微生物基本操作规范(4)接种、分离纯化

一、实验方案
1. 实验现象与结果
2. 本实验的关键环节及改进措施
⑴、接种环的灭菌操作要到位:接种环使用前, 直接在酒精灯上烧灼灭菌, 把环和金属丝烧红即可。

接种环使用后, 先在火焰周围把环上标本烤干, 再烧灼灭菌, 以免标本汽化, 爆烈四溅, 污染环境。

金属杆快速通过火焰2－3次, 杀灭表面微生物。

⑵、划线技术要很娴熟,具体要求参照上图。

⑶、整个过程要严格防止实验中被污染,每个阶梯稀释换新的移液管,要等平板冷却后再倒置。

思考题
1.食品中微生物为何繁殖迅速、种类繁多？
2.食品被微生物污染后有哪些危害？
3、检样稀释时, 每个稀释度都要更换刻度吸管, 为什么？
1.答:因为食品中含有大量的淀粉、蛋白质、糖类、脂肪等有机物, 且无机盐含量相对较低, 食品中含有一定的水分, 并且食品包装后容易使内部升温, 这些都是很适合微生物(细菌、原虫、病毒)生长繁殖的情况, 因此食品中的微生物能够繁殖迅速且种类繁多。

所以很多食物要严格灭菌或者添加防腐剂、干燥剂、脱氧剂等, 或者真空包装。

2.答:⑴、降低食品的营养；
⑵、引起食品腐败变质；
⑶、引起呕吐、中毒或者某些疾病(如痢疾、腹泻、呼吸道感染等)和潜在性的慢性危
害等。

3.答: 每个稀释度都要更换刻度吸管可以在一定程度上保证不会沾有上一个稀释度得溶液, 且减少污染, 使浓度稀释得更加准确, 增加实验结果的准确性。

指导教师评语及评分:
签名: 年月日。

微生物的基本操作方法
微生物的基本操作方法包括以下几个方面：
1. 无菌操作：在进行微生物实验或培养时，需要保持操作环境的无菌。

操作者应注意洗手、穿戴实验服、戴手套，并在无菌工作台或无菌室内进行操作。

可用酒精灯或紫外线灯消毒操作区域，以杀灭空气中的微生物。

2. 培养基的制备：根据所需的微生物类型选择适当的培养基，并按照配方制备。

培养基通常包括基础培养基、食物源、pH调节剂和琼脂等成分。

制备时需要称取和溶解成分，并用高压蒸汽或高温灭菌来杀灭培养基中的微生物。

3. 培养器具的消毒：使用前要对培养器具进行消毒处理，常用的方法有高压蒸汽灭菌、高温灭菌、紫外线消毒等。

确保培养器具的表面和内部都不带有致病菌。

4. 菌种的接种：将所需的菌种接种到培养基上。

通常使用接种环、接种针或接种环针进行接种。

在接种时要注意无菌操作，以避免外来细菌的污染。

5. 培养条件：对于每一种微生物，根据其生长特性和要求，设置适当的培养条件。

例如，合适的温度、湿度、pH值和氧气浓度等都会影响微生物的生长。

6. 培养观察：在培养过程中，定期观察微生物的生长情况。

可以使用显微镜观察细菌或酵母菌的形态，或者通过目测观察细菌悬浊液的浑浊度和沉淀情况来判
断微生物是否生长良好。

7. 分离纯化：将培养基上生长的微生物单克隆分离纯化，得到纯系菌株。

通常可以使用藻糖水平板或琼脂斜面触点法进行分离，将不同的菌落孤立开来。

8. 培养维持：根据微生物的生长要求，每隔一段时间更换培养基、条件，以保持微生物的生长和繁殖。

同时，也需要妥善保存纯化的菌株，以备后续实验使用。

实验二微生物的分离、纯化和接种微生物的分离、纯化1、目的要求1.1了解微生物分离和纯化的原理1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法2、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。

而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。

3、实验材料3.1培养基肉汤培养基（固体）。

3.2溶液或试剂盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。

3.3仪器或其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。

4流程倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。

5、步骤5.1平板划线分离法5.1.1倒平板倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。

并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。

5.1.2划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。

划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。

实验二微生物的分离、纯化和接种微生物的分离、纯化1、目的要求1.1了解微生物分离和纯化的原理1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法2、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。

