真核基因组DNA提取

作用。
如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
核酸提取的一般过程
1）破碎细胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，
冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。
动物：液氮处理后用匀浆器破碎。
细胞器DNA：首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
核酸提取的一般过程
2）破碎抽提核酸除去杂质 1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋 白与其它成分分离 2．使核酸与蛋白质分离 3．除去脂类 4．多糖的除去
核酸提取的一般过程
3）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核 酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐 、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核 酸样品。
(事先预热55～65 ℃)→置于室温2 min→12,000 rpm离心2 min→所得液体即为基因组DNA溶液。
• Elution Buffer（EB）：主要是TE buffer,提供 高pH值环境，使吸附的DNA被洗脱下来
注意事项
• 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA 量少，纯度低。 • 由于真核生物基因组较大，操作时应注意 轻柔，最大限度地减少机械和化学作用对 DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA。
DNA提取常见问题
问题三：DNA提取量少
1.
原因
实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全
2.
1. 2. 3. 4.
3.
对 策
4. 5. 6.
洗涤时DNA丢失
尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料 动植物要匀浆研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤 液吸出，勿倾倒
实验原理
想要制备基因组DNA，必须破碎细胞膜， 去除蛋白质、脂类和糖类等生物大分子且避 免被细胞内核酸酶降解即保证DNA的完整性。
• 在EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下， 将分散好的真核生物组织、细胞用蛋白酶K消化真核细胞
或组织并分解蛋白质，
• 用SDS溶解细胞质并使蛋白质变性从而与DNA分子分离， 使DNA分子以可溶形式存在于溶液中。
3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠 、三异丙基萘磺酸钠
核酸制备中常用的蛋白质变性剂
蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以 防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。
3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的
实验结果
核酸（DNA及RNA）的鉴定及定量 紫外分光光度法
琼脂糖凝胶电泳法
紫外分光光度法 —测定DNA的纯度和浓度
•原理：
DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫外光区具 有较强的吸收,其吸收峰在260 nm处。当DNA样品中 含有蛋白质、酚或其他小分子污染时，会影响DNA 吸收光的准确测定。蛋白质在280 nm处有最大的吸 收峰，盐和小分子则集中在230 nm处。因此，一般 情况下同时检测同一样品的OD260、OD280 和OD230计 算其比值来衡量样品的纯度。
Wash buffer A（
含60%的乙醇）
Wash buffer B（
含80%的乙醇）
主要去除盐等杂 质
再次12,000 rpm离心2 min，将离心柱置于新的 离心管中，并打开离心柱盖，于室温或37 ℃恒 温箱放置5~10min，直至无明显乙醇味
3. 洗脱DNA
在硅基质膜中央加入50 μL Elution Buffer（EB）
纯度的检测
•DNA纯品的OD260/OD280 约为1.8。 OD260/OD280＞1.9说明含有RNA污染； OD260/OD280＜1.6 说明有残余的蛋白质、酚等 存在。
•OD230/OD260的比值应在0.4~0.5之间，若比值较高 说明有残余的盐存在。
•有些分光光度计则显示OD260/OD230，其比值应在 2~2.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。
主要含有 SDS（溶解细胞质并使蛋白质变性） EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase） 和Tris-HCl （缓冲体）
加入10 μL 蛋白酶 K ， 60 ℃水浴1h， 其间颠倒混匀数次
消化降解蛋白质
加入10 μL RNase A，混匀， 室温放置10 min
核酸内切酶、 去除DNA制品中的污染RNA
2.
对 策
3.
4. 5.
6.
尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融
琼脂糖凝胶电泳法 —分离鉴定核酸的常规方法
• 用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
• 琼脂糖（Agarose，AG）是琼脂中不带电荷的中 性组成成份（几乎不含硫酸根，主要成分为多 糖），其水溶液可以制成凝胶，具有多孔网状结 构。
•结果观察：
制备凝胶时先加入少量荧光染料，其分子 可插入DNA的碱基之间，可在紫外灯下直接观
对于RNA，因分子较小，不易被机械剪切力拉断 ，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法 抑制RNase更重要。
核酸酶的抑制和抑制剂
DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA
或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。
②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使
DNase失活。
• •
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原因
1.
A260/280<1.8
1.
DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有 酒精残留，酒精抑 制后续酶解反应 DNA中残留有金属 离子
• DNA在高盐低pH的条件下，与硅基质膜特异性结合，在低 盐高pH值条件下，吸附的DNA被洗脱下来。
实验步骤
1. 裂解组织细胞，变性蛋白，沉淀生物大分子
处死小鼠，取肝脏20-50mg，剪碎 ，加入1.5mL离心管内 组织块尽量剪碎， 否则影响裂解及消化
加入600 μL Lysis Buffer A， 振荡混匀
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相 应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动 作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
注意事项——核酸沉淀、溶解
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更
充分 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
注意事项——细胞裂解
材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯 度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： • 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
高温温浴时，定时轻柔振荡
注意事项—核酸分离纯化
3、点样： ①向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，让液面 高于胶面1mm。 ② 样品准备：吸取5 μL已提取的基因组DNA点 在点样纸上，加入1 μL 6×上样缓冲液，用移液 器轻轻混匀。
实验目的
• 熟悉真核DNA提取的方法和原理
• 掌握真核生物基因组的结构及特点
2014-5-6
核酸制备的一般原则

