亮蓝法标准曲线Fig.2Standard curve of Bradford method2.2㊀体外抗氧化试验2.2.1㊀超氧阴离子自由基清除试验结果超氧阴离子是生成直接与生物大分子反应的自由基如过氧化氢㊁羟自由基等的前体,因此,抗氧化物对超氧阴离子的清除能够去除潜在的氧化作用[7].图3显示:铆钉菇多糖对超氧阴离子表现出明显的浓度相关性,其清除率随浓度的增加而增强.在800μg /mL 时清除率达90.06%,与V C 的清除率相近,表现出很好地清除活性.图3多糖对超氧阴离子(O 2-㊃)抑制作用Fig.3Inhibition of polysaccharides on O 2-㊃2.2.2㊀羟自由基清除试验结果羟自由基被认为是毒性最强的活性氧自由基,辐射㊁损伤等物理㊁化学因素都会促进其形成,是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素[8].图4显示:不同浓度的铆钉菇多糖对羟自由基的清除能力随铆钉菇多糖的浓度增大而增强,呈现明显的量效关系.在浓度800μg /mL 时,其清除能力为66.84%.Vc 在浓度为200μg /mL 时清除能力达到饱和,说明铆钉菇多糖对㊃OH 对清除作用较明显,但不及Vc.图4多糖对羟基自由基(㊃OH )清除能力Fig.4㊃OH-scavenging activity of polysaccharides2.2.3㊀DPPH 清除试验结果DPPH 是有机溶剂中一种稳定的自由基,在517nm 处有吸收峰,呈紫色.当自由基清除剂存在时,DPPH 的孤电子被配对,颜色变浅,在最大吸收波长处吸光度变小,且颜色变化与配对电子数成化学剂量关系.因此,可用来评价自由基的清除情况[8].结果见图5.血红铆钉菇对自由基清除作用较强,在浓度为800μg /mL 时清除率达到最大,为75.58%,呈明显的剂量依赖性关系.66北华大学学报(自然科学版)第20卷图5多糖对自由基的清除能力Fig.5Free radical scavenging activity of polysaccharides 3㊀结㊀㊀论血红铆钉菇的子实体一般较小,为浅咖啡色[9],肉为暗红色,呈铆钉状,因形状似铆钉而得名,肉质厚,味道鲜,是营养价值很高的食用菌之王.现对血红铆钉菇多糖的分离纯化及抗氧化作用做了初步的试验研究,可为后续工作奠定基础.多糖提取方法是对多糖研究的基础[10],在对血红铆钉菇的分离纯化试验中,使用传统热水浸提方法提取多糖的得糖率为4.19%.血红铆钉菇的蛋白质含量较高,在试验过程中,行sevage法除蛋白达数十次,反复冻融十几次.纯化后测得蛋白含量为10.71%,这说明传统热水浸提方法对血红铆钉菇多糖的提取效果较好,使用sevage法纯化后蛋白含量也较低.在体外抗氧化试验中,铆钉菇多糖对几种自由基都表现有清除活性,其中清除超氧阴离子的能力最强,虽然对超氧阴离子的清除效果相比Vc仍不足,但是其清除率在800μg/mL时达90.06%,表现出很好的生物活性.超氧阴离子是人体内的是一种对机体有破坏性的自由基,超氧阴离子能结合机体内含有的羟基(㊃OH)继而生成能够损伤细胞DNA,铆钉菇多糖对超氧阴离子的清除功能,大大降低了超氧阴离子对人体机能的损伤作用. DPPH是一种很稳定的自由基,使用DPPH测定样品对自由基清除能力其灵敏度较高,因此,通过使用DPPH来观察某一化学反应的速度是否有所下降,作为试验是否存在自由基反应的标志.在此次试验中,使用DPPH自由基清除试验来测定血红铆钉菇对自由基的清除能力,对比样品对超氧阴离子清除的能力,结果显示血红铆钉菇对自由基对清除能力稍弱,但仍显示出良好的自由基清除能力,在浓度达到400μg/mL时趋于平稳,在浓度为800μg/mL时对自由基对清除率为75.58%.羟基自由基属于活性氧化物,因其本身携带的未配对电子抢夺其他分子的电子后,使其他分子出现单电子继而发生自由基的连锁反应,对机体造成损伤,主要原因是其抢夺细胞膜的电子,能够杀死细胞,并降解DNA㊁细胞膜和多糖化合物,具有很强的攻击性.同时,在加入羟自由基的抑制剂后,羟基自由基引起的很多负面效应都会明显减少.在3组体外抗氧化试验中,血红铆钉菇对羟基自由基的清除能力最弱,在浓度达到800μg/mL时,其清除能力为66.84%,这表明血红铆钉菇虽然对羟基自由基有一定的抑制作用,但并不明显.以上实验表明:血红铆钉菇多糖是一种作用很强的抗氧化剂,表现出较好的抗氧化活性,是一种既有食用价值又有药用价值的多用真菌.目前国内外对血红铆钉菇多糖的研究成果有限,对多糖的研究方法涉及许多学科领域,对于血红铆钉菇多糖的分离纯化和抗氧化生物活性的研究还有待于进一步深入.参考文献:[1]张利民.夏至草多糖的提取㊁分离纯化及抗氧化活性研究[D].张家口:河北北方学院,2013. [2]郭宇.桦褐孔菌液体发酵和多糖提取工艺的研究[D].合肥:安徽农业大学,2012.[3]秦俊哲,陈明,陈合,等.食药用真菌多糖的研究现状与展望[J].中国食用菌,2004,23(2):6-9. [4]高婵娟.血红铆钉菇多糖的制备及生物学活性分析[D].沈阳:辽宁石油化工大学,2012.[5]李贞卓.血红铆钉菇化学成分及其抗肿瘤活性的研究[D].长春:吉林农业大学,2014.[6]张海悦,杨雪,李震,等.血红铆钉菇黄酮体外抗氧化活性的研究[J].食品研究与开发,2016,37(19): 109-113.[7]李云,黄荣城,许俊凰.红菇子实体多糖抑菌活性研究[J].福建林业科技,2015,42(2):98-102.[8]鲍素华.铁皮石斛多糖体外抗氧化活性的研究[D].合肥:合肥工业大学,2009.[9]董化研,郝册,牛玉蓉,等.血红铆钉菇生态学初步研究[J].中国农学通报,2010,26(7):191-194. [10]李佳,管燕莲,陈扣群,等.响应面法优化血红铆钉菇子实体多糖提取工艺[J].湖北农业科学,2016,55(15):3952-3954,3957.ʌ责任编辑:陈丽华ɔ76第1期王㊀贺,等:血红铆钉菇多糖分离纯化及抗氧化活性研究。