而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。

3、实验材料3.1培养基肉汤培养基（固体）。

3.2溶液或试剂盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。

3.3仪器或其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。

4流程倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。

5、步骤5.1平板划线分离法5.1.1倒平板倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。

并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。

5.1.2划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。

划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。

微生物培养及实验基本操作技术一、培养基配制培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。

配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。

注意事項–灭菌锅的使用①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培养基中的主要成分及其作用：营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等抑制剂：1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。

2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。

培养基的类型：●根据培养基的物理状态来区分：1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。

●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。

●根据培养基的用途来区分：➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。

微生物的纯培养、分离纯化和平板菌落计数法姓名摘要：纯培养技术是进行微生物学研究的基础。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数。

本实验通过稀释涂布平板法和平板划线分离法分离纯化微生物以获得纯培养并进行平板菌落计数，旨在了解微生物的纯培养含义和意义、熟练掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术、了解利用平板菌落计数法测定微生物样品中活细胞的原理、学习平板菌落计数的操作步骤与方法。

实验结果表明，本实验达到了预期的目的。

关键词：微生物的纯培养、微生物的分离与纯化、平板菌落计数法1.引言自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。

人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。

也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。

只有纯培养物才能提供可以重复的有意义的结果，纯培养技术是进行微生物学研究的基础。

形状稳定的纯培养（菌种）是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。

稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。

后几种方法不需要特殊的仪器设备，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。

常用的方法有：（1）简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。

简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。

它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。

将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。

环工综合实验细菌得分离纯化与接种实验实验报告环境科学与工程学院实验中心实验原理问答题：１、为什么湖水用10－4、１0-5、10－6稀释液进行平板稀释分离而不用更高或者更低得浓度？答：因为在这三个浓度范围内能尽量使样品中得微生物分散开，使其成单个个体/细胞存在,否则一个菌落就不只就是代表一个个体生长而成得，从而方便计数。

2、为什么平板培养皿要倒置放入恒温箱中进行培养?答：第一，为了防止重力对菌落得生成产生影响;第二,为了防止培养基中得水分蒸发后凝结在壁上,滴落后影响菌得生长与形态观察;第三，防止培养基干涸。

３、微生物常用接种方式有哪些?进行微生物接种应该注意哪些方面?答:⑴划线接种，涂布接种，穿刺接种,三点接种,浇混接种，液体接种,注射接种,活体接种等。

⑵接种用具及培养基等均需灭菌处理,接种过程必须在煤气灯旁进行,接种环、玻璃涂棒等器具要过火处理，把所要用到得器材与菌种培养基有序编号放置,操作时应避免已经灭菌处理得材料用具与周围得物品得接触，往培养基就是划线或点菌时动作要轻以防把培养基划破等。

四、实验步骤１、制备细菌稀释液:ﻭ使用5mｌ移液管加４、5ｍl无菌水放入贴有10—3、１0—4、10－5、10-6标签得小试管中,用一根1ml得无菌移液管吸取１0-2得湖水稀释液0、5ml放入贴有1０-３标签得小试管中，1ｍl得无菌移液管吸洗三次以混匀。

然后用另外一支1ｍl得无菌移液管从贴有１0-３标签得小试管中吸取10-3得湖水稀释液0、5ml放入贴1０—4标签得小试管中，吸洗三次以混匀。

同法依次连续稀释六、思考题１、氧化亚铁硫杆菌( Thｉoｂaciｌlｕsfｅrrooxiｄans,Ｔ、f ）为生物冶金重要菌种，属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。

广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉与沉积硫内，尤以金属硫化矿与煤矿等酸性矿坑水(pH<4）中最为常见。

其化能自养,专性好氧，嗜酸,革兰氏阴性,,主要利用利用CＯ2为碳源,并吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。

微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤一、目的要求1、掌握各种分离、接种方法。

2、掌握无菌操作基本环节。

二、实验说明微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。

在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。

微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。

然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。

三、实验材料1、恒温培养箱。

2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。

3、培养基（上次实验配制的）。

4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。

四、方法步骤（一）接种的操作1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。

（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。

（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。

（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。

（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。

（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。

（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。

从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。

有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。

（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。

从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。

有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。

（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。

环工综合实验细菌的分离纯化和接种实验实验报告环境科学与工程学院实验中心实验原理问答题：1.为什么湖水用10－4、10－5、10－6稀释液进行平板稀释分离而不用更高或者更低的浓度？答：因为在这三个浓度范围内能尽量使样品中的微生物分散开，使其成单个个体/细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个个体生长而成的，从而方便计数。

