生物标志物实验ppt-PowerPointPresen

生物标志物实验pptPowerPointPresen
2020年5月26日星期二
目录
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目的与要求
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实验原理
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设备与材料
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步骤与方法
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结果与报告
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1 目的与要 求
（1）了解有机污染物对代谢关键酶谷胱甘肽转移酶活 性影响。
（2）掌握谷胱甘肽转移酶酶活性的体外测定方法。
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2 实验原理
谷胱甘肽转移酶（GSTs；也叫谷胱甘肽转硫酶）是 细胞质内催化相Ⅱ反应起解毒作用的重要酶，具有许多同 工酶。污染物进入体内经过相Ⅰ反应后，在谷胱甘肽转移 酶的催化下，细胞内还原性谷胱甘肽能结合相Ⅰ反应产生 的亲电性中间体，从而生成亲水性的化合物。细胞膜上有 多种的跨膜运输机制（如通过ATP推动GS-X泵）能使这 类亲水性的化合物排出细胞，使之进入血液循环并最终以 尿液等形式排出体外，从而起到解毒作用。在很多物种中 ，谷胱甘肽结合作用是相Ⅱ反应的主要形式。
④20mmol/L GSH标准液的配制 配制100mmol/L EDTA母液，用0.1mol/L KH2PO4稀释母液至EDTA的浓 度为1mmol/L。在1mmol/L的EDTA溶液中加人适量GSH 使其终浓度为20mmol/L。用1mol/L HCl或1mol/L KOH 校正pH。于阴暗处保存，-20℃可保存一个月，-4℃可保 存5d。
GSTs催化的一般反应为：
GSH +R-X = GSR + HX 在该反应中，GSTs的主要功能是通过其活性中心增 加GSH和亲电性底物的接触机会，然后激活GSH上琉基 ，诱导其对底物的发动亲核性攻击从而形成结合产物。
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2 实验原理
迄今的研究表明GSTs存在于所有的动物体内，肝脏 是脊椎动物种GSTs分布的主要场所。鼠肝中的GSTs占 可溶性肝蛋白的10％，而鱼肝中的GSTs也是可溶性肝 蛋白的主要成分。GSTs能被多种的污染物所诱导，如有 机氯农药、多环芳烃和多氯联苯等。在哺乳动物中，经 多环芳烃处理后，其肝脏中GSTs活性比对照组高1.5～ 2.0倍。在不同的水生动物体内GSTs可被多环芳烃诱导 ，其活性高于对照组2倍。野外研究发现，在同一条河流 中，污染段面鱼体内肝脏组织和消化管组织中GSTs含量 和活性比清洁断面高出3～4倍。然而，研究也发现 GSTs活性活性诱导受环境条件、生物种类和化合物性质 的影响，存在较大的差异。
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4 步骤与方 法
从上述的反应体系中取出200uL和Bio-Rad反应过 的蛋白液（钩虾组织破碎液上清，牛血清蛋白），每组 设三个平行，加入96孔板内。25℃下，摇动96孔板20s 后，用酶标仪测定620nm下的吸光度。根据牛血清蛋 白标准液的读数汇出标准曲线，计算出曲线的斜率K。
蛋白浓度
式中：OD620为待测样品620nm下的吸光度；K为 牛血清蛋白标准样曲线的斜率。
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5 结果与报 告 1.急性毒性试验结果记录
曝气水 溶剂组 林丹 林丹 林丹 林丹 林丹 空白 对照 1ug/L 3ug/L 6ug/L 12ug/L 24ug/L
各实验 组参数
溶解氧 （mg/L
）
pH
电导率 （ms）
0（h）
钩虾死 24（h
亡个体 ）
数(只) 48（h
）
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5 结果与报 告
2．酶活力与蛋白活力的测定试验结果记录
，酶标仪（Bio-Tek Instruments，INC）pH计，溶解 氧测定仪，电导率测定仪，96孔板，1.5mL离心管，水 浴锅，生物冰袋，移液枪（20uL、100uL、1000uL）及 对应枪头。
2．受试生物 成年雄性的钩虾（Gammarus pulex）。从野外采
集投放在 10L的有机玻璃缸中，人工曝气，在 15℃（ ±1℃），12h光照的条件下至少驯养一周，才能进行染 毒暴露。驯养期间，用接种了真菌（Cladospurium sp. ）发酵1周的桤木叶（Alnus glutinosa L.）喂食。
（iii）空白缓冲液（BB）：含有0.1％Triton X-100（ v/v）和1.0％PMSF（v/v）的磷酸缓冲液。
②100mmol/L PMSF溶液 用95％乙醇溶解适量的 PMSF，于阴暗处保存，-20℃可保存一个月，-4℃可保存 5d。
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3 设备与材 料
③40mmol/L CDNB溶液 用95％乙醇溶解适量的 CDNB，保存方法与PMSF相同。