红菇人工繁殖培育困难及改良方案。

红菇是一种具有鲜明地域特色的野生食用菌品种，其中灰肉红菇是一种著名的外生菌根食用菌，主要分布在中国南方。

因其富含多种对人体有益的维生素、氨基酸及矿物质，被当地人誉为长寿食品。

一、红菇人工繁殖培育的困难红菇对生长环境的要求非常高，而且它的菌丝不能分离，还有和菌丝一起的微生物也是无法模拟出来，所以红菇无法人工繁殖和培育。

研究团队通过对华南地区的红菇资源进行调查和鉴定，获得了准确的灰肉红菇子实体，提取出高质量基因组DNA并运用二代和三代测序技术对灰肉红菇基因组进行测序，然后进行高通量测序数据的从头组装，并利用GeneMark-ES、BLAST、CAZy等数据库进行功能基因注释。

基于不同营养型真菌的单拷贝基因构建了系统发育树，将四个代表性物种与灰肉红菇进行了比较基因组学分析。

通过研究分析发现，灰肉红菇的碳水化合物水解酶的分布与其他菌根真菌如松茸和牛肝菌相似，而数量和种类较腐生菌而言偏少，特别是碳水化合物结合模块（CBMs）和碳水化合物酯酶（CEs），这可能是其难以利用人工碳源培养基完成生长的潜在原因。