2.为什么平板培养皿要倒置放入恒温箱中进行培养?答：第一，为了防止重力对菌落的生成产生影响；第二，为了防止培养基中的水分蒸发后凝结在壁上，滴落后影响菌的生长和形态观察；第三，防止培养基干涸。

3.微生物常用接种方式有哪些？进行微生物接种应该注意哪些方面？答：⑴划线接种，涂布接种，穿刺接种，三点接种，浇混接种，液体接种，注射接种，活体接种等。

⑵接种用具及培养基等均需灭菌处理，接种过程必须在煤气灯旁进行，接种环、玻璃涂棒等器具要过火处理，把所要用到的器材和菌种培养基有序编号放置，操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品的接触，往培养基是划线或点菌时动作要轻以防把培养基划破等。

四、实验步骤1.制备细菌稀释液：使用5ml移液管加4.5ml无菌水放入贴有10-3、10-4、10-5、10-6标签的小试管中，用一根1ml的无菌移液管吸取10-2的湖水稀释液0.5ml放入贴有10-3标签的小试六、思考题1.氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillusferrooxidans,T.f ）为生物冶金重要菌种，属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。

广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉积硫内，尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑水（pH<4）中最为常见。

其化能自养，专性好氧，嗜酸，革兰氏阴性，，主要利用利用CO2为碳源，并吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。

请思考其分离纯化的方法和步骤。

答：采取酸性矿坑水或实验室浸矿培养液作为菌液，在实验室用9K或Leathen 培养基反复分离纯化。

微生物实验室操作规范及其仪器的使用微生物实验室是一个专业的实验室，主要用于微生物的研究和培养的工作，同时需要严格遵守相关操作规范和使用仪器的要求，以保证实验结果的准确和可靠性。

本文将介绍微生物实验室操作规范及其仪器的使用。

一、微生物实验室操作规范1. 常规操作规范(1) 实验前应对工作台、设备、器皿进行彻底清洗、消毒，并检查实验室是否达到了要求的效果。

(2) 实验之前应根据实验需要准备好所需的培养基、培养物、试剂、仪器等。

(3) 实验室中应注意保持室内干燥、卫生、通风，应避免直接阳光照射。

(4) 实验人员应佩戴实验室专用的实验衣、手套、口罩等防护用品，并遵守实验室的安全操作规程。

2. 培养物操作规范(1) 确保培养物的来源、存储方式和实验所需，应根据操作要求对培养物进行前处理。

(2) 培养物的接种应选择合适的接种方法，并注意接种数量和接种时间。

(3) 培养物的恒温培养过程应始终保持适宜的温度和密度，监测培养物的生长情况。

(4) 培养物的收获应遵循操作规范，应先逐一标记，记录文档，再进行存储。

3. 实验室消毒规范(1) 实验室的坐标区域、仪器、器械、培养基等常常需要经常清洗与消毒处理，必须遵守以下操作规范来消毒。

(2) 操作必须全程穿戴防护和消毒的个人装备，如实验室外套、手套和实验室白袍等。

(3) 消毒必须用消毒剂，消毒剂在消毒前需要必须进行相关的检测。

(4) 消毒剂必须选用消毒效果强、安全、易洗净的。

饮食、药物、人员及其他物品的消毒与管理必须严格符合国家相关规定。

二、微生物实验室仪器的使用微生物实验室仪器主要用于微生物的分离、培养、识别、检测等领域。

以下是微生物实验室常见仪器的介绍:1. 离心机离心机主要用于离心分离和稀释悬液，精简样品和浓缩微生物悬浮液和药品、原料等。

离心机的使用需要注意转数、时间等参数的设置，以保证实验结果的准确性和可重复性。

2. 光学显微镜光学显微镜主要用于观察微生物的特征结构以及对微生物的检测和识别，对于微生物实验室来说是一种必备的仪器。

微生物基本操作规范培养基的制备培养基概念：是指以液体、半固体或固体形式，包含天然或合成成分，用于促进微生物的繁殖或保持其活力的物质组成。

由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。

我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。

培养基的分类：按功能分类：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、特殊培养基。

按物理性状分类：液体培养基、固体培养基、半固体培养基。

液体培养基：所配制的培养基是液态的，这种培养基被用来微生物的增菌和生长状态观察。

固体培养基和半固体培养基：在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基。

常用作凝固剂的物质有琼脂。

固体培养基琼脂用量1.5-2%，半固体培养基琼脂用量在0.5～1%之间。

固体培养基用作微生物的分离、鉴定、计数、保藏等。

半固体培养基被用来观察微生物的动力和保藏菌种。

今天给大家展示一下各种培养基的制备。

培养基制备的基本过程：调配成分、溶解、校正pH、分装、灭菌、质量检查和保存所需物品：试剂、锥形瓶、天平、量筒、微波炉、高压蒸汽灭菌器、玻璃试管、玻璃平板、接种工具。

