真核基因组DNA提取

真核基因组DNA的制备Seta Lam2015．09．09Part One一、双链DNA在溶液中随机卷曲，溶液粘滞；二、双链DNA在化学上稳定，但在物理上易碎；三、在EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下，用Proteinase K（蛋白酶K）消化细胞或组织，用去垢剂如SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性，通过有机溶剂抽提纯化核酸。

污染的RNA通过RNase消化清除，小分子物质通过乙醇去除。

该方法可产生数μg～数百μgDNA，制备的DNA长度小于100～150kb，可用于Southern Blot，PCR，构建基因组DNA的噬菌体文库；Part Two Protocol材料试剂1．裂解液（Lysis Buffer）；混合后室温保存：10mM Tris-HCl (PH 8.0), 100mM EDTA(PH8.0)，0.5%(w/v) SDS用前加入：20μg/ml无DNase的RNase，100μg/ml无DNase 及RNase的Proteinase K, 置于冰上; (用milliQ水补齐)Tris-HCl（1 M, pH8.0）：称量12.12 g Tris 碱，加入80 ml ddH2O 搅拌至溶解，盐酸调节pH 值后定容至100 ml，室温保存。

2．1×PBS（137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4）: 预冷;称取2.93 g 十二水磷酸氢二钠，0.2 g 磷酸二氢钾，0.2 g 氯化钾，8 g 氯化钠，加入900 ml 超纯水搅拌，调pH 值后定容至1 L，高压灭菌后4℃保存。

3．3.4%PBS: 预冷;100ml 1×PBS, 2.5g NaCl4．3M Sodium Acetate（醋酸钠，PH 6.3）；5．20mg/ml Proteinase K：用ddH2O溶解, 储于－20℃；6．10mg/ml RNase：用ddH2O溶解, 储于－20℃7．TE （PH8.0）：10mM Tris.HCl, 1mM EDTA;8．100%, 70% ethanol（用无水乙醇和超纯ddH2O配制）: 预冷;9．超纯ddH2O：双蒸水过柱；10.苯酚（PH 8.0, Tris平衡）；11.苯酚/氯仿（1:1, 用PH8.0平衡酚配）；12.氯仿设备Eppendorf 5417R离心机（4℃离心时，离心机需预冷至4℃）微型掌式离心机大容量低速离心机切去约1.5cm枪尖(出口直径约2mm) 的200ul（黄色）宽口吸嘴，高压灭菌切去约1.0cm枪尖(出口直径约3mm) 的1ml（蓝色）宽口吸嘴，高压灭菌1.5ml eppendorf管（1.5ml离心管）1ml吸嘴加热熔化制成匀浆棒注意：所有吸打混匀操作均应尽量轻柔，慢慢吸取再慢慢打出，除非最后一次打出，否则吸嘴内留少量液体以免产生气泡。

实验十六真核基因组DNA的分离纯化核酸的分离与提取是分子生物学研究中最重要的基本技术之一，核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。

核酸分离提取的原则核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。

真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子；大多生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3'端带有Poly A 结构。

95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。

RNA分子主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核中，15%在细胞器中。

分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求）；②排除蛋白质、脂类、糖类等其它分子的污染（纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如提DNA分子时，应去除RNA分子。

）为保证分离核酸的完整性及纯度，应尽量简化操作步骤，缩短操作时间，以减少各种不利因素对核酸的破坏，在实验过程中，应注意以下条件及要求：①减少化学因素对核酸的降解：避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行；②减少物理因素对核酸的降解：强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子，对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些；③防止核酸的生物降解：细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构；DNA酶需要Mg2+、Ca2+的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA酶的活性，而RNA酶，不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程的主要危害因素。

外周血DNA提取【实验原理】真核细胞DNA分子存在于细胞核中，并与核蛋白结合而稳定存在，故而可以通过提取Buffer液破坏胞膜及核膜，释放出高分子量的基因组DNA，并用蛋白酶K将核蛋白降解成小片段从核酸上分离下来，这样便初步得到了基因组DNA，然后通过苯酚、氯仿等提取进一步去除蛋白质，再用乙醇洗涤沉淀，得到的DNA分子便可以满足一般的实验要求了。