二、红菇人工繁殖培育的改良方案把已长有红菇的土壤移植到相似的植被、并未出过红菇的土壤中，这不仅移植了红菇的菌丝体，而且还带去了相宜的微生物。

因为根系微生物对外生菌根菌和菌根植物不论在参与物质代谢或促进生长等方面都有重要的作用，如果仅仅加入红菇的菌丝体，则往往难以成功。

要保护红菇赖以生存的森林资源，特别是红菇的共生树种如青冈栎、米槠、栲树等不受破坏;这是红菇自然繁衍和人工移菌促繁产菇的主体。

同时，要改造共生树种林区的生态，对荫蔽度稀疏的林区，补种新的共生树种;对过于衰老的林区，应有计划地间伐，并栽上幼年的共生树种;对土壤肥力贫瘩的林区，应追施化肥或有机肥，促使林木繁茂生长，野生的红菇也就会相应地增多。

这是一条实现红菇资源保护和可持续发展的有效路径。

香菇的组织分离及培养（推荐5篇）第一篇：香菇的组织分离及培养香菇的组织分离和培养一、实验目的1、了解食用菌的基础知识。

2、了解、掌握食用菌培养基的配置原理。

3、通过平菇栽培实验，掌握食用菌代料栽培的一般方法。

二、实验原理（食用菌的组织分离法）食用菌的母种一般是采用孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物。

利用食用菌子实体内部组织进行分离，是获得母种最简便的方法。

三、实验材料1、原种制作实验材料（1）食用菌：香菇。

（2）培养基：PDA培养基斜面。

（3）仪器或其他用具： 75%酒精棉球、接种针记号笔等。

2、食用菌的组织离2、食用菌的组织分离（1）试剂：棉籽壳、麸皮、蔗糖、CaCO3（2）仪器或其他用具：平菇菌种、香菇菌种、金针菇菌种、姬菇菌种、茶树菌种、台秤、盆子、聚丙烯塑料袋、颈圈、封口膜、橡皮筋、高压蒸气灭菌锅、pH试纸（pH 5.5—9.0）、记号笔、麻绳等四、实验步骤1、原种制作实验材料（1）拌料按培养料配方准确称取所需棉籽壳和麸皮放入大盆中用手搅拌混合均匀，将所需的蔗糖和CaCO3溶于水中，然后泼洒在棉籽壳和麸皮上，边加水边搅拌，直至均匀。

搅拌好后，焖30分钟，使培养料吸水均匀。

（2）侧培养水分培养料搅拌好后，用于抓一把培养料握在手中，攥紧，手指缝中有水印但无水滴滴下，这时的含水量适合，为60%—62%，若含水量不足，可再加少量的水，充分搅拌均匀，在检测，直至含水量合适为止。

（3）装袋边加边将培养料压实，装至3/4左右，袋口套上颈圈，用木棒在培养料中打一洞，盖上封口膜，用橡皮筋扎紧。

（4）灭菌126 ℃高压蒸气灭菌90分钟。

（5）接种栽培袋冷却到25℃左右，在超净工作台上用镊子或接种枪夹取所需菌种（1个鸡蛋大小）放入培养料袋的洞中。

（6）培养接种后的栽培袋，放入23-25℃培养室，堆放高度三至四层，空气湿度60%-65%，每周翻堆一次，使上下发菌一致，同时挑出污染的栽培袋丢弃，一般30-40天，菌丝即可长满菌袋。