（1）调配成分：在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水200ml，1％蛋白胨，0.5％NaCL，0.3％牛肉膏（g/v），准确称取各种成分，使其充分混合。

[注意事项]培养基调配溶解：先在锥形瓶底加入少量的蒸馏水，再加入培养基成分，以防其粘在锥形瓶底部烧结。

制备培养基时，除玻璃容器时，还可用铝锅，搪瓷桶，但不可用铁，铜等容器，以免铁和铜离子进入培养基（培养基中铁离子含量超过0.14mg/L时抑制细菌毒素的产生，含铜量超过0.3mg/L 时抑制细菌的生长）。

培养基中若需加入染料，胆盐，指示剂等，应在校正pH后加入。

（2）溶解：将配制好的混合物微波炉加热8min，使其完全溶解，补足失水。

（3）校正PH：不同的细菌需要在含不同pH培养基上生长，一般将培养基的pH 调至7.2～7.6。

微生物分离纯化的原理
微生物分离纯化的原理是利用微生物在培养基上的生长特性差异，通过适当的培养条件和方法，将混合菌落分离出单一菌落，并将其纯化。

微生物分离纯化的步骤主要包括：
1. 选择合适的培养基：根据待分离微生物的特性，选择适合其生长的培养基。

培养基的选择要考虑 pH 值、营养成分和添加
的选择性抑制剂等因素。

2. 接种样品：将待分离微生物的样品接种在培养基上，通过涂布、均匀涂布、点接种等方法将样品均匀地分布在培养基上。

3. 培养条件控制：根据待分离微生物的生长要求，控制培养条件，如温度、湿度、气体组成等，以促进微生物生长。

4. 分离单一菌落：经过一定时间的培养，单一菌落开始形成。

通过肉眼观察或显微镜观察，识别出目标菌落，并用针筒或接种环将该菌落转移至新的培养基上，实现分离纯化。

5. 进一步纯化：如需要更进一步纯化，可以重复分离的步骤，直至获得纯净的单一菌落。

也可以借助生理生化特性、抗生素敏感性等方法进行进一步鉴定和纯化。

通过以上步骤，微生物的分离纯化可以获得纯净的单一菌株，为后续的研究和应用提供可靠的基础。

培养基的制备培养基概念：是指以液体、半固体或固体形式，包含天然或合成成分，用于促进微生物的繁殖或保持其活力的物质组成。

由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。

我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。

培养基的分类：按功能分类：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、特殊培养基。

按物理性状分类：液体培养基、固体培养基、半固体培养基。

液体培养基：所配制的培养基是液态的，这种培养基被用来微生物的增菌和生长状态观察。

固体培养基和半固体培养基：在液体培养基中加入适量的凝固剂制成成固体培养基和半固体培养基。

常用作凝固剂的物质有琼脂。

固体培养基琼脂用量1.5-2%，半固体培养基琼脂用量在0.5～1%之间。

固体培养基用作微生物的分离、鉴定、计数、保藏等。

半固体培养基被用来观察微生物的动力和保藏菌种。

今天给大家展示一下各种培养基的制备。

培养基制备的基本过程：调配成分、溶解、校正pH、分装、灭菌、质量检查和保存所需物品：试剂、锥形瓶、天平、量筒、微波炉、高压蒸汽灭菌器、玻璃试管、玻璃平板、接种工具。

（1）调配成分：在锥形瓶或大容量烧瓶中依次加入蒸馏水200ml， 1％蛋白胨，0.5％NaCL，0.3％牛肉膏（g/v），准确称取各种成分，使其充分混合。

[注意事项]培养基调配溶解：先在锥形瓶底加入少量的蒸馏水，再加入培养基成分，以防其粘在锥形瓶底部烧结。

制备培养基时，除玻璃容器时，还可用铝锅，搪瓷桶，但不可用铁，铜等容器，以免铁和铜离子进入培养基（培养基中铁离子含量超过0.14mg/L时抑制细菌毒素的产生，含铜量超过0.3mg/L 时抑制细菌的生长）。