露于梯度林丹浓度中。暴露温度设定在15℃±1℃，光 暗比为12h︰12h。实验开始时测定各浓度梯度林丹曝 气水的溶解氧，pH和电导率。
暴露48h后，将存活的个体从容器中打捞出来，先 用吸水纸将表面的水分吸干之后，然后放入1.5mL的聚 乙烯离心管中（每管一只）。将这些离心管的放入液氮 罐20s以猝死钩虾。取出的离心管在-70℃保存。
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3 设备与材 料
3．试剂 1-氯-2，4-二硝基苯（CDNP），还原性谷胱甘肽（
GSH），谷胱甘肽转移酶标准品（GSTs），苯甲基磺酰 氟（PMSF），Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）， EDTA。 4．溶液的配制 （1）林丹储存液
取50mg林丹固体颗粒，溶于500mL的丙酮中配制成 100mg/L的林丹储存液，于4℃下阴暗处密封保存备用。
基于上述原因，用GSTs作为生物标志物来指示特定 的污染暴露，近年来在生态毒理学的研究中获得了广泛 的运用。在本实验中，将采用体内实验的方法，测定水 生动物暴露于有机氯农药林丹（Lindane）之后，其体 内GSTs酶活性的变化。
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3 设备与材 料
1．器材 冷冻离心机（Beckman Coulter 22R centrifuge）
酶活测定OD340(min)
蛋白测定OD620 酶活(mol·L·g-1·min-
1)
曝气水 溶剂组 林丹 林丹 林丹 空白 对照 1 ug/L 3 ug/L 6 ug/L
林丹 12ug/L
林丹 24 ug/L
பைடு நூலகம்
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在一个干净的1.5mL的离心管内加入500uL酶活为 1.4单位/mL的谷胱甘肽转移酶标准样品，加入500uL的 冷的空白缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀。
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4 步骤与方 法
在96孔板中加入50uL的GST标准样品，钩虾组织液上清 或者空白缓冲液（BB），每组设四个平行。然后加入150uL 酶活测定液，使每个孔内含有200uL的反应液。将96孔板放入 酶表仪30℃轻微震荡反应30min，然后充分震荡96孔板以混合 各反应液。340nm下每隔1min记录一个吸光值，计算吸光值 随时间的变化的斜率。
GST酶活
式中：OD为吸光值随时间变化的斜率（OD340/min）； ε为摩尔吸光系数（9600mol-1cm-1）；R为反应系统体积（ uL）；S为样品上清的体积（uL）；W为样品蛋白浓度（g/L ）； P为样品厚度（0.6cm）。
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4 步骤与方
法
3．总蛋白的测定
以牛血清蛋白为校正标准，用Bio-Rad公司的试剂盒 检测定钩虾组织破碎液中的蛋白质浓度。将牛血清蛋白溶 于磷酸缓冲液（pH=6.5）中，配制成200mg/L的蛋白标准 液。取 0mL、0.25mL、0.75mL、1.00mL和1.35mL该蛋 白标准液，先加入8mL磷酸缓冲液（pH=6.5），再加入空 白缓冲液BB（pH=6.5），配制成浓度依次为0mL、 5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL和25.0mL的蛋白标 准液系列。从每个浓度的蛋白标准液中取出800uL至干净 的EP管中，加入200uL Bio-Rad产品。稀释缓冲液取 80uL的虾组织液上清至一个干净的EP管中，加入80uL的 0.1％的Triton X-100，用640uL磷酸缓冲液（pH=6.5）稀 释混合液至800uL，加人200uL Bio-Rad产品。
⑤酶活测定液 实验之前配制，将CDNB和GSH溶液 从冰箱中取出，置于室温。取5份的20mmol/L GSH标准 液、9份的磷酸缓冲液（pH=6.5，0.02mol/L）和1份的40 mmol/L CDNB溶液，充分混合，配制成酶活测定液。
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4 步骤与方 法
1．暴露试验 按照急性毒性试验方法，将雄性的成年钩虾分别暴
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4 步骤与方 法
2．酶活力的测定 将1.5 mL离心管从超低温冰箱中取出，加入100uL
的冷的组织破碎缓冲液（pH=6.5）。捣碎研磨管内的钩 虾20～30min，加入9uL冷的冲洗缓冲液DB（pH=6.5） 。4℃下14000g离心3min，取100uL的上清。将此上清 移另一置于生物冰袋上的离心管中。往新的离心管内加 入900uL空白缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀，待用。
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3 设备与材 料
（2）酶和缓冲液 ①配置pH=6.5，0.02M磷酸缓冲液（PB） 利用此磷
酸缓冲液配制下面三种实验缓冲液：
（i）组织破碎缓冲液（HB）：含有1.0％Triton X100（v/v）和1.0％PMSF（v/v）的磷酸缓冲液；
（ii）冲洗缓冲液（DB）：含有1.0％PMSF（v/v）的 磷酸缓冲液；