一种野生新食用菌的分离及其人工驯化栽培方法
野生新食用菌的分离及人工驯化栽培方法可以分为以下步骤：
1. 野外取样：到野外寻找潜在的新食用菌资源，并进行采样。

选择具有潜在食用价值的菌丝体、子实体或孢子等作为样品。

2. 菌种分离：将采样回来的样品进行处理，可将其切割成小块，加入无菌培养基中进行分离。

通过分离纯菌株的方式，选择出单一的新食用菌菌种。

3. 菌种培养：将分离得到的新食用菌菌种进行培养。

可以选择适宜的培养基，如麦芽琼脂或木屑培养基，以提供菌种生长所需的营养和环境条件。

4. 优化培养条件：根据新食用菌的特性，优化培养条件，如温度、湿度、pH值等。

通过调整这些条件，提高菌种的生长速
度和产量。

5. 人工驯化：在野生新食用菌菌种适应人工培养条件后，进行人工驯化。

通过连续培养和选择，优化菌株的性状和产量，使其更加适应人工栽培环境。

6. 栽培试验：将培养得到的人工驯化菌株进行栽培试验，确定最适宜的栽培条件。

根据菌种的特性和生长需求，选择适合的培养基、光照、温度和湿度等条件，以提高产量和品质。

通过上述步骤，可以完成野生新食用菌的分离和人工驯化栽培。

值得注意的是，这个过程可能需要多年甚至更长时间的研究和实验，因此需要耐心和坚持。

同时，保护野生资源和合理利用新食用菌也是很重要的。

柞园红菇人工促繁初试作者：张永君张静来源：《河南农业·综合版》2022年第04期河南省位于黄河中下游，地处亚热带与暖温带过渡地区，真菌资源丰富，野生红菇分布广泛。

红菇种类属担子菌亚门，弹子菌纲，伞菌目，红菇科，红菇属，多数可食用且具有药用功能。

红菇被誉为“菇中之王”，含有丰富的氨基酸、多糖、有机酸、维生素、脂肪酸和甾体类化合物。

甾体类化合物对腰腿疼痛、手足麻木、筋骨不适、四肢抽搐、贫血有很好的疗效。

另外，红菇中的麦角甾醇物质具有抗癌和医疗保健功能。

红菇是不可多得的纯天然保健食用菌，一直以来深受人们喜爱。

河南省是一化性柞蚕主产区，拥有柞树资源100多万hm2。

其中，80万hm2柞树是红菇的共生树种。

红菇作为外生菌根菌，一旦与柞树形成菌根后，两者便形成了一种共生关系。

红菇可以扩大柞树根系的吸收表面积，提高柞树对磷、铜、锌、锰、铁、镁等微量元素的吸收能力，增强抗旱性和抗逆性，促进柞树生长。

由于柞树根系所产生的分泌物对红菇孢子萌发有刺激作用，且红菇能使柞树根系形成大量菌根，菌根外延成菌丝后集结成菌索，菌索扭结形成原基，在外界条件适宜时可发育成子实体。

南召县、方城县和鲁山县的柞园，是野生红菇天然产出地，一级鲜红菇的价格远远高于香菇。

柞蚕业在带动山区农村劳动力就业、增加收入的同时，又起到保持水土、绿化山川、改善生态环境的作用，是具有产业链条长、绿色环保的优势生态产业。

开展柞园红菇促繁研究，实现红菇资源有效利用，既保护了生态环境，又可以饲养柞蚕，为单位面积柞园增加了经济效益。

河南省一化性柞蚕品种资源保护基地位于被誉为“中国柞蚕之乡”的南召县，属北亚热带季风性大陆气候，具有明显的过渡特征，冬夏季较长，春秋季较短，四季分明，气候温和，雨量充沛，日照充足，年均气温18℃，年降水量69%集中在6—9月。

优越的自然条件有利于柞树的生长和柞蚕放养。

从2020年7—8月开始，河南省蚕业科学研究院在南召县开展了野生红菇促繁初步探索和试验，试验以现有已知红菇方面的数据资料为基础，采用半人工养殖方式，从野生红菇子实体中提取孢子，通过不同配方营养土培育好的菌丝植入柞园土壤中，同时加强柞园管理工作，保护柞树资源和生态环境，人为创造适合红菇的生长条件，探寻和开发红菇资源的有效途径。

中国造纸学报２００４增刊２００４中国科协学术年会第十一分会场论文集林下大型野生菌的分离培养研究木栾庆书金若忠云丽丽（沈阳农业大学沈阳１１０１６１）（辽宁省林业科学研究院）摘要对沈阳林下大型野生菌类调查和分离表明，沈阳辉山针阔混交林下，８月中旬至９月底，以马勃、乳牛肝居多。