分离纯化核酸总的原则：
①应保证核酸一级结构的完整性；
②排除其它分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、外
源DNA、RNA等）
。

核酸纯化应达到的要求：
①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金 属离子；
察到DNA片段在凝胶上的位置（荧光条带），
也可在经凝胶成像系统中直接拍照。
琼脂糖凝胶制备及电泳
凝胶制备 倒胶
点样 电泳 紫外灯下观察
1、凝胶准备（0.8%）:用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶 。 ① 称0.8 g琼脂糖置三角瓶中，加100 mL 1×TAE ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖 ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃，加入荧光染 料 2μL，并轻轻混匀。 2、倒胶： ① 将冷却60℃的凝胶缓慢倒入制胶模具中，在胶一 端插上梳子。 ②室温下静置20 min，凝胶凝固。 ③拨出梳子，将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使 样品孔位于电场负极。
真核基因组 DNA提取
教学内容
• 真核生物基因组的结构及特点、人类基因组计划 • 真核基因组提取的实验原理、操作说明、仪器使用及注意 事项 • 基因组提取后的应用：基因组文库、PCR及southern blot • RNA提取方法简介 • 核酸（DNA和RNA）定量及定性方法的介绍
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核酸酶的抑制和抑制剂
RNase抑制
①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。
核酸制备中常用的去垢剂
用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂， 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释 放出来；
浓度的计算
•即OD260＝1时： dsDNA(双链DNA)浓度约为50 μg/mL ssDNA(单链DNA)浓度约为37μg/ml RNA浓度约为40μg/ml 寡核苷酸浓度约为30μg/ml
dsDNA 浓度（μg/μL）=OD260×稀释倍数×50 /1000 RNA 浓度（μg/μL）=OD260×稀释倍数×40 /1000
核酸提取的一般过程
4）核酸样品的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质 温度：
4℃ 最佳和最简单
-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存 保存介质： TE缓冲溶液(最常用)
10mmol/L Tris-Cl pH8.0
1mmol/L EDTA pH8.0
注意事项——材料准备
最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反 复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集
I.材料准备
破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
纯化
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
核酸制备的一般方法和原理

核酸酶的抑制和抑制剂
降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶 活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有 利，当然，几个条件并用更好。
加入400 μL Lysis Buffer B ，剧烈震荡30 s
沉淀作用，内含有醋酸， 提供低pH环境
离心5 min，将上清转入离 心柱中，静置2 min
上清可能出现少量白色漂浮物， 此为未消化完全的细胞和蛋白质
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2. DNA吸附在硅基质膜上，清洗去除盐等杂质
12,000 rpm离心1 min，弃废液 加入700 μL Wash buffer A， 12,000 rpm离心 1min，弃废液 加入700 μL Wash buffer B， 12,000 rpm离心1min，弃废液 加入500 μL Wash buffer B， 12,000 rpm离心1 min，弃废液
重新纯化DNA，去 除蛋白、多糖、多酚 等杂质
2.
对 策
2.
重新沉淀DNA，让 酒精充分挥发
增加70％乙醇洗涤 的次数（2-3次）
Fra Baidu bibliotek
3.
3.
DNA提取常见问题
问题二：DNA降解
原因
1.
1.
2.
3.
4. 5.
材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 酶的活性 提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
核酸制备时应注意的事项:
①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱） ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力（强烈震 荡、渗透压急剧改变、反复冻融）和高温 ④防止核酸的生物降解（核酸酶的预防） 。
核酸制备的步骤：