【操作步骤】1.取500μl冰冻血样，加等体积1×PBS，混匀15000r/min离心4min，弃去上液重复两次。

2.加350μl抽提Buffer，RNase1μl（10μg/ml）37℃温育30min。

3.再加prok酶（10mg/ml）10μl，55℃消化过夜，根据消化情况可补加一次prok酶。

4.加等体积（500ul）酚抽提，离心（15000r/min 5min），取上层液于另一支Eppedorf管中。

5.加酚：氯仿（1∶1）(200ul:200ul)抽提，离心（15000r/min 5min）取上层液与另一支Eppedorf管中。

6.加氯仿（等体积）(500ul)抽提，离心（15000r/min 5min）取上层与另一支Eppedorf管中。

7.加1/5V(60ul)的乙酸铵和2V(600ul)的无水乙醇（-20℃）静置10min后，离心（15000r/min5min），倒去上清夜。

8.加75%乙醇(500ul)洗DNA沉淀一次，（12000r/min 1min），倒去上清夜，将离心管倒置在滤纸上，除尽残余的乙醇，9.加灭菌水70-80μl溶解（室温1-2h，4℃过夜）。

琼脂糖凝胶电泳【实验原理】核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中（PH8.0~8.3），其碱基不解离，而磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动，采用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离目的。

各种DNA提取方法提取方法提取方法提取方法一，基因组DNA提取方法制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。

在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。

2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。

根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等试验步骤：1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。

试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/%SDS)混匀。

4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。

加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。

7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。

加入等体积的异丙醇。

室温10min。

2500rpm离心10min。

弃上清。

8、加入倍体积3mol/L乙酸钠与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。

-20℃20min。

9、12000r/min室温离心5min。

弃上清。

将DNA 溶于适量TE中。

二，外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法：试验步骤：1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm 离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80℃冻存。

小白鼠6种组织部位总DNA不同提取方法的比较DNA是生物体的基本遗传物质。

基因组DNA的提取是分子生物学的基础试验操作，其提取效率和质量的好坏直接决定了后面一系列基因工程试验的成败，如基因分离、AFLP、RAPD、SSR等。

因此•学习、掌握DNA提取方法并对其迸行比较、总结，有利于后续试验的顺利开展。

国内外研究人员已经发现并使用了许多种DNA提取方法［2-7］，并且针对不同生物体的具体特点，对许多方法逬行了改良，摸索出适用于具体物种的高效方法［8-15］。

目前，传统的SDS法和CTAB 法由于其成本低廉、提取的DNA质量相对较好，在实际应用中仍占有主要地位。

随着生物技术的普及和应用，使用试剂盒提取基因组DNA逐渐增多［16-19］。

基因组提取试剂盒具有操作简便、节省时间等独特优势，但是对于一般的实验室、特别是普通高等学校来说，由于价格较为昂贵，在很大程度上限制了其使用范围；尤其对刚接触分子生物学试验的初学者，只知道按照说明书流程操作，不了解试剂的化学成分、具体配制方法及作用，不利于理解、掌握试验的基本原理，动手能力差、试验技能得不到提高，最终出现一旦离开试剂盒，什么试验也不会做的情况。

本试验以普通试验动物小白鼠作为提取基因组DNA的材料，选取小白鼠的6个组织部位，分别是肝、脾、肾、尾、肺和心脏，采用提取基因组DNA的经典方法SDS法和CTAB法，提取小白鼠的基因组DNA，并对其质量、浓度、纯度进行检测，从中筛选出经济、简便、易于操作、质量良好的基因组DNA，这对于今后的试验教学和科研工作具有重要的指导作用。

1材料和方法1.1材料1.1.1试验材料小白鼠购自沈阳医学院实验中心。

1.1.2试剂dNTP 'DNA Marker 高保真酶均购自宝生物工程（大连）有限公司‘引物于Invitrogen北京分公司合成» CTAB和SDS法提取液配制所需药品购自Sigma，其余所用的化学试剂（氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等）均为国产分析纯试剂。