８月下旬至９月底，乳牛肝和红菇是盛产期。

１０月铆钉菇较多。

木腐生菌黄伞和土腐生菌如环绣伞、麻脸菇、淡黄褐粉褶菌等都极易分离，成功率达８０９６以上。

疑似菌根菌种荷叶离褶伞、灰紫香蘑、马勃、须腹菌、桩菇、环柄菇等都能在供试种培养基上生长，燕麦、玉米和西瓜培养基是荷叶离褶伞分离的最佳培养基。

菌根菌血红铆钉菇，在以菇类子实体和玉米为主要成分的培养基上分离成达６．７％；其他菌根菌种如金乳牛肝菌、黄白粘盖牛肝菌、厚环乳牛肝菌、褐环乳牛肝菌等分离成功率为０－１０％。

红菇和乳菇，是极难分离的菌种，即使在组织块上已萌动，转接后仍不生长。

子实体含水量饱和的分离未成功。

关键词腐生胜菌；疑似菌根菌；菌根菌；分离培养林下珍稀野生菌类是非木材林产品的重要组成部分，在国家实施天然林保护工程之后，木材采伐量和以与木材相关产业的衰退已造成许多林区的经济困难。

鼓励非木材林产品的采集与销售是创造新的就业机会以及为地区经济的发展提供物资的一条途径。

然而杀鸡取卵式的采摘使一些珍稀菌类资源如松茸面临枯竭，因而如何维持、增加和保护林分的非木材林产品已成为当务之急。

２００３年秋，我们在进行菌根菌种的调查、采集、分离。

１调查与分离方法８月中旬至１０月中旬，在沈阳辉山（Ｅ１２３０３４＂３９＇，Ｎ４１０５３＂Ｎ４２００３７，海拔１３７～１６０ｍ）２０年生以上的油松、落叶松与水曲柳、柞树的混交林中进行调查采集，并及时在室内进行分离，以获得不同时期发生的子实体的种类。

将采集到的新鲜、幼嫩、无虫的子实体表面除杂后，按菌伞和菌柄不同部位分离。

分离所用培养基为：１号：ＰＤＡ，２号：ＰＳＡ；３号：松针土培养基，４号：菇类子实体培养基；５号：燕麦培养基，６号：玉米培养基，７号：高梁培养基，８号：黄豆粉培养基；９号：绿豆芽培养基，１０号：黄豆芽培养基，１１号：洋葱培养基，１２号：胡萝卜培养基，１３号：杏汁培养基，１４号：西瓜培养基；１５号：６一ＢＡ０．０５培养基，１６号：６－ＢＡ０．１培养基，１７号：６一ＢＡ０．１５培养基，１８号：６－ＢＡ０．２培养基，１９号：６－ＢＡ０．２５培养基；２０号：含Ｆｅ培养基，２１号：ＶＢｌ培养基，２２号：啤酒培养基，２３号：ｐＨ＞６．５培养基，２４号：ｐＨ＜６．５培养基。

红蘑(Gomphidius rutilus)学名血红铆钉菇，东北地区俗称红蘑、松树伞、松蘑等。

其子实体无任何毒性，富含多糖，其药用价值主要体现在真菌多糖的生物活性上，尚未实现人工培育[1]。

真菌多糖提取的传统工艺有热水浸提法、酸提法、收稿日期：2012-05-24基金项目：鞍山科技计划项目(08SF24)。

作者简介：李书倩(1975—)，女，博士研究生，副教授，研究方向为食品生物技术。

碱提法等，新兴工艺包括酶提法、超声波辅助法、微波辅助浸提法等[2]。

在粗多糖提取后，采用离子交换层析法是生物化学领域中常用的一种层析方法。

离子交换层析(Ion Exchange Chromatography，李书倩1,2，辛 广1,2，张 博1,2(1.鞍山师范学院化学系，鞍山 114007；2.沈阳农业大学食品学院，沈阳 110161)摘要：选择野生红蘑作为提取多糖的原料，采用预处理后的DEAE-52纤维素粉末制成OH -型柱对红蘑中的多糖进行分离纯化，结果表明：在上样量为200 mg 、洗脱速度为0.5 mL/min 的条件下洗脱，得到4个主峰，依次为GRP Ⅰ、GRP Ⅱ、GRP Ⅲ和GRP Ⅳ，其中GRP Ⅰ出现在水洗脱部分，GRP Ⅱ、GRP Ⅲ和GRP Ⅳ分别出现在0.1 mol/L NaCl 、0.3 mol/L NaCl 、1.0 mol/L NaCl 洗脱部分。