培养基中若需加入染料，胆盐，指示剂等，应在校正pH后加入。

（2）溶解：将配制好的混合物微波炉加热8min，使其完全溶解，补足失水。

（3）校正PH：不同的细菌需要在含不同pH培养基上生长，一般将培养基的pH调至7.2～7.6。

微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理微生物纯种分离、培养及接种技术是微生物学中最基本的实验技术之一。

其目的是从混合的微生物菌群中分离出单一的微生物菌落，并在适宜的培养条件下进行纯化和生长，以获得纯种微生物。

一、实验器材和试剂1.灭菌针2.毛细胞计数板3.显微镜4.平板接种器、针头5.无菌匀浆棒、吸管6.细菌培养基7.消毒液二、实验步骤1. 样品处理及制备首先需要选择一份待测试的样品，包括土样、水样、空气、食品等，然后将样品采集到无菌容器中，再将其送到实验室。

在进行样品处理之前，需要先进行简单的初步处理，将样品进行稀释或者过滤，将其中的杂质和大颗粒物去除，以利于后续实验的操作。

接下来需要进行制备培养基，根据不同的微生物种类，需要选择适当的培养基进行培养。

通常情况下，我们可以使用凝胶培养基、液体培养基、甜菜汁培养基等，以满足微生物在不同环境下生长所需的营养物和成分。

2.分离纯化分离纯化是该实验的关键步骤。

将经过预处理的样品移到无菌试管中，打开试管口，加入适量的制备好的培养基，然后利用匀浆棒或吸管将混合物均匀混合。

然后利用平板接种器将混合物接种到培养基平板上，使其密切接触。

然后将接种好的平板置于恒温箱中，以利于微生物的生长和营养物质的自我繁殖。

在接种后2-7天内，不同类型的微生物将在培养基平板上生长出不同的菌落，每一种菌落都代表一种单一的微生物。

将这些菌落分离提取，并再次进行培养，就能得到单纯的微生物菌种。

3.纯种微生物菌种接种在获得单纯的微生物菌种之后，需要将其再次接种到培养基中进行培育。

将相应体积的纯种菌种接种到培养基平板上，使其能够生长繁殖。

在接种后约24小时内，微生物将在培养基中生长出许多菌落。

根据菌落的特征和形态，可以对不同的微生物进行鉴定和分类。

如果需要进行更加深入的分析，可以对微生物菌种进行进一步培养、萃取定量和测序等工作，以获取更多的相关信息。

三、实验注意事项1. 实验前需要保证实验室内部环境和仪器均为无菌状态。

环工综合实验细菌的分离纯化和接种实验实验报告环境科学与工程学院实验中心实验原理问答题：1.为什么湖水用10－4、10－5、10－6稀释液进行平板稀释分离而不用更高或者更低的浓度？答：因为在这三个浓度范围内能尽量使样品中的微生物分散开，使其成单个个体/细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个个体生长而成的，从而方便计数。

2.为什么平板培养皿要倒置放入恒温箱中进行培养?答：第一，为了防止重力对菌落的生成产生影响；第二，为了防止培养基中的水分蒸发后凝结在壁上，滴落后影响菌的生长和形态观察；第三，防止培养基干涸。

3.微生物常用接种方式有哪些？进行微生物接种应该注意哪些方面？答：⑴划线接种，涂布接种，穿刺接种，三点接种，浇混接种，液体接种，注射接种，活体接种等。

⑵接种用具及培养基等均需灭菌处理，接种过程必须在煤气灯旁进行，接种环、玻璃涂棒等器具要过火处理，把所要用到的器材和菌种培养基有序编号放置，操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品的接触，往培养基是划线或点菌时动作要轻以防把培养基划破等。

四、实验步骤1.制备细菌稀释液：使用5ml移液管加4.5ml无菌水放入贴有10-3、10-4、10-5、10-6标签的小试管中，用一根1ml的无菌移液管吸取10-2的湖水稀释液0.5ml放入贴有10-3标签的小试六、思考题1.氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillusferrooxidans,T.f ）为生物冶金重要菌种，属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。

广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉积硫内，尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑水（pH<4）中最为常见。

其化能自养，专性好氧，嗜酸，革兰氏阴性，，主要利用利用CO2为碳源，并吸收氮、磷等无机营养来合成自身细胞。

请思考其分离纯化的方法和步骤。

答：采取酸性矿坑水或实验室浸矿培养液作为菌液，在实验室用9K或Leathen 培养基反复分离纯化。