经计算，GRP Ⅰ、GRP Ⅱ、GRP Ⅲ和GRP Ⅳ分别占12.6%、8.7%、22.3%和27.6%。

关键词：红蘑；多糖；DEAE-52纤维素；纯化中图分类号：R 284.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)12-0170-04Separation and purification of Gomphidius rutilus polysaccharides bycolumn chromatographyLI Shu-qian 1,2, XIN Guang 1,2, ZHANG Bo 1,2(1.Chemistry Department of Anshan Normal University, Anshan 114007; 2.Food College ofShenyang Agriculture University, Shenyang 110161)Abstract: The primary purification of the polysaccharides extracted from Gomphidius rutilus was carried out by DEAE-52 cellulose chromatography, which was as a vector after pretreatment. The results show that, the four kinds of pure polysaccharide named GRP Ⅰ, GRP Ⅱ, GRP Ⅲ and GRP Ⅳ were mainly obtained when the adding sample was 200 mg and the rate of flow was 0.5 mL/min. GRP Ⅰ appeared undergoing distilled water elution in column chromatography. GRP Ⅱ, GRP Ⅲ and GRP Ⅳ appeared undergoing NaCl gradient elution with the concentration 0.1 mol/L, 0.3 mol/L and 1.0 mol/L in column chromatography. The ratio of them were12.6%, 8.7%, 22.3% and 27.6% respectively.Key words: Gomphidius rutilus; polysaccharide; DEAE-52 cellulose; purification红蘑多糖的纤维柱层析分离纯化2012年 第37卷 第12期简称为IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

红菇( Russula)属真菌属担子菌亚门、层菌纲、红菇目、红菇科。

国际上已报道的红菇属真菌有300多种，我国有记载的90余种，其中多数可食用且具有药用功能。

长期以来被作为一种名贵的药食兼用真菌，具有补血壮体、延缓衰老、养血养颜、防癌抗癌、降低胆固醇等多种保健功效，是世界上不可多得的纯天然的保健食用菌，因此野生红菇一直都受到人们的青睐。

近年来，国内外有不少关于野生红菇的报道，主要集中在野生红菇的生态、资源、分类、分离纯化和应用研究等，国内外的一些科研机构也对红菇的化学成分以及子实体多糖提取等进行了研究，为进行人工栽培研究提供了科学依据。

但到目前为止，由于红菇生长所需的条件及生理的特殊性，红菇仍是野生采集，国内外至今也未见成功的规模栽培报道。

1 红菇的生态学研究表明红菇的发生与植物群落有密切的对应关系，常散布于针叶林、阔叶林和混交林地上，但有些种类只限于某种树木的林分内。

例如，福建闽西常见的大红菇(R．alucea)受某些树种如栲树根系的影响，主要生长在以山毛榉科为主的常绿阔叶林地上。

叶绿红菇（R.heterophylla）与承青冈属、栎属、云杉属的一些树种形成外生菌根。

大白菇（R．delica）易发生在赤松、黑松、桴栎、蒙栎、米槠、落叶松等针叶或混交林中地上。

绿菇（R．tirescens）与栎桦、栲、粟形成菌根。

梨菇（R．cyanox- antha）常见于栲树米槠青冈栎、马尾松等阔叶林地上。

红色红菇（R.rasea）单生、散生至群生于阔叶林或混交林中。

大多数红菇可与2种或多种植物共生，如鳞盏红菇（R.lepida）可和松、落叶松、云杉、冷杉、黄杉、栗、桦、鹅耳枥等8种植物共生，形成外生菌根菌。

红菇如同其他许多外生菌根真菌一样，它的发生和分布反映了其宿主植物的类型、基质土壤的营养状况、pH值、温度等生态条件，显然这些因子对红菇的发生和分布起着决定性的作用。

一般认为温带冷灰壤，山地红棕壤及红壤等多种富含有机质，透气保水性好的土壤类型中都可有红菇